高貝貝，黃子慧，陳思琪，曹麗敏，翁嘉晨，郭丹丹，陳 悅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014)

結(jié)核病是在世界范圍內(nèi)流行的傳染病，是單一傳染源導(dǎo)致死亡的主要原因之一，僅次于新型冠狀病毒肺炎(COVID -19)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]估計(jì)，我國(guó)2020年新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)為84.2萬(wàn)，發(fā)病率為8.5%，居結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的第二位；同時(shí)，受COVID -19的影響，基本結(jié)核病服務(wù)中斷，全球因結(jié)核病死亡的患者約增加10萬(wàn)例。近年來(lái)，在COVID -19肆虐、結(jié)核分枝桿菌變異以及耐藥菌種增多等多種因素影響下，結(jié)核病發(fā)病率上升，治療難度加大，結(jié)核病的防治顯得尤為重要。

結(jié)核性潰瘍(tuberculous ulcer，TU)，又稱皮膚結(jié)核，是指結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌以及卡介苗侵犯機(jī)體局部組織，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚壞死，最終液化破潰形成的創(chuàng)面，是臨床上最常見(jiàn)的一類特異感染性疾病。臨床主要表現(xiàn)為創(chuàng)周皮色暗紅，肉芽蒼白水腫，膿液稀薄，形成竇道或慢性潰瘍[2]。雖破潰口一般較小，但深層次多有潛行空腔，遷延難愈。目前TU的病因及發(fā)病機(jī)制不清，早期診斷困難，缺乏敏感和特異性高的診斷標(biāo)志物，常與其他慢性創(chuàng)面混淆，發(fā)病周期長(zhǎng)，纏綿難愈，嚴(yán)重影響患者日常生活，給TU的防治帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)結(jié)核病的研究以肺結(jié)核為主，TU屬于肺外結(jié)核，其發(fā)病機(jī)制研究較少，以個(gè)案報(bào)道較為多見(jiàn)。因此，尋找TU病變發(fā)生的機(jī)制，找到精確的治療靶點(diǎn)，獲得良好預(yù)后，從根本上解決TU的問(wèn)題已成為當(dāng)務(wù)之急。

高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，生物信息學(xué)分析逐步成為科研領(lǐng)域中重要的研究方法。該方法在識(shí)別可靠的功能差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)及篩選疾病候選生物標(biāo)志物方面顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)。本文通過(guò)對(duì)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)及課題組前期基因測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選，應(yīng)用多種生物信息技術(shù)進(jìn)行基因分析，采用臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)與TU高度相關(guān)的特異性指標(biāo)，為TU的靶向研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 選取課題組前期基因測(cè)序的相關(guān)數(shù)據(jù)集[3]，納入3例TU組織標(biāo)本和3例TU旁正常組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理切片鑒定。研究從公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE83456，其平臺(tái)為GPL10558(Illumina HumanHT-12 V4.0 Expression BeadChip)。其中納入GSE83456數(shù)據(jù)集47例EPTB血標(biāo)本和61例健康人體對(duì)照(healthy controls，HC)的血標(biāo)本。GEO芯片樣本數(shù)據(jù)均下載以供進(jìn)一步分析。

1.2 差異基因的篩選和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)/基因本體論(GO)富集分析 用R語(yǔ)言(版本：4.1.2)對(duì)基因測(cè)序及GSE83456的數(shù)據(jù)列進(jìn)行處理。采用LIMMA軟件包比較試驗(yàn)組和正常對(duì)照組之間的差異，識(shí)別DEGs，對(duì)于具有重復(fù)基因符號(hào)的探針，使用平均值作為唯一表達(dá)值。兩組設(shè)定P值<0.05和|logfc|>1為篩選條件，篩選獲得DEGs。用維恩圖將基因測(cè)序的DEGs和GSE83456的DEGs相交，篩選與該病相關(guān)的靶基因。通過(guò)使用R語(yǔ)言中的‘clusterProfiler’包對(duì)交集基因進(jìn)行富集分析，然后使用“ggplot2”包進(jìn)行可視化。設(shè)定P值<0.05為篩選條件，分別篩選出明顯富集的GO分析，以及KEGG相關(guān)富集通路分析。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用檢索工具檢索相互作用基因(STRING)在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org；version11.5)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。PPI可以揭示疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。在此項(xiàng)研究中，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建相交基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，得分>0.4的交互作用被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cytoscape(版本：3.9.0)是一個(gè)開(kāi)源軟件平臺(tái)，用于可視化復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)并將其與任何類型的屬性數(shù)據(jù)集成。CytoHubba是一個(gè)用于發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)中樞基因的Cytoscape插件。使用CytoHubba插件中的最大相關(guān)準(zhǔn)則(MCC)對(duì)相交基因進(jìn)行MCC評(píng)分，并將評(píng)分按照從高到低的順序排列，順序越高，基因的紅色越深。

