史曉晶， 周金闊， 張晉弘， 邸永賓

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院， 河北 石家莊 050000)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是全球最常見的頜面部惡性腫瘤，具有易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲性較高等特點，每年的死亡病例超過14萬，五年生存率小于50%，因此需要研發(fā)新的分子靶點及治療標志物[1]。在腫瘤發(fā)生過程中，長鏈非編碼RNA(LncRNA)作為一種競爭性RNA(ceRNA)與miRNA競爭性結(jié)合，從而相互調(diào)控影響下游mRNA的表達。生物信息學預測miR-27b-3p分別與LncRNA人類白細胞抗原復合物P5(HCP5)、蛋白家族成員Z(H2AFZ)存在結(jié)合位點，且研究表明LncRNA HCP5是一種新型LncRNA，可促進多種癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性，但在OSCC中研究甚少[2]。miR-27b-3p是miR-27家族中成熟的miRNA。據(jù)報道m(xù)iR-27b-3p在結(jié)直腸腫瘤、宮頸癌和胃癌等癌癥中表達異常，使其成為腫瘤治療的潛在靶點，但其在OSCC中鮮有報道[3]。H2AFZ表達異常與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討LncRNA HCP5通過調(diào)節(jié)miR-27b-3p/H2AFZ軸對OSCC細胞增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細胞來源:選取于2021年2月至2022年2月在本院行手術(shù)治療的48例OSCC患者，患者術(shù)前均未接受任何放療或化療等治療并簽署書面知情同意書，之后通過手術(shù)切除OSCC組織、相鄰正常組織，并立即在液氮中冷凍，儲存于-80℃冰箱中用于后續(xù)檢測。本研究獲得倫理委員會批準。中國科學院細胞庫提供OSCC細胞系(Tca-811、SCC-9、SCC-25、HN4)及人正?？谇唤琴|(zhì)形成細胞(hNOK)。

1.2主要材料、儀器:MTT試劑、二甲基亞砜溶液(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；RIPA裂解緩沖液(碧云天生物科技有限公司)；PVDF膜(GE Healthcare公司)；ECL試劑盒(安瑪西亞有限公司)；Trizol試劑盒(天根生化科技有限公司)；干擾HCP5(si HCP5)及陰性對照(si NC)、miR-27b-3p抑制物(miR-27b-3p inhibitor)及抑制物陰性對照(inhibitor NC)、miR-27b-3p模擬物(miR-27b-3p mimics)及抑制物陰性對照(mimics NC)(上海吉瑪制藥有限公司)；細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、H2AFZ一抗(Abcam公司)。酶標儀(Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(上海精密儀器儀表公司)。

1.3qRT-PCR檢測組織及細胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表達水平:利用Trizol試劑盒從OSCC組織、相鄰正常組織及OSCC細胞系(Tca-811、SCC-9、SCC-25、HN4)及人正?？谇唤琴|(zhì)形成細胞(hNOK)中提取總RNA；分光光度計測定總RNA的濃度和純度。通過GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，然后進行qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。所用引物為：LncRNA HCP5上游引物：5′-TGAGAGCAGGACAGGAAAA-3′，下游引物：5′-CCAACCAGACCCTAAGTGA-3′；H2AFZ上游引物：5′-GTGGACTGTATCTCTGTGAA-3′，下游引物：5′-GGTTGGTTGGAAGGCTAA-3′；miR-27b-3p上游引物：5′-AGTGGCTAAGTTCTGCCTCAAC-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′；β-actin上游引物：5′-AGGGAGAACCGTGAGAAG-3′，下游引物：5′-CTGGTCCGACAGGTAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。內(nèi)參分別是U6、β-actin，2-ΔΔCt計算LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表達水平。

1.4細胞分組及處理:取對數(shù)生長期Tca-811細胞，分為對照組、si NC組、si HCP5組、si HCP5+inhibitor NC組、si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組。其中si NC組、si HCP5組分別將si NC、si HCP5轉(zhuǎn)染Tca-811細胞；si HCP5+inhibitor NC組、si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組分別將si HCP5與inhibitor NC、si HCP5與miR-27b-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染Tca-811細胞，48h后收集各組細胞用于結(jié)果分析。

