梅 妹， 茍雅萍， 郭 艷， 楊彥偉， 郭 婭， 李健學(xué)

(1.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院口腔科， 甘肅 蘭州 730050 2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730000)

牙周炎發(fā)病率高，主要由細(xì)菌菌斑沉積在牙齒上、口腔衛(wèi)生差、免疫反應(yīng)失衡、牙齒炎癥等因素造成牙齒脫落，屬于一種慢性炎癥性疾病[1]。目前治療牙周炎的方法主要是手術(shù)、抗生素、潔治等，雖然取得了很大的進步，但治療效果仍不盡如人意[2]。因此迫切需要找尋一種高效治療牙周炎的方法。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLSCs)具有高增殖、自我更新、多向分化的特點，據(jù)報道慢性牙周炎患者牙周組織中PDLSCs的分化潛能受損，導(dǎo)致其再生能力下降。因此克服炎癥是PDLSCs分化過程中的關(guān)鍵[3]。芍藥苷(paeoniflorin，PF)是芍藥提取物的主要成分之一，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抗炎、保護膠質(zhì)細(xì)胞、抗氧化、抗凋亡等重要作用，但PF治療牙周炎的報道甚少。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞能量狀態(tài)的主要傳感器，Wen等[4]研究發(fā)現(xiàn)PF通過激活LKB1/AMPK信號通路減輕腸道缺血再灌注受損。但PF能否通過調(diào)節(jié)LKB1/AMPK信號通路改善LPS誘導(dǎo)的PDLSCs損傷尚不清楚。本研究旨在探討PF調(diào)節(jié)LKB1/AMPK信號通路對LPS誘導(dǎo)的PDLSCs凋亡和成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源:上海鈺博生物科技有限公司提供人PDLSCs，將細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)，并置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。

1.2主要材料、儀器:DMEM培養(yǎng)基、FBS溶液(Gibco公司)；茜素紅染色(上海生工生物工程公司)；RIPA裂解緩沖液、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(碧云天生物有限公司)；二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA)測定試劑盒(ProteinTech Group)；TRIzol試劑(Invitrogen公司)；PrimeScript RT試劑盒(Takara Bio)；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 ELISA試劑盒測定(武漢博斯特生物科技有限公司)；LPS、PF、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK及天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)一抗(Abcam公司)。流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)；Varioskan LUX多模式酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)。

1.3細(xì)胞分組及處理:收集對數(shù)生長期的PDLSCs，設(shè)置分組為對照組、LPS組、LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組、LPS+PF-H+LKB1抑制劑(radicicol)組。其中對照組不做任何處理；LPS組10μg/mL LPS處理細(xì)胞；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組在LPS組基礎(chǔ)上以5μmoL/L PF、10μmoL/L PF、20μmoL/L PF處理細(xì)胞；LPS+PF-H+radicicol組在LPS+PF-H組基礎(chǔ)上經(jīng)10μmoL/L radicicol處理細(xì)胞。培養(yǎng)基每3天更新一次，細(xì)胞培養(yǎng)21d后檢測各指標(biāo)。

1.4ELISA檢驗細(xì)胞中炎癥因子水平:各組PDLSCs經(jīng)胰蛋白酶裂解，并在4℃下以16000 × g離心15min，收獲上清液。按照ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將各組PDLSCs在室溫下以700 × g 離心5min，然后輕輕重懸于500μL Annexin V-FITC溶液中，室溫避光孵育10min后，隨后向細(xì)胞中加入10μL PI染色液并在冰浴中避光孵育30min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.6茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié):將細(xì)胞以1×105個細(xì)胞的密度接種到24孔板中。處理的細(xì)胞在室溫下用4%甲醇固定15min，并在37℃下用茜素紅染色30min。隨機選五個視野在倒置光學(xué)顯微鏡下評估PDLSCs的礦化能力。

1.7ALP試劑盒檢測細(xì)胞成骨分化:洗滌各組PDLSCs，加入50μL分析緩沖液，然后在4℃下以11900 × g離心3min。隨后將50μL PNPP反應(yīng)溶液添加到每個孔中，并在60℃下避光反應(yīng)60min。最后加入20μL終止液終止反應(yīng)，在450 nm處測定吸光度值評估ALP活性。

1.8qRT-PCR檢測OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平:使用TRIzol試劑從各組PDLSCs中提取總RNA，PrimeScript RT試劑盒將2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，mRNA表達定量通過RT-qPCR試劑盒進行Real Time PCR反應(yīng)，mRNA表達以β-actin為參照。使用2-△△CT計算OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9western blot檢測LKB1/AMPK通路及caspase-1蛋白表達水平:RIPA裂解緩沖液在4℃裂解PDLSCs，BCA試劑盒測蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上、封閉2h，4℃下將膜與p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK、caspase-1、β-actin一抗孵育過夜，之后加入二抗，可視化蛋白條帶并拍照，Image分析蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1PF對各組細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的影響:LPS組茜素紅染色程度較對照組減輕，礦化結(jié)節(jié)減少；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組茜素紅染色程度較LPS組逐漸恢復(fù)，礦化結(jié)節(jié)逐漸增多；LPS+PF-H+radicicol組茜素紅染色程度較LPS+PF-H組加深，礦化結(jié)節(jié)減少。見圖1。

圖1 各組PDLSCs的茜素紅染色圖(×100)

2.2PF對各組細(xì)胞中凋亡率的影響:LPS組較對照組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05)；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組較LPS組細(xì)胞凋亡率顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)；LPS+PF-H+radicicol組較LPS+PF-H組細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.05)，見圖2 ，表2。