1.4 基因組富集分析(GSEA) GSEA是一種計(jì)算方法，用于確定一組先驗(yàn)定義的基因是否在兩種生物狀態(tài)(如表型)之間存在差異。使用GSEA(4.2.1)確定GBP1參與淋巴結(jié)結(jié)核病潛在的生物學(xué)機(jī)制。通過(guò)進(jìn)行1 000次基因組排列獲得標(biāo)準(zhǔn)化的富集分?jǐn)?shù)(NES)。在當(dāng)前的研究中探索特征[h.all.v7.5.1.symbols.gmt(Hallmarks)]基因組。設(shè)定P值<0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為篩選條件，以量化統(tǒng)計(jì)上的顯著富集。

1.5 臨床試驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 試驗(yàn)材料及儀器 包括TRIzolTM LS Reagent(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，DEPC水，500 mL BR 0.1%(上海源葉生物科技有限公司),PrimScript RT Master Mix(日本TaKaRa公司)，ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京Vazyme公司),引物(上海生工生物公司),高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司),IMS-25全自動(dòng)雪花制冰機(jī)(常熟雪科公司)，超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，T100梯度PCR儀(購(gòu)自美國(guó)BIORAD公司)，全自動(dòng)熒光PCR分析儀(瑞士Roche公司)。

1.5.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合TU中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；(2)潰瘍面積4～25 cm2；(3)患者未接受抗結(jié)核及免疫學(xué)治療；(4)患者一般臨床資料完整且同意參加本次研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有造血系統(tǒng)、肝、腎及心腦血管等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及繼發(fā)疾病者；(2)免疫功能受損者，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、白血病、淋巴瘤或全身性惡性疾病等；(3)正在接受免疫抑制治療的患者，如使用糖皮質(zhì)激素、烷化劑、抗代謝藥物以及放射治療等；(4)活動(dòng)性肺結(jié)核患者[4]。

1.5.3 研究對(duì)象 選擇2021年7月—2022年3月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科就診的60例TU患者為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)過(guò)病理診斷確診，其中男性23例，女性37例，年齡23～72歲，平均年齡(39.2±8.9)歲。同期選取本院健康體檢者60例作為對(duì)照組，其中男性26例，女性34例，年齡25～67歲，平均年齡(41.7±11.4)歲。受試者自愿參加此項(xiàng)研究并已簽署同意書(shū)，本研究已獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理科的批準(zhǔn)，符合世界醫(yī)學(xué)會(huì)赫爾辛基宣言。

1.5.4 血標(biāo)本采集 采集所有HC及TU患者治療前和治療2周后清晨空腹靜脈血3 mL，置于離心管中，4℃ 3 000×g，離心10 min，之后轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，保存在-80℃冰箱備用。

1.5.5 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 按照試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)血清進(jìn)行提取，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍稀釋，并使用qPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析。每個(gè)樣品設(shè)1個(gè)復(fù)孔，重復(fù)三次試驗(yàn)。qRT-PCR對(duì)所有受試者TU及HC血清中GBP1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火與延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，通過(guò)內(nèi)參基因GAPDH的Ct值對(duì)靶基因GBP1的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理，并利用GraphPad Prism(8.0.1)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析均由R語(yǔ)言(版本：4.1.2)軟件及GraphPad Prism(8.0.1)軟件進(jìn)行。t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)兩組之間的差異，P值為雙側(cè)，P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPTB中DEGs的鑒定 從TU患者組織的基因表達(dá)序列中篩選出2 490個(gè)差異基因，其中1 276個(gè)基因上調(diào)，1 214個(gè)基因下調(diào)，繪制相應(yīng)的火山圖(見(jiàn)圖1A)和熱圖(見(jiàn)圖1B)。此外，從EPTB患者血液基因表達(dá)序列中篩選出79個(gè)差異基因，其中69個(gè)基因上調(diào)，10個(gè)下調(diào),繪制相應(yīng)的火山圖(見(jiàn)圖1C)和熱圖(見(jiàn)圖1D)。設(shè)置P<0.05和|logFC|>1為選擇標(biāo)準(zhǔn)。基因測(cè)序序列與GSE83456的交叉點(diǎn)分別為：CXCL10、SLAMF8、C1QB、WARS、IDO1、ANKRD22、CARD17、LAP3、GBP1、ETV7、APOL6、GBP3、TRIM22、RTP4、OAS1、SAMD9L、P2RY14、DDX60、XAF1(見(jiàn)表2)，繪制相應(yīng)的韋恩圖(見(jiàn)圖1E)和圈圖(見(jiàn)圖1F)。

