Hero Nmeri Godspower, 喬郅鈉，徐美娟，饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是生物體中主要的甲基供體。除了甲基供體外，還參與轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫基反應(yīng)。SAM具有重要的藥學(xué)意義，已被用于治療多種疾病，包括阿爾茨海默病、肝臟疾病、骨關(guān)節(jié)炎和抑郁癥[1-4]，市場(chǎng)需求量巨大。SAM合成方法有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法合成的SAM收率低，且大多數(shù)包含有非活性異構(gòu)體，反應(yīng)條件苛刻后期難以分離純化，因此難以獲得大規(guī)模的應(yīng)用[5-6]。發(fā)酵法是目前SAM工業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑，該方法簡(jiǎn)單、易于控制、擴(kuò)大培養(yǎng)和安全無(wú)污染，但是最大的缺點(diǎn)是L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化率低、SAM產(chǎn)量較低[7]。酶促轉(zhuǎn)化法是底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下直接生成SAM，反應(yīng)過(guò)程需要K+和Mg2+參與，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是所生成的產(chǎn)物大多數(shù)是具有生物活性的(S,S)-SAM，因此成為近年來(lái)工業(yè)生產(chǎn)SAM的研究熱點(diǎn)。

SAM合酶是酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM的關(guān)鍵酶，已從多種生物中分離出來(lái)并進(jìn)行表征，包括大腸桿菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、大鼠[10]、人[11]、詹氏甲烷球菌[12]、極端嗜熱古生菌[13]、釀酒酵母[14]等。釀酒酵母是公認(rèn)的SAM產(chǎn)量最高的微生物，由兩種同工酶(SAM合酶1和SAM合酶2)催化合成，這兩種同工酶氨基酸同源性達(dá)到92%，SAM合酶1存在底物抑制，SAM合酶2不存在底物抑制現(xiàn)象，且酶活力要高于SAM合酶1[15-16]。大腸桿菌來(lái)源的SAM合酶存在高產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，SAM可與SAM合酶形成惰性的酶復(fù)合物，從而影響底物ATP與L-甲硫氨酸之間的相互作用[17]。

目前，工業(yè)上常用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)SAM[18]。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中L-甲硫氨酸含量很高時(shí)，酵母對(duì)L-甲硫氨酸的吸收會(huì)受到限制[19]，SAM產(chǎn)量通常低于15 g/L。為解決生產(chǎn)中的限制因素需要制定策略，以提高SAM的可持續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)诖竽c桿菌中異源表達(dá)了蠟狀芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌來(lái)源的SAM合酶，針對(duì)SAM合成菌株全細(xì)胞催化合成體系條件進(jìn)行了優(yōu)化。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)甲苯磺酸鈉的添加可改善SAM合酶的產(chǎn)物抑制[20-22]，因此，為了改善SAM合酶在產(chǎn)物積累過(guò)程中的反饋抑制，在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中添加了對(duì)甲苯磺酸鈉，改善了SAM對(duì)SAM合酶的反饋抑制，進(jìn)一步提高了SAM含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中所用到的質(zhì)粒pETDuet1、菌株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和NotⅠ限制性快切酶、10 000 bp核酸Marker和蛋白Marker，大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；SAM標(biāo)準(zhǔn)品、ATP，Sigma公司，L-甲硫氨酸及培養(yǎng)基原料等，國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化鈉，固體培養(yǎng)基按1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))添加瓊脂粉，根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度抗生素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK的構(gòu)建

本研究所用引物如表1所示。分別以蠟狀芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌基因組為模板，以pETDuet1-BcmetK-F/R和pETDuet1-CgmetK-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后得到的BcmetK和CgmetK基因片段分別與經(jīng)BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ/NotⅠ雙酶切線性化的pETDuet1質(zhì)粒進(jìn)行同源重組連接，連接產(chǎn)物分別化轉(zhuǎn)至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃搖床培養(yǎng)2 h后，涂布至含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)8～12 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的重組菌株命名為E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this research

1.2.2 SAM合酶的表達(dá)及純化

將凍管保存的E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK重組菌株分別在含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后，按10%接種量轉(zhuǎn)接50 mL含相同濃度的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)2 h后，添加異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)(終濃度為0.5 mmol/L)，然后于25 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h，以誘導(dǎo)SAM合酶的表達(dá)。對(duì)照菌株E.coliBL21/pETDuet1按照相同方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

之后，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞菌體用5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)洗2次。最后，將細(xì)胞菌體懸浮于5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)中并用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，破碎液在4 ℃下離心20 min，收集上清液，用于后續(xù)的SDS-PAGE分析和SAM合酶的純化。粗酶液上清用0.2 μm濾膜過(guò)濾處理后，經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后收集SAM合酶純酶，測(cè)定酶活力水平。

