鄧宇，楊詩(shī)穎，冼文妍，楊宇哲，楊瑞麗

(廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

鞣花酸(ellagic acid，EA)是一種廣泛分布于石榴、藍(lán)莓等水果和核桃等堅(jiān)果、以及茶和多種藥用植物中的天然多酚類化合物[1]，研究顯示其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老及神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[2]。但是，鞣花酸有益于人體健康的臨床研究結(jié)果并不一致。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority， EFSA)曾刊文認(rèn)為，攝入富含鞣花酸的石榴與其聲稱的健康益處之間沒(méi)有因果關(guān)系。研究顯示，鞣花酸生物利用度極低，在血液及組織中往往不能達(dá)到其發(fā)揮生物活性的有效濃度[3]。不被吸收的鞣花酸到達(dá)結(jié)腸后會(huì)被腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化生成尿石素A和尿石素 B等尿石素類物質(zhì)[4]。尿石素類物質(zhì)被證實(shí)亦有抗氧化[5]、抗炎癥[6]和抗衰老[7]等多種生物活性，因此，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)聚焦于其腸道菌群代謝物尿石素類物質(zhì)，認(rèn)為其是鞣花酸在體內(nèi)發(fā)揮其健康作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。但是，由于個(gè)體腸道菌群組成的差異，攝入鞣花酸后生成尿石素類物質(zhì)種類和數(shù)量存在顯著差異[9]，這可能是人群攝入富含鞣花酸的食品后臨床健康效果存在較大差異的原因之一。

研究人員根據(jù)攝入鞣花酸后產(chǎn)生的尿石素類物質(zhì)的定性分析，將人群分為3種尿石素代謝型，即尿石素代謝型A(只生成尿石素A，urolithin metabotype A，UM-A)、尿石素代謝型B(除了尿石素A 外，還生成尿石素B/異尿石素A，urolithin metabotype B，UM-B)和 尿石素代謝型0(不生成尿石素類物質(zhì)，urolithin metabotype 0，UM-0)[10]。不同種類的尿石素生物活性存在顯著差異，研究證明，尿石素A相比于尿石素B和異尿石素A具有更好的抗氧化[11]、抗炎癥活性[12]，比其母體化合物鞣花酸具有更高的生物利用度[13]。因此，開(kāi)展鞣花酸在UM-A型腸道菌群代謝途徑轉(zhuǎn)化過(guò)程研究，分析參與鞣花酸代謝轉(zhuǎn)化生成尿石素A的關(guān)鍵細(xì)菌類群，以及鞣花酸對(duì)UM-A型腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，對(duì)于認(rèn)識(shí)鞣花酸的健康作用具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)檢測(cè)UM-A型菌群體外代謝鞣花酸生成尿石素A過(guò)程中主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及含量，分析其代謝規(guī)律，通過(guò)16S rRNA檢測(cè)菌群變化，分析鞣花酸對(duì)UM-A腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鞣花酸膠囊(鞣花酸含量≥40%)，德國(guó)Sanct Bernhard；鞣花酸(純度≥ 99%)，上海泰坦科技股份有限公司；尿石素A(純度≥99%)，Sigma-Aldrich公司；尿石素C(純度≥98%)，四川省維克奇生物技術(shù)有限公司；甲酸 (質(zhì)譜級(jí))、乙腈(質(zhì)譜級(jí))，美國(guó)Supelco公司；BHI肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽(純度≥99%)，MYM生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；糞便基因組DNA試劑盒(生物試劑)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-Q-E-MS/MS，美國(guó)Thermo公司；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；AW500SG厭氧工作站，英國(guó)伊萊泰科公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 UM-A型腸道菌群的制備

使用無(wú)菌管收集鞣花酸代謝型為A型的志愿者的糞便，要求志愿者至少3個(gè)月未服用過(guò)抗生素相關(guān)藥物，且無(wú)腸胃病史。志愿者均簽署書面知情同意書。在厭氧條件下把糞便轉(zhuǎn)移至離心管中，按1∶3.6(g∶mL)加入磷酸鹽緩沖溶液，過(guò)濾后，加入10%甘油，最終糞便按1∶4(g∶mL)的比例被稀釋，分裝后存于-80 ℃ 冷凍備用。

1.3.2 鞣花酸體外代謝實(shí)驗(yàn)