1.5MTT法檢測細胞光密度(OD)值:將細胞接種在96孔板(3×103個細胞/孔)中并孵育0h、24h、48h。然后向每個孔中加入20μL MTT溶液，孵育4h后，棄去上清液。然后加入150μL DMSO，最后在酶標儀上于570nm處檢測每個孔OD值。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:將細胞接種到6孔板上(1×105個細胞/孔)，并用195μL緩沖液重新懸浮。然后在管中加入5μL Annexin V-FITC溶液并孵育15min。離心后將細胞重新在緩沖液中懸浮，并用10μL PI染色。最后用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡。

1.7Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲:侵襲實驗測定：將上室預先涂上Matrigel基質(zhì)膠，然后各組Tca-811細胞(1×105細胞/孔)于無FBS的DMEM培養(yǎng)基中重懸并接種到上室，下室加入含有FBS的DMEM培養(yǎng)基。24h后輕輕刮除細胞，將0.4%結(jié)晶紫染色。最后隨機選取五個視野在倒置顯微鏡下計數(shù)。遷移實驗測定：上室無需預涂Matrigel基質(zhì)膠，其余操作同上。

1.8qRT-PCR檢測Tca-811細胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表達水平同上述1.3的操作。

1.9驗證miR-27b-3p與LncRNA HCP5、H2AFZ的靶向關(guān)系:首先構(gòu)建HCP5、H2AFZ的野生型(WT)、突變體(MUT)載體。利用Lipofectamine 2000試劑盒將HCP5-WT、HCP5-MUT以及H2AFZ-WT、H2AFZ-MUT與miR-27b-3p mimics或mimics NC共轉(zhuǎn)染到Tca-811細胞中。轉(zhuǎn)染48h后，裂解細胞，檢測相對熒光素酶活性。

1.10Western blot檢測CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表達水平:收集細胞并用RIPA裂解緩沖液裂解，取50μg蛋白質(zhì)樣品通過12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1h后，將膜與特異性一抗在4℃下孵育過夜。然后將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2h。洗滌后，使用ECL試劑盒對條帶進行可視化，并使用β-actin作為對照，ImageJ軟件分析蛋白表達水平，其中一抗分別為CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ。

2 結(jié) 果

2.1OSCC組織、相鄰正常組織、OSCC細胞系及hNOK細胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表達:OSCC組織中LncRNA HCP5、H2AFZ表達水平較正常組織升高，miR-27b-3p表達降低(P<0.05)，見表1。與hNOK細胞相比，OSCC細胞系LncRNA HCP5、H2AFZ表達水平升高，miR-27b-3p表達降低(P<0.05)，選擇差異最顯著的Tca-811細胞進行后續(xù)研究。見表2。

表1 LncRNA HCP5 miR-27b-3p H2AFZ mRNA表達水平

表2 細胞中LncRNA DLEU2 miR-27b-3p PAK4 mRNA的表達水平

2.2各組Tca-811細胞OD變化:細胞24h、48h OD570值比較：si HCP5組較對照組、si NC組降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組升高(P<0.05)，見表3。

表3 細胞OD570值的比較

2.3各組Tca-811細胞中LncRNA HCP5、miR-27b-3p、H2AFZ mRNA表達:LncRNA HCP5、H2AFZ表達水平比較：si HCP5組較對照組、si NC組降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組升高(P<0.05)。miR-27b-3p表達比較：si HCP5組較對照組、si NC組升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組降低(P<0.05)，見表4。

表4 Tca-811細胞中LncRNA HCP5 miR-27b-3p H2AFZ mRNA表達

2.4各組Tca-811細胞凋亡變化:細胞凋亡率的比較：si HCP5組較對照組、si NC組升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組降低(P<0.05)，見圖1、表5。

圖1 細胞凋亡變化

表5 細胞凋亡變化的影響

2.5各組Tca-811細胞侵襲、遷移變化:細胞侵襲、遷移數(shù)的比較：si HCP5組較對照組、si NC組減少(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組增多(P<0.05)，見圖2、3、表6。

表6 細胞侵襲遷移數(shù)變化

圖2 細胞侵襲變化

圖3 細胞遷移變化

2.6驗證miR-27b-3p與LncRNA HCP5、H2AFZ的靶向關(guān)系:Starbase數(shù)據(jù)庫顯示miR-27b-3p與LncRNA HCP5、H2AFZ存在堿基配對，如圖4、5。熒光素酶活性比較，miR-27b-3p mimics+HCP5-WT組較mimics NC+HCP5-WT組降低(P<0.05)，見表7；miR-27b-3p mimics+H2AFZ-WT組較mimics NC+H2AFZ-WT組降低(P<0.05)，見表8。