圖2 各組PDLSCs凋亡變化

表2 各組PDLSCs凋亡比較

2.3PF對各組細(xì)胞中ALP活性的影響:LPS組較對照組ALP活性均顯著降低(P<0.05)；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組較LPS組ALP活性顯著升高，呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol組ALP活性較LPS+PF-H組顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞中ALP活性比較

2.4PF對各組細(xì)胞中炎癥因子水平的影響:TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較：LPS組較對照組、LPS+PF-H+radicicol組較LPS+PF-H組顯著升高(P<0.05)；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組較LPS組顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

2.5PF對各組細(xì)胞中OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平的影響:LPS組OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平較對照組顯著降低(P<0.05)；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組較LPS組OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平顯著升高，呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol組OPN、RUNX2、OCN mRNA表達水平較LPS+PF-H組顯著下降(P<0.05)，見表5。

表5 各組細(xì)胞OPN RUNX2 OCN mRNA表達水平比較

2.6PF對各組細(xì)胞LKB1/AMPK通路及caspase-1表達水平的影響:LPS組p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK較對照組顯著降低，而caspase-1表達增加(P<0.05)；LPS+PF-L組、LPS+PF-M組、LPS+PF-H組較LPS組p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK水平顯著升高，而caspase-1表達下降，呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)，LPS+PF-H+radicicol組p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK水平較LPS+PF-H組顯著下降，caspase-1表達增加(P<0.05)，見圖3、表6。

表6 各組細(xì)胞中p-LKB1/LKB1 p-AMPK/AMPK caspase-1表達的比較

圖3 各組細(xì)胞中p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、caspase-1表達(Western blot圖)注：A為對照組；B為LPS組；C為LPS+PF-L組；D為LPS+PF-M組；E為LPS+PF-H組；F為LPS+PF-H+radicicol組

3 討 論

牙周炎可使成人牙齒脫落，與多種全身性疾病密切相關(guān),據(jù)報道PDLSCs是一類口腔成體干細(xì)胞，具有非定向分化潛能，與牙周組織的再生修復(fù)密切相關(guān)[5]。因此探索PDLSCs成骨分化機制對于更好地治療牙周炎意義重大。本研究以LPS誘導(dǎo)PDLSCs構(gòu)建牙周炎細(xì)胞模型 ，進一步探索新的治療方法。

PF是從傳統(tǒng)中草藥芍藥中提取得到，具有神經(jīng)保護、抗高血糖、保肝、抗腫瘤等特性，尤其是抗炎方面療效顯著。在LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷中[6]，PF可以降低炎癥細(xì)胞因子的釋放，阻止細(xì)胞凋亡，改善心肌受損，可作為心肌缺血并發(fā)癥的潛在藥物。特別是在實驗性牙周炎大鼠模型中，PF可增加牙槽骨面積，減少牙槽骨吸收、附著，但具體機制尚不清楚[7]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)PF-L、PF-M、PF-H處理LPS誘導(dǎo)的PDLSCs后，炎癥因子水平逐漸減少，細(xì)胞凋亡率降低，caspase-1表達被抑制。提示PF可抑制LPS誘導(dǎo)PDLSCs的細(xì)胞凋亡，減輕其炎性反應(yīng)。

RUNX2在成骨過程中是不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，也是成骨分化的關(guān)鍵所在，參與調(diào)節(jié)成骨分化相關(guān)標(biāo)記物有ALP、OPN、OCN等[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)PDLSCs中礦化結(jié)節(jié)減少，ALP水平及OPN、RUNX2、OCN表達降低，表明LPS誘導(dǎo)后，PDLSCs成骨分化被抑制。經(jīng)PF-L、PF-M、PF-H處理后，礦化結(jié)節(jié)顯著增加，ALP水平及OPN、RUNX2、OCN表達上調(diào)，表明PF在一定程度上可以促進LPS誘導(dǎo)PDLSCs的成骨分化。另外，LKB1是一種普遍表達且進化保守的絲氨酸蘇氨酸激酶，可正向調(diào)節(jié)AMPK表達。Zheng等[9]研究發(fā)現(xiàn)激活LKB1/AMPK通路可抑制缺血再灌注大鼠中炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。除此之外，實驗結(jié)果顯示二甲雙胍可通過激活LKB1/AMPK信號，降低促炎細(xì)胞因子水平，促進成骨細(xì)胞分化，增強牙周和骨組織再生[10]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)PDLSCs中，LKB1與AMPK磷酸化水平顯著降低，提示抑制LKB1/AMPK通路可能參與LPS誘導(dǎo)PDLSCs的成骨分化及凋亡。經(jīng)PF-L、PF-M、PF-H處理后，LKB1與AMPK磷酸化水平上調(diào)，細(xì)胞凋亡降低，成骨分化能力增強，推測PF可能通過激活LKB1/AMPK通路實現(xiàn)上述指標(biāo)轉(zhuǎn)變。為驗證上述推測，以LKB1抑制劑-radicicol進行回復(fù)驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)radicicol逆轉(zhuǎn)了PF-H對LPS誘導(dǎo)的PDLSCs凋亡和成骨分化的作用，表明PF通過上調(diào)LKB1-AMPK信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的PDLSCs凋亡，促進其成骨分化。綜上所述，PF可以促進LPS誘導(dǎo)的PDLSCs成骨分化，抑制其凋亡，可能與LKB1-AMPK信號通路活化有關(guān)，為牙周炎治療提供新方案。