注：A為基因測(cè)序中DEGs的火山圖；B為基因測(cè)序中DEGs的熱圖；C為GSE83456中DEGs的火山圖；D為GSE83456中DEGs的熱圖；E為顯示基因測(cè)序和GSE83456中差異基因交集的韋恩圖；F為顯示交集基因在染色體上相應(yīng)位置的圈圖。

2.2 差異基因的富集分析 富集分析用于分析DEGs的生物學(xué)功能，對(duì)19個(gè)交集DEGs進(jìn)行GO和KEGG途徑富集分析(見(jiàn)圖2)。GO分析結(jié)果表明，DEGs在抗病毒免疫反應(yīng)、單核細(xì)胞趨化性調(diào)節(jié)、干擾素-β相關(guān)信號(hào)通路中顯著富集，主要集中在生物學(xué)功能(BP)上。KEGG途徑分析表明，交集GEGs在NOD樣受體信號(hào)通路、感染性疾病方面顯著富集。

表2 基因測(cè)序和GSE83456中DEGs的交集候選靶基因

注：A為GO功能富集柱形圖；B為GO功能富集圈圖；C為KEGG的通路富集分析氣泡圖。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及相應(yīng)生物標(biāo)志物的選擇 使用String Online數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)19個(gè)交叉基因進(jìn)行分析，獲得19個(gè)交叉基因的相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3A)。統(tǒng)計(jì)基因的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)并進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖3B)，將數(shù)據(jù)作為節(jié)點(diǎn)導(dǎo)出供進(jìn)一步分析。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)采用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理，并使用cytoHubba插件分析MCC的HUB基因(見(jiàn)圖3C)，其中GBP1的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)及MCC評(píng)分均處于核心地位。根據(jù)GBP1的表達(dá)量，將GSE83456的樣本分為兩組：GBP1低表達(dá)組和GBP1高表達(dá)組，然后采用GSEA對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(見(jiàn)圖3D)。再對(duì)GSE83456樣本中的EPTB組和HC組進(jìn)行GSEA分析(見(jiàn)圖3E)。GSEA結(jié)果顯示，高表達(dá)GBP1組血標(biāo)本中顯著富集的途徑與EPTB組基本一致。免疫系統(tǒng)相關(guān)途徑如白細(xì)胞介素(IL)-6/JAK/STAT3和干擾素-γ(INF-γ)反應(yīng)等與EPTB高度相關(guān)。

注：A為19個(gè)交集基因的相互作用；B為PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)；C為19個(gè)交集基因中HUB基因的相互作用，顏色越紅，MCC評(píng)分越高；D為GSE83456中GBP1高表達(dá)組和低表達(dá)組中Hallmarks基因集的GSEA；E為GSE83456中EPTB組和HC組中Hallmarks基因集的GSEA。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)血清中GBP1的mRNA表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)TU患者及HC血清中GBP1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TU患者血清內(nèi)GBP1的表達(dá)水平較HC中高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007，見(jiàn)圖4A)。治療2周后，TU患者血清內(nèi)GBP1的表達(dá)水平較治療前明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見(jiàn)圖4B)。

注：A為qRT-PCR方法檢測(cè)GBP1在TU患者及HC血清中mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B為qRT-PCR方法檢測(cè)GBP1在TU患者治療前及治療2周后血清中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 討論

目前臨床上報(bào)道的結(jié)核病以肺結(jié)核為主，TU屬于EPTB，較為少見(jiàn)。加上臨床上多藥耐受性結(jié)核分枝桿菌層出不窮，TU又常易與其他慢性創(chuàng)面混淆導(dǎo)致誤診漏診，給TU的防治帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，探索其潛在的發(fā)病機(jī)制和治療指標(biāo)是當(dāng)務(wù)之急。

本研究從TU組織基因測(cè)序及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取EPTB的原始數(shù)據(jù)著手，使用生物信息學(xué)分析分別挖掘TU組織與TU旁正常組織的差異基因，以及EPTB血液與HC血液之間的DEGs?？偣埠Y選出19個(gè)交集的DEGs，均為上調(diào)基因。對(duì)比這些DEGs在組織和血液中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)組織中的差異表達(dá)普遍較血液更為明顯。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，超過(guò)半數(shù)的EPTB患者可引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的損傷，最終導(dǎo)致TU的形成。TU形成后，結(jié)核分枝桿菌在病灶組織中聚集，通過(guò)直接蔓延的方式繼續(xù)侵犯周圍軟組織，擴(kuò)大感染范圍，而血液是結(jié)核分枝桿菌傳播的一個(gè)途徑，并在全身擴(kuò)散，推測(cè)可能是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌在血液中相較于局部組織含量較低，故因感染引發(fā)的變化不明顯。