1.2.3 SAM合酶的酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定體系[23]：10 mmol/L ATP、10 mmol/LL-甲硫氨酸、50 mmol/L K2SO4、20 mmol/L MgSO4、100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.0，37 ℃下預(yù)熱5 min后分別加入5 μL BcMAT(蠟狀芽孢桿菌來(lái)源的SAM合酶)和CgMAT(谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶)純酶來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)，30 min后，測(cè)量從ATP釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽濃度。反應(yīng)體系中加入100 μL的孔雀綠鉬酸鹽溶液，孵育5 min后測(cè)量620 nm處的吸光值。以不添加SAM合酶的純酶體系作為陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 全細(xì)胞生物催化劑的制備

首先，將凍管保存的E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK重組菌株分別在含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接10 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)8～12 h后，按10%接種量轉(zhuǎn)接100 mL含相同濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)2 h后，添加IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，25 ℃、200 r/min下培養(yǎng)18 h，以誘導(dǎo)SAM合酶表達(dá)。之后，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)洗滌菌體2次，即獲得全細(xì)胞生物催化劑。

1.2.5 全細(xì)胞催化條件優(yōu)化

為了優(yōu)化全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成SAM的條件，將離心收集的過(guò)表達(dá)SAM合酶的細(xì)胞菌體用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)洗滌菌體2次后并懸浮。為了研究全細(xì)胞生物催化的最佳溫度，將反應(yīng)體系分別在25、30、35、40、45、50 ℃、180 r/min的旋轉(zhuǎn)振蕩器中運(yùn)行。對(duì)于pH的優(yōu)化，反應(yīng)體系在初始pH為5.0～9.0(pH間隔1.0)下反應(yīng)。為了確定生物催化劑的最佳濃度，反應(yīng)體系分別使用0.2%～1.6%(體積分?jǐn)?shù)，間隔0.2%)的OD600值約9.0的重組菌株全細(xì)胞菌體懸浮液作為生物催化劑進(jìn)行催化合成SAM。最后，測(cè)試了不同濃度10～60 mmol/L的底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP對(duì)全細(xì)胞催化合成SAM的影響，以確定最優(yōu)底物濃度。

1.2.6 反饋抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)體系：50 mmol/LL-甲硫氨酸、適當(dāng)濃度ATP(BcMAT：50 mmol/L、CgMAT：40 mmol/L)、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4、200～1 000 mmol/L對(duì)甲苯磺酸鈉(sodiump-toluenesulfonate,pTSoNa)、適當(dāng)菌體濃度(BcMAT：1.2%(體積分?jǐn)?shù))的OD600值為9.0的細(xì)胞懸浮液、CgMAT：0.8%(體積分?jǐn)?shù))的OD600值為9.0的細(xì)胞懸浮液)。對(duì)照組則不添加對(duì)甲苯磺酸鈉，其他均一致。45 ℃、各自最適pH值(BcMAT：8.0，CgMAT：8.5)下反應(yīng)5 h后加入6%(體積分?jǐn)?shù))的高氯酸溶液終止反應(yīng)。最后，12 000 r/min離心10 min，上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)SAM含量。

1.2.7 序列比對(duì)分析

將從Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到的BcMAT(登錄號(hào)：Q816Q8)和CgMAT(登錄號(hào)：Q9K5E4)蛋白序列使用NCBI的COBALT工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.8S-腺苷甲硫氨酸的HPLC檢測(cè)分析

采用C18 column (Hypersil BDS column, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L甲酸銨溶液(pH 3.0)，流速為0.8 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm下檢測(cè)S-腺苷甲硫氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源SAM合酶編碼基因metK的克隆及重組菌株的構(gòu)建

以蠟狀芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌基因組為模板，以pETDuet1-BcmetK-F/R和pETDuet1-CgmetK-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得BcmetK和CgmetK基因片段，基因大小分別為1 200 bp和1 224 bp。

膠回收純化的BcmetK和CgmetK基因片段分別與經(jīng)BamH Ⅰ/EcoRⅠ和Hind Ⅲ/NotⅠ雙酶切線性化的pETDuet1質(zhì)粒進(jìn)行同源重組連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的重組菌株命名為E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK。

2.2 不同來(lái)源SAM合酶的表達(dá)、純化及酶活力測(cè)定

按1.2.2所述方法對(duì)蠟狀芽胞桿菌和谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK上清液分別在43.0、44.1 kDa附近有條帶加粗，即BcMAT和CgMAT成功實(shí)現(xiàn)了在E.coliBL21中的異源表達(dá)(圖1-A)。

