陳曉琳 劉洋兒 許文濤 郭明璋 劉慧琳

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100083）

開(kāi)發(fā)新一代食品安全檢測(cè)技術(shù)是構(gòu)建從“從農(nóng)田到餐桌”全鏈條食品安全監(jiān)管體系，進(jìn)一步提升我國(guó)食品安全水平的關(guān)鍵。食品安全檢測(cè)技術(shù)主要分為儀器分析法和快速檢測(cè)法兩大類(lèi)，基于色譜、光譜等原理的儀器分析法是目前食品安全抽檢監(jiān)測(cè)部門(mén)所使用的主要方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)及大量樣品的篩選和快速測(cè)定［1］?？焖贆z測(cè)法是利用靶標(biāo)待測(cè)物的化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)所開(kāi)發(fā)的，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可以短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)的方法。相比于儀器分析法，快速檢測(cè)法不僅可以提升抽檢監(jiān)測(cè)部門(mén)的工作效率，更可用于企業(yè)、商超、消費(fèi)者的食品安全自檢自測(cè)，對(duì)于完善食品安全監(jiān)管體系具有重要意義。

近年來(lái)，食品安全快速檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的共同努力下取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其中利用抗原抗體特異性識(shí)別、適配體特異性識(shí)別、核酸特異性擴(kuò)增等原理所開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展尤為迅速［2］。這些技術(shù)檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便，但仍然需要在以下方面進(jìn)行提升：首先，由于食品基質(zhì)成分復(fù)雜，這些技術(shù)通常需要配合復(fù)雜的預(yù)處理步驟，導(dǎo)致操作復(fù)雜性增加，總檢測(cè)時(shí)間增長(zhǎng)；另一方面這些技術(shù)所使用的抗體、適配體、核酸擴(kuò)增酶和引物等物質(zhì)生產(chǎn)純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，導(dǎo)致檢測(cè)成本增高。細(xì)胞傳感技術(shù)是一種新興食品安全快速檢測(cè)技術(shù)，它是以活體細(xì)胞為感應(yīng)元件，感應(yīng)被測(cè)量并按照一定規(guī)律轉(zhuǎn)換為可識(shí)別信號(hào)的檢測(cè)裝置［3］。由于細(xì)胞具有代謝調(diào)控能力，無(wú)論外部環(huán)境如何變化，細(xì)胞始終保持相對(duì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，為靶標(biāo)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)化提供了穩(wěn)定的環(huán)境，因此細(xì)胞傳感器對(duì)環(huán)境的抗干擾能力通常較強(qiáng)；由于細(xì)胞具有自我繁殖能力，傳感器細(xì)胞內(nèi)部所有基因元件可以通過(guò)基因復(fù)制和細(xì)胞增殖而自動(dòng)擴(kuò)增，因此細(xì)胞傳感器在生產(chǎn)上具有簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快速的特點(diǎn)。上述優(yōu)點(diǎn)使細(xì)胞傳感技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。

合成生物學(xué)的發(fā)展為細(xì)胞傳感技術(shù)的應(yīng)用提供了新的契機(jī)。合成生物學(xué)是指人們將基因按照一定規(guī)律連接成網(wǎng)絡(luò)，讓細(xì)胞來(lái)完成人為設(shè)計(jì)的各種任務(wù)［4］。與傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)通過(guò)改造某個(gè)特定基因而獲得所需要的細(xì)胞品系不同，合成生物學(xué)技術(shù)將細(xì)胞視為“微型機(jī)械”，對(duì)細(xì)胞的改造更類(lèi)似于機(jī)械設(shè)備中元器件的搭建。因此，合成生物學(xué)與細(xì)胞傳感技術(shù)在理論思想方面具有高度一致性。合成生物學(xué)為細(xì)胞傳感器提供新的功能元件、模塊器件以及組裝理論。本文將對(duì)基于合成生物學(xué)的細(xì)胞傳感技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用案例進(jìn)行綜述，并對(duì)合成生物學(xué)與食品安全技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 合成生物學(xué)細(xì)胞傳感系統(tǒng)的感應(yīng)元件