GO分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集在抗病毒免疫反應(yīng)、單核細(xì)胞趨化性調(diào)節(jié)、干擾素-β(IFN-β)等方面。單核細(xì)胞的趨化性是指單核細(xì)胞移行至炎癥區(qū)域或其他趨化刺激物處執(zhí)行功能，趨化因子在單核細(xì)胞趨化的過(guò)程中行使調(diào)節(jié)作用[6]。在結(jié)核病中，趨化因子可趨化單核細(xì)胞向被結(jié)核分枝桿菌感染的部位聚集，參與機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)及肉芽腫的形成[7]。IFN-β屬于Ⅰ型干擾素家族，常在臨床上應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗病毒等方面[8-9]。Ⅰ型干擾素會(huì)促進(jìn)慢性細(xì)菌感染，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，IFN-β在結(jié)核分枝桿菌感染期間會(huì)抑制宿主抗菌免疫反應(yīng)并促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。

KEGG富集分析顯示，DEGs主要富集在NOD樣受體信號(hào)通路、感染性疾病等信號(hào)通路上。NOD樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)為模式識(shí)別受體，由介導(dǎo)配體蛋白的C端亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat domain，LRRs)、具有ATP酶結(jié)構(gòu)域的中心核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding domain，NBD)和結(jié)合下游分子的N端結(jié)構(gòu)域組成[12]。NOD樣受體是結(jié)核分枝桿菌激活機(jī)體促炎反應(yīng)的微生物傳感器。通過(guò)其LRR結(jié)構(gòu)域感知細(xì)菌，從而激活NF-κB和MAPK等信號(hào)通路，啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)。同時(shí)，NOD樣受體會(huì)激活巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞，將其招募到感染部位參與慢性炎癥的形成。NOD1樣受體可以促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的募集，NOD2樣受體可以調(diào)節(jié)人類巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的促炎反應(yīng)和宿主反應(yīng)[13-15]。

對(duì)交集基因進(jìn)行蛋白相互作用分析，篩選出關(guān)鍵基因GBP1。GBP1又稱鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白，是一種在INF-γ刺激下大量表達(dá)的基因，屬于GTPase家族，在巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中表達(dá)，并在炎癥組織中上調(diào)[16]。GBP1的高表達(dá)可增加結(jié)核分枝桿菌感染后細(xì)胞因子IL-1β的釋放，保護(hù)結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。GBP1為脂多糖(LPS)的傳感器，可作為一種模式識(shí)別受體與LPS直接相連，從而激活炎性小體，觸發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)[17]。同時(shí)，GBP1具有抗血管生成活性，一方面通過(guò)抑制VEGF-A的表達(dá)直接抑制血管的生成，另一方面通過(guò)誘導(dǎo)血管抑制細(xì)胞因子/趨化因子的釋放如CXCL9-11的表達(dá)間接抑制血管生成[18-19]。而血管新生與創(chuàng)面的愈合息息相關(guān)，是愈合過(guò)程中的重要機(jī)制，更是創(chuàng)面修復(fù)愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

通過(guò)GSEA富集分析對(duì)GSE83456芯片進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GBP1組血標(biāo)本中顯著富集的途徑與EPTB組基本一致。隨后，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證人體血液中GBP1的表達(dá)水平，證實(shí)GBP1在TU患者的血清中高表達(dá)并在TU患者接受治療2周后明顯下降。據(jù)此推測(cè)，TU的創(chuàng)面久不愈合，與GBP1促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、結(jié)核分枝桿菌感染及抑制機(jī)體血管的形成密不可分。抑制GBP1可能加速TU創(chuàng)面的愈合，減輕患者痛苦，提高患者的生存質(zhì)量。

綜上所述，本研究揭示GBP1在TU的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，有可能成為TU的藥物靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。但是，由于慢性創(chuàng)面久不愈合時(shí)，都有著類似的炎性過(guò)程，以GBP1能否作為區(qū)別TU與其他慢性創(chuàng)面的指標(biāo)，尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究對(duì)TU的分子生物學(xué)有了新的認(rèn)識(shí)，也為將來(lái)研究TU新的生物標(biāo)志物及作用機(jī)制提供了新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。