重組菌株E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK上清液的蛋白純化結(jié)果如圖1-B所示，酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，CgMAT的酶活力為2.05 U/mL，是BcMAT酶活力的1.3倍(1.53 U/mL)。

M-蛋白Marker A-異源表達(dá)結(jié)果(1-E.coli BL21/pETDuet1對(duì)照菌株細(xì)胞 破碎上清液;2-E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK重組菌株細(xì)胞 破碎上清液;3-E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK重組菌株細(xì)胞 破碎上清液)；B-蛋白純化結(jié)果(1-BcMAT純酶;2-CgMAT純酶)圖1 不同來(lái)源SAM合酶的表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purification of SAM synthase from different sources

2.3 全細(xì)胞催化條件的優(yōu)化

全細(xì)胞生物催化法應(yīng)用于合成目標(biāo)產(chǎn)物在合成生物學(xué)中已普及，其存在副反應(yīng)最小化、產(chǎn)物更容易分離和更少環(huán)境問(wèn)題的優(yōu)點(diǎn)[24]。全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化生成目標(biāo)產(chǎn)物過(guò)程中關(guān)鍵酶活性和反應(yīng)效率通常受反應(yīng)條件的影響。溫度、pH、底物濃度和菌體濃度等因素會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物合成。因此，為獲得SAM的最佳產(chǎn)量，該研究針對(duì)全細(xì)胞催化生物轉(zhuǎn)化合成SAM的溫度、pH、底物濃度及菌體濃度進(jìn)行了優(yōu)化研究。

2.3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

在工業(yè)中，溫度非常重要，它會(huì)影響酶的穩(wěn)定性、活性和最終的生產(chǎn)力，因此，為了確定最佳反應(yīng)溫度，20 mL反應(yīng)體系由50 mmol/LL-甲硫氨酸、40 mmol/L ATP、50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4組成。將100 μL生物催化劑(OD600值約9.0)分別加入到反應(yīng)體系中開(kāi)始反應(yīng)，反應(yīng)體系在不同溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)下反應(yīng)5 h。如圖2所示，在25～45 ℃，SAM的含量隨著溫度升高而升高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，SAM的含量最高，重組菌株E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK可轉(zhuǎn)化合成205 mg/L的SAM，E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK可轉(zhuǎn)化合成189 mg/L的SAM。而溫度高于45 ℃時(shí)，SAM的含量則逐漸下降。也就是說(shuō)，E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK和E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK重組菌株的最適轉(zhuǎn)化溫度均為45 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響Fig.2 The effect of reaction temperature on the catalytic reaction of whole cells

2.3.2 反應(yīng)pH的優(yōu)化

為了確定SAM合成的最佳pH值，20 mL反應(yīng)體系由50 mmol/LL-甲硫氨酸、40 mmol/L ATP、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4組成，100 μL生物催化劑(OD600值約9.0)分別加入到反應(yīng)體系中開(kāi)始反應(yīng)。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的pH值控制在5.0～9.0，45 ℃下反應(yīng)5 h。結(jié)果如圖3所示，BcMAT和CgMAT均在pH 6.0～9.0檢測(cè)到顯著的酶活性。E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK重組菌株的最佳轉(zhuǎn)化pH值為8.0，此時(shí)SAM含量為232 mg/L；E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK的最佳轉(zhuǎn)化pH值為8.5，此時(shí)SAM含量為254 mg/L。

2.3.3 底物濃度的優(yōu)化

底物濃度通常被視為提高全細(xì)胞生物催化效率需進(jìn)行考慮調(diào)整的重要參數(shù)。底物的高初始濃度通常會(huì)抑制催化進(jìn)行。為了確定重組SAM合酶進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP的最佳濃度，將底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP分別設(shè)為10～60 mmol/L，轉(zhuǎn)化溫度和pH均使用前面優(yōu)化得到的最佳值(圖4)。

圖3 反應(yīng)pH對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響Fig.3 The effect of reaction pH on whole-cell catalytic reaction

A-底物ATP濃度對(duì)全細(xì)胞催化的影響； B-底物L(fēng)-甲硫氨酸濃度對(duì)全細(xì)胞催化的影響圖4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響Fig.4 The effect of the concentration of the substrate on the catalytic reaction of whole cells