稱取7.4 g粉末BHI腦心浸液培養(yǎng)基加入200 mL水稀釋攪至完全溶解，每管8 mL分裝至離心管，滅菌后轉(zhuǎn)至厭氧工作站備用。取1 mL糞菌懸液接種于BHI培養(yǎng)基的離心管中，再加入1 mL鞣花酸質(zhì)量濃度為300 μg/mL的含0.5%半胱氨酸鹽酸鹽的BHI培養(yǎng)基，即鞣花酸終質(zhì)量濃度為30 μg/mL，培養(yǎng)條件為37 ℃，N2/CO2/H2的比例為80/15/5分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后取樣檢測(cè)，用等體積含1.5%甲酸的乙酸乙酯滅活萃取，渦旋，合并上清液，氮吹，沉淀用300 μL含15%二甲基亞砜的甲醇溶液復(fù)溶，定容，0.22 μm聚四氟乙烯濾器過(guò)濾，于4 ℃冷藏待測(cè)。

1.3.3 代謝物的鑒定

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/M對(duì)代謝物進(jìn)行定性定量檢測(cè)。質(zhì)譜條件如下：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，Milford，MA)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A和B分別為milli-Q水(1‰甲酸)和乙腈(1‰甲酸)，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL。梯度洗脫如下：0～3 min 95%～85% A，3～11 min 85%～70% A，11～15 min 70%～50% A，15～21 min 50%～10% A，21～22 min 10%～95% A。UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS以電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI)源在負(fù)離子模式下進(jìn)行定性和定量分析。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)在以下條件下進(jìn)行：干燥氣體(N2)30 arb；輔助氣體(N2)10 arb；毛細(xì)電壓3 200 V；毛細(xì)管溫度320 ℃；掃描范圍100～1 500m/z。利用保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)碎片離子信息和峰面積外標(biāo)法對(duì)代謝物進(jìn)行定性定量分析。

1.3.4 16S rRNA高通量測(cè)序檢測(cè)腸道菌群

根據(jù)TIANamp Stool DNA Kit 糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書的步驟和方法抽提總DNA，V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建文庫(kù)后通過(guò)Illumina HiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[14]?？侱NA提取、PCR 擴(kuò)增及Illumina HiSeq測(cè)序均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司協(xié)助完成。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有樣品平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P≤0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物及途徑。表1為負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子特征，推測(cè)其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化0、24、72 h的總離子流圖如圖1所示。與0 h比較，在轉(zhuǎn)化24 h時(shí)，檢測(cè)到4個(gè)代謝產(chǎn)物，其中峰2代謝物m/z260.028 1，通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比和碎片離子信息匹配，證實(shí)其為尿石素M6；峰3代謝物m/z244.082 2，與尿石素M6母離子相差16，推測(cè)峰3代謝物可能是尿石素M6在C環(huán)上損失1分子羥基得到的，其碎片離子信息與標(biāo)準(zhǔn)品尿石素C一致，鑒定其為尿石素C；峰4代謝物m/z275.014 8，與鞣花酸母離子m/z300.998 9相差26，推測(cè)峰4有可能是鞣花酸先水解再經(jīng)脫羧后得到的產(chǎn)物；峰5代謝物m/z227.034 3與尿石素C母離子相差16，推測(cè)其可能是尿石素C丟失1分子羥基得到的，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品碎片離子信息比對(duì)，鑒定其為尿石素A。推測(cè)鞣花酸的轉(zhuǎn)化路徑為EA→未知→UroM6→UroC→UroA，尿石素A為最終代謝產(chǎn)物[15]。

1-鞣花酸;2-尿石素M6;3-尿石素C;4-未知;5-尿石素A圖1 鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化 0、24、72 h總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of EA metabolites at 0, 24, 72 h incubation with UM-A human gut microbiota

UM-A菌群體外代謝過(guò)程的鞣花酸及代謝物含量變化如圖2所示。鞣花酸在24 h內(nèi)被迅速代謝，并在后續(xù)24～72 h緩慢減少，鞣花酸作為代謝底物，其消耗速率也與尿石素A的生成速率相似。尿石素A含量在0～24 h內(nèi)快速增長(zhǎng)，在24 h含量為 (4.86±0.48) μg/mL，隨后在24～72 h緩慢升高。尿石素M6含量在24 h時(shí)最高,為 (2.05±0.43) μg/mL，在后續(xù)24～72 h含量緩慢減少，推測(cè)在體外代謝過(guò)程中鞣花酸會(huì)快速被UM-A菌群代謝成為尿石素M6[16]，隨后繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成尿石素C。尿石素C含量在體外代謝過(guò)程中始終低于0.30 μg/mL，可能是尿石素C作為鞣花酸代謝過(guò)程的中間體，在體外被快速進(jìn)一步代謝為尿石素A，因此能檢測(cè)到的尿石素C含量較低。