圖4 miR-27b-3p與HCP5的結(jié)合位點

表7 miR-27b-3p與HCP5的靶向關(guān)系驗證

圖5 miR-27b-3p與H2AFZ的結(jié)合位點

表8 miR-27b-3p與H2AFZ的靶向關(guān)系驗證

2.7各組細胞中CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表達水平:CyclinD1、MMP-2、H2AFZ蛋白表達比較：si HCP5組較對照組、si NC組降低(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組升高(P<0.05)。cleaved caspase-3蛋白表達比較：si HCP5組較對照組、si NC組升高(P<0.05)；si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組較si HCP5+inhibitor NC組降低(P<0.05)，見圖6、表9。

圖6 CyclinD1、cleaved caspase-3、MMP-2、H2AFZ蛋白表達(Western blot圖)注：A為對照組；B為si NC組；C為si HCP5組；D為si HCP5+inhibitor NC組；E為si HCP5+miR-27b-3p inhibitor組

表9 各組細胞中CyclinD1 cleaved caspase-3 MMP-2 H2AFZ蛋白表達

3 討 論

OSCC由于其發(fā)病隱匿，加上病情進展迅速，患者被發(fā)現(xiàn)時多數(shù)無法進行有效治療，隨著OSCC機制研究和治療方法等進步，近幾十年來患者治愈率雖有所提高，但患者的五年生存率仍然沒有顯著改變[4]，因此研究無創(chuàng)性診療手段或分子靶標對OSCC的預防、早期診斷和治療意義重大。

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的新型RNA，不參與編碼蛋白質(zhì)，但研究表明lncRNA在包括OSCC在內(nèi)的多種人類癌癥中具有影響細胞生物學行為、免疫反應(yīng)和細胞轉(zhuǎn)化等調(diào)節(jié)功能[5]。HCP5作為新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，被證明與多種疾病有關(guān)，尤其是癌癥中[6]。如HCP5的上調(diào)可以促進人膀胱癌中的細胞侵襲和遷移。但HCP5在OSCC進展中的作用和分子機制仍不清楚，需要進一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織和細胞系中LncRNA HCP5表達上調(diào)，與Zhao等[7]研究結(jié)果相吻合，推測可能參與OSCC的發(fā)生。干擾HCP5表達可顯著阻止Tca-811細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導其凋亡，提示LncRNA HCP5可能成為治療OSCC的潛在靶點。

miRNA是另一種類型的非編碼RNA，通過與靶基因的3'-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。研究報道m(xù)iRNA和lncRNA可形成lncRNA-miRNA-mRNA軸，參與腫瘤的生長和發(fā)展。本研究經(jīng)雙熒光素酶實驗驗證LncRNA HCP5與miR-27b-3p存在靶向結(jié)合位點。在胃癌研究中，miR-27b-3p被證明為腫瘤抑制因子，上調(diào)miR-27b-3p阻礙了胃癌細胞的惡性行為發(fā)展[8]。另外，羅哌卡因可以增強miR-27b-3p的表達，而過表達miR-27b-3p可抑制乳腺癌的惡性進展[9]。本研究中miR-27b-3p在OSCC組織和細胞系中表達下調(diào)，與Ma等[10]研究結(jié)果吻合。干擾HCP5可通過上調(diào)miR-27b-3p表達改善Tca-811細胞的惡性腫瘤行為，通過miR-27b-3p inhibitor回復性實驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-27b-3p逆轉(zhuǎn)了干擾HCP5對Tca-811細胞惡性行為的抑制作用。除此之外，Starbase數(shù)據(jù)庫及雙熒光素酶實驗驗證H2AFZ為miR-27b-3p的直接靶標，且與多種腫瘤如膀胱癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等發(fā)展有關(guān)。本研究中H2AFZ在OSCC組織和細胞系中表達上調(diào)，與Feng等[11]研究結(jié)果一致。干擾HCP5可抑制H2AFZ表達改善癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導其凋亡，下調(diào)miR-27b-3p可提高H2AFZ表達，加速Tca-811細胞惡性發(fā)展，表明干擾HCP5可通過上調(diào)miR-27b-3p進而抑制H2AFZ表達，阻止Tca-811細胞惡性發(fā)展。

綜上所述，干擾HCP5可以抑制Tca-811細胞增殖、遷移和侵襲，誘導其凋亡，可能與上調(diào)miR-27b-3p/H2AFZ軸有關(guān)，為OSCC治療提供新靶點。