底物ATP濃度優(yōu)化時(shí)，控制底物L(fēng)-甲硫氨酸濃度為50 mmol/L，測(cè)定不同底物ATP濃度(10～60 mmol/L)下的SAM含量，以確定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中ATP的最佳濃度。結(jié)果顯示，E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK重組菌株全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的最適ATP濃度為50 mmol/L，此時(shí)SAM含量為240 mg/L；E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK重組菌株全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的最適ATP濃度為40 mmol/L，此時(shí)SAM含量為256 mg/L。

底物L(fēng)-甲硫氨酸濃度的優(yōu)化則是在上面優(yōu)化的得到的最適ATP濃度下，測(cè)定不同濃度底物L(fēng)-甲硫氨酸濃度(10～60 mmol/L)下SAM的含量，以確定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中L-甲硫氨酸的最佳濃度。結(jié)果顯示，E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK重組菌株全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的最適L-甲硫氨酸濃度為50 mmol/L，此時(shí)SAM含量為245 mg/L；E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK重組菌株全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的最適L-甲硫氨酸濃度為50 mmol/L，此時(shí)SAM含量為257 mg/L。

2.3.4 菌體濃度的優(yōu)化

SAM全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中最佳菌體濃度是通過(guò)將OD600值約9.0的菌液按不同體積分?jǐn)?shù)(0.2%～1.4%，間隔0.2%)加入到全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成，以確定最適的添加比例。20 mL反應(yīng)液由50 mmol/LL-甲硫氨酸、適當(dāng)濃度ATP (BcMAT:50 mmol/L、CgMAT:40 mmol/L)、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4組成，45 ℃、各自最適pH值(BcMAT：8.0，CgMAT：8.5)下反應(yīng)5 h，HPLC檢測(cè)SAM含量。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)細(xì)胞添加比例為1.2% (體積分?jǐn)?shù))時(shí)，E.coliBL21/pETduet1-BcmetK重組菌株顯示出最佳的生物轉(zhuǎn)化活性，SAM含量為297 mg/L；而E.coliBL21/pETduet1-CgmetK重組菌株在細(xì)胞添加比例為0.8%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)轉(zhuǎn)化效果最佳，SAM含量達(dá)到307 mg/L。

圖5 菌體濃度對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響Fig.5 The effect of cell concentration on the catalytic reaction of whole cells

2.4 對(duì)甲苯磺酸鈉對(duì)全細(xì)胞催化合成SAM的影響

一些報(bào)告表明，大多數(shù)SAM合酶容易受到產(chǎn)物抑制，只有少數(shù)例外，特別是釀酒酵母的SAM合酶2不受產(chǎn)物抑制[20-22]。為了測(cè)試蠟狀芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶是否存在產(chǎn)物抑制，在含有50 mmol/LL-甲硫氨酸、適當(dāng)濃度ATP (BcMAT：50 mmol/L、CgMAT：40 mmol/L)、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4、適當(dāng)菌體濃度[BcMAT：1.2% (體積分?jǐn)?shù))的OD600值為9.0的細(xì)胞懸浮液、CgMAT：0.8% (體積分?jǐn)?shù))的OD600值為9.0的細(xì)胞懸浮液]的20 mL反應(yīng)體系中添加不同濃度(200～1 000 mmol/L)的pTSoNa，45 ℃、最適pH (BcMAT：8.0，CgMAT：8.5)下反應(yīng)5 h后，加入6%(體積分?jǐn)?shù))HClO4終止反應(yīng)。對(duì)照組則不添加pTSoNa。

結(jié)果如圖6所示，E.coliBL21/pETduet1-BcmetK重組菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程pTSoNa的最優(yōu)添加濃度為600 mmol/L，此時(shí)，SAM含量達(dá)到464 mg/L；E.coliBL21/pETduet1-CgmetK重組菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程pTSoNa的最優(yōu)添加濃度為800 mmol/L，此時(shí)，SAM含量達(dá)到528 mg/L，由此可見(jiàn)，pTSoNa的添加可緩解產(chǎn)物SAM對(duì)SAM合酶的抑制作用，這也證實(shí)了先前文獻(xiàn)報(bào)道的pTSoNa可改善SAM合酶的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象的研究結(jié)論[23]。在800 mmol/LpTSoNa存在下，E.coliBL21/pETduet1-CgmetK重組菌株轉(zhuǎn)化5 h 的SAM含量達(dá)到528 mg/L，相比對(duì)照提高了1.72倍(對(duì)照為不添加pTSoNa，SAM含量只能達(dá)到307 mg/L)。E.coliBL21/pETduet1-BcmetK重組菌株也表現(xiàn)出相似的特性，在600 mmol/LpTSoNa存在時(shí)，轉(zhuǎn)化5 h，SAM含量達(dá)到464 mg/L，相比對(duì)照提高了1.56倍(對(duì)照組為不添加pTSoNa，SAM含量只能達(dá)到297 mg/L)。由此可見(jiàn)，E.coliBL21/pETduet1-CgmetK重組菌株合成SAM的能力優(yōu)于E.coliBL21/pETduet1-BcmetK重組菌株，即谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶催化能力優(yōu)于蠟狀芽孢桿菌來(lái)源的，更有利于SAM的合成。