圖2 鞣花酸及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Time-concentration curve of EA and transformed products

2.2 鞣花酸對(duì)UM-A型腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 腸道菌群α多樣性

如圖3所示，各組樣本的coverage指數(shù)均大于0.999，說(shuō)明此次測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠。鞣花酸對(duì)UM-A菌群豐富度(chao指數(shù))無(wú)顯著影響(P>0.05)。

A-coverage指數(shù)；B-chao指數(shù)圖3 菌群α多樣性Fig.3 Alpha diversity index

2.2.2 腸道菌群主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)

采用PCoA分析樣本在操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)水平上微生物群落結(jié)構(gòu)的總體差異(圖4)，其中第一成分貢獻(xiàn)率為95.67%，第二成分的貢獻(xiàn)率為2.37%，共同預(yù)測(cè)了98.10%的樣本數(shù)據(jù)。同一時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)樣本分布比較密集，可知此次實(shí)驗(yàn)所取的菌群樣本較為均勻及穩(wěn)定。鞣花酸在UM-A菌群體外代謝后，鞣花酸組與空白組的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明鞣花酸的代謝對(duì)微生物群落產(chǎn)生顯著影響。

圖4 腸道菌群PCoAFig.4 Principal co-ordinates analysis of gut microbiota

2.2.3 在門、屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析

如圖5-A所示，在門水平上，對(duì)照組厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門與變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度分別為65.43%、31.63%、1.50%和0.72%。鞣花酸組厚壁菌門的相對(duì)豐度升高，擬桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對(duì)豐度下降。ROCIO等[17]在鞣花酸體外胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，隨著鞣花酸的代謝，在不同部位的結(jié)腸模擬罐中的厚壁菌門也有一定的上升趨勢(shì)，同時(shí)擬桿菌門也出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。圖5-B所示，在屬水平上共有96個(gè)菌屬被檢測(cè)出，其中相對(duì)豐度較高的菌屬包括擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、多爾氏菌屬(Dorea)、布勞特氏菌屬(Blautia)、毛螺桿菌屬(Lachnospira)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、直腸真桿菌屬(Agathobacter)等。此外，黃桿菌屬(Flavonifractor)、產(chǎn)丁酸桿菌屬(Intestinimonas)、遲緩埃格特菌屬(Eggerthella)在鞣花酸組中相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著性上升。與對(duì)照組相比，鞣花酸組Coprococcus的相對(duì)豐度極顯著升高(P<0.001)(圖6-A)，由2.16%升高至23.16%，Coprococcus能發(fā)酵碳水化合物，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)保護(hù)腸道健康、增強(qiáng)胃腸道機(jī)能降低炎癥水平。腸道有益菌屬Anaerostipes在鞣花酸組相對(duì)豐度極顯著上調(diào)(P<0.001)(圖6-B)，相對(duì)豐度由5.44%升高至8.90%。Anaerostipes可產(chǎn)生對(duì)人體有益的丁酸鹽[18]，參與腸屏障功能調(diào)節(jié)和免疫調(diào)控?！敖到饪剐缘矸鄣年P(guān)鍵菌”Ruminococcus相對(duì)豐度由1.06%上升至3.53%(圖6-C)，大量研究表明瘤胃球菌能有效地分解如細(xì)胞壁等堅(jiān)硬的植物物質(zhì)，具有穩(wěn)定腸道屏障、逆轉(zhuǎn)腹瀉、降低結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)等作用。GU等[19]研究發(fā)現(xiàn), 瘤胃球菌科是小鼠大腸和糞便中的優(yōu)勢(shì)菌群, 與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。Lachnospira相對(duì)豐度由3.38%升至4.29%(圖6-D)，Lachnospira具有發(fā)酵碳水化合物的特點(diǎn)，對(duì)宿主健康維護(hù)具有重要的促進(jìn)作用。Flavonifractor相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著性上升，由0.03%升至0.5%(圖6-E),研究發(fā)現(xiàn)糞便中Flavonifractor豐度的變化與糞中戊酸含量的變化呈正相關(guān)[20]。Intestinimonas相對(duì)豐度由0.02%上升至0.04%(圖6-F)，Intestinimonas是一種產(chǎn)丁酸細(xì)菌，研究發(fā)現(xiàn)患有慢性腎病或炎癥性腸病的患者糞便中其豐度顯著低于健康人[21]，JIANG等[22]提出可以將R.intestinalis作為慢性腎病檢測(cè)的“微生物標(biāo)志物”，并且R.intestinalis可以調(diào)節(jié)抗炎轉(zhuǎn)錄信號(hào)和轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)，減少結(jié)腸中炎性巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量，改善炎癥性腸病。被證實(shí)能把鞣花酸代謝為尿石素類物質(zhì)的Eggerthella[23]相對(duì)豐度由0.073%上升至0.47%(圖6-G)，出現(xiàn)極顯著性升高，推測(cè)Eggerthella可能是參與鞣花酸生物轉(zhuǎn)化為尿石素A的關(guān)鍵腸道菌之一。日本株式會(huì)社大賽璐在專利中報(bào)道Eggerthella具有高的尿石素類物質(zhì)產(chǎn)生能力[24]。本研究結(jié)果顯示鞣花酸能夠調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)潛在有益菌的增殖，同時(shí)富集代謝轉(zhuǎn)化自身生成尿石素的細(xì)菌類群。

A-門水平；B-屬水平圖5 鞣花酸代謝過(guò)程中UM-A腸道菌群的變化Fig.5 Composition of gut microbiota during metabolism of EA in vitro

2.2.4 鞣花酸對(duì)UM-A菌群KEGG代謝通路的影響

如圖7所示，功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)鞣花酸組與對(duì)照組有182條通路有顯著性差異(P≤0.05)。與對(duì)照組相比，鞣花酸組25條通路極顯著下調(diào)，包括脂多糖生物合成蛋白、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化吸收、碳水化合物消化吸收等代謝通路，7條通路極顯著上調(diào)，包括RIG-I樣受體信號(hào)通路、金黃色葡萄球菌感染以及電子轉(zhuǎn)移載體等代謝通路。KANG等[25]發(fā)現(xiàn)，鞣花酸能夠通過(guò)腸道微生物能夠調(diào)控脂肪代謝，對(duì)高糖高脂飲食導(dǎo)致的血脂異常有明顯的改善作用，達(dá)到預(yù)防肥胖的效果。菌群代謝通路基因預(yù)測(cè)分析，表明鞣花酸的攝入可能通過(guò)影響腸道菌群代謝進(jìn)而發(fā)揮對(duì)機(jī)體的健康作用。

A-糞球菌屬；B-丁酸弧菌屬；C-瘤胃球菌屬；D-毛螺桿菌屬；E-黃桿菌屬；F-產(chǎn)丁酸桿菌屬；G-遲緩埃格特菌屬圖6 鞣花酸影響的主要菌屬的相對(duì)豐度變化Fig.6 Relative abundance of major genera changed by EA 注：*表示P≤0.05;**表示P≤0.01;***表示P≤0.001;****表示P<0.000 1

圖7 鞣花酸對(duì)UM-A菌群KEGG代謝通路的影響Fig.7 Effect of EA on the related KEGG signaling pathway in UM-A gut microbiota

3 結(jié)論

本研究利用UPLC-Q-TOF/MS 分析鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外代謝轉(zhuǎn)化途徑，同時(shí)結(jié)合16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析鞣花酸對(duì)腸道菌群組成及代謝通路的影響。結(jié)果表明，鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化過(guò)程中，主要產(chǎn)物為尿石素M6，尿石素C、尿石素A；推測(cè)鞣花酸轉(zhuǎn)化路徑為EA→未知→UroM6→UroC→UroA，尿石素A為最終代謝產(chǎn)物。鞣花酸能促進(jìn)丁酸弧菌(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、產(chǎn)丁酸桿菌屬(Intestinimonas)等腸道潛在益生菌生長(zhǎng)。通過(guò)腸道菌群基因功能注釋KEGG 通路的差異性分析，鞣花酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)UM-A菌群脂多糖生物合成蛋白、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、以及蛋白質(zhì)和碳水化合物消化吸收等代謝通路等影響機(jī)體代謝。