A-不同濃度對(duì)甲苯磺酸鈉對(duì)全細(xì)胞催化合成SAM的影響； B-對(duì)甲苯磺酸鈉對(duì)全細(xì)胞催化合成SAM的影響圖6 對(duì)甲苯磺酸鈉對(duì)全細(xì)胞催化合成SAM的影響Fig.6 The effect of sodium p-toluenesulfonate on the catalytic reaction of methionine adenosyltransferase

2.5 序列比對(duì)

為了更好地理解為什么在相似條件下兩種重組酶的催化效率存在差異，將從Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到的BcMAT(登錄號(hào)：Q816Q8)和CgMAT(登錄號(hào)：Q9K5E4)蛋白序列使用NCBI的COBALT工具進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果如圖7所示，比對(duì)顯示CgMAT比BcMAT的蛋白序列多8個(gè)氨基酸，這兩種來(lái)源的SAM合酶具有超過(guò)50%的相似性，不同的殘基可能位于具有催化作用的區(qū)域，所以這兩種SAM合酶的催化能力存在差異。

A-圖形展示；B-序列比對(duì)Fig.7 CgMAT (登錄號(hào)：Q9K5E4)和BcMAT (登錄號(hào)：Q816Q8)的氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Comparison of amino acid sequences of CgMAT (accession number Q9K5E4) and BcMAT (accession number Q816Q8)

3 討論

SAM在許多領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用，包括化學(xué)治療和制藥工業(yè)。浙江工商大學(xué)的YU等[25]通過(guò)在大腸桿菌中E.coliBL21(DE3)引入E.coliK-12 (W3110)來(lái)源的SAM合酶編碼基因metK，重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵SAM含量可達(dá)128.2 mg/L，5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵8 h后SAM的最高產(chǎn)量為300.9 mg/L，實(shí)現(xiàn)了SAM的發(fā)酵法合成。本研究在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中異源表達(dá)了蠟狀芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶，構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK和E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK，實(shí)現(xiàn)了SAM的一步法全細(xì)胞催化合成。并針對(duì)重組菌株全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成SAM條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究結(jié)果顯示，重組大腸桿菌E.coliBL21/pETDuet1-BcmetK在最優(yōu)條件[L-甲硫氨酸濃度50 mmol/L、ATP濃度50 mmol/L、1.2%(體積分?jǐn)?shù)) OD600值約9.0的菌體濃度、600 mmol/LpTSoNa、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4、45 ℃、pH 8.0]下，連續(xù)轉(zhuǎn)化5 h，獲得了464 mg/L的SAM。重組大腸桿菌E.coliBL21/pETDuet1-CgmetK在最優(yōu)條件[L-甲硫氨酸濃度50 mmol/L、ATP濃度40 mmol/L、0.8%(體積分?jǐn)?shù)) OD600值約9.0的菌體濃度、800 mmol/LpTSoNa、50 mmol/L MgSO4、100 mmol/L K2SO4、45 ℃、pH 8.5]下，連續(xù)轉(zhuǎn)化5 h，獲得了528 mg/L的SAM，可見(jiàn)，谷氨酸棒桿菌來(lái)源的SAM合酶催化能力優(yōu)于蠟狀芽孢桿菌來(lái)源的，更有利于SAM的合成。

該研究成功構(gòu)建了SAM合成菌株，雖然產(chǎn)量水平不高，但為SAM的可持續(xù)生物合成提供了重要借鑒。接下來(lái)的研究中，為進(jìn)一步改善SAM的產(chǎn)量，將從以下幾個(gè)方面繼續(xù)展開(kāi)研究：(1)對(duì)SAM合酶進(jìn)行挖掘，尋找高效酶；(2)針對(duì)SAM合酶的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象進(jìn)行理性改造，以緩解/解除反饋抑制；(3)嘗試在不同宿主，如畢赤酵母、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行SAM合成菌株的構(gòu)建；(4)理性改造/酶表達(dá)體系優(yōu)化提高SAM合酶的酶活力；(5)構(gòu)建ATP再生系統(tǒng)，降低SAM合成成本[26]。