細(xì)胞傳感器的感應(yīng)元件主要包括轉(zhuǎn)錄因子和核糖開(kāi)關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能與基因上游特定序列專(zhuān)一性結(jié)合，從而影響基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，核糖開(kāi)關(guān)是某些mRNA 非翻譯區(qū)的序列折疊成一定的構(gòu)象。這兩類(lèi)分子均可特異性結(jié)合某種或某類(lèi)化學(xué)物質(zhì)并導(dǎo)致自身三維構(gòu)象發(fā)生變化，轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)象變化后，其與基因的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力改變，從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而核糖開(kāi)關(guān)構(gòu)象變化后，其莖環(huán)排布發(fā)生改變，暴露或隱藏mRNA 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，從而開(kāi)啟或關(guān)閉mRNA 的翻譯過(guò)程。感應(yīng)元件與待測(cè)物質(zhì)的結(jié)合能力，決定了細(xì)胞傳感器的靈敏度和特異性，因此篩選合適的感應(yīng)元件是構(gòu)建細(xì)胞傳感器的關(guān)鍵。

1.1 轉(zhuǎn)錄因子

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的原核生物轉(zhuǎn)錄因子約有300 多種，細(xì)胞傳感器設(shè)計(jì)者可以在CollecTF1、P2TFA、porTF 等原核生物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中查找識(shí)別某種待測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子（表1）。然而在食品安全領(lǐng)域，大部分需檢測(cè)的危害物質(zhì)并沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的已知轉(zhuǎn)錄因子，需要從自然界生物體內(nèi)篩選新的轉(zhuǎn)錄因子，甚至人工構(gòu)建自然界中不存在的轉(zhuǎn)錄因子。隨著基于高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，篩選新轉(zhuǎn)錄因子的效率大幅提高。例如，Shi 等［25］為了篩選丁醇的轉(zhuǎn)錄因子，將丁醇及其類(lèi)似物丙醇、乙醇等分別加入酵母細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，找出特異性響應(yīng)丁醇，而不響應(yīng)乙醇、丙醇的啟動(dòng)子，并將其與紅色熒光蛋白基因結(jié)合，在酵母細(xì)胞中構(gòu)建了檢測(cè)丁醇的全細(xì)胞生物傳感器。

表1 常見(jiàn)靶標(biāo)物質(zhì)的細(xì)胞傳感器感應(yīng)元件Table 1 Sensing elements in whole-cell biosensors for common target substances

對(duì)于難以找到理想的天然轉(zhuǎn)錄因子的靶標(biāo)物質(zhì)，合成生物學(xué)提供了人工改造甚至從頭構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子的策略，常見(jiàn)的方式有截短、嵌合、功能域突變、全蛋白突變、從頭設(shè)計(jì)等。（1）截短，即通過(guò)縮短已知轉(zhuǎn)錄因子的長(zhǎng)度來(lái)改變其性能。例如，Tao等［26］通過(guò)截短轉(zhuǎn)錄因子CadR 來(lái)優(yōu)化其對(duì)鎘離子和汞離子的特異性。該研究分別從C 端去掉CadR的10 個(gè)和21 個(gè)氨基酸來(lái)自獲得了CadR-TC10 和CadR-TC21，并將其作為感應(yīng)元件控制綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，構(gòu)建識(shí)別鎘離子和汞離子，而對(duì)鋅離子識(shí)別減弱的大腸桿菌全細(xì)胞生物傳感器。（2）嵌合，即將一種轉(zhuǎn)錄因子的靶標(biāo)識(shí)別功能域與另一種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)調(diào)控功能域相結(jié)合，從而獲得一種特異性好、基因表達(dá)調(diào)控能力強(qiáng)的新轉(zhuǎn)錄因子。例如，Mendoza 等［27］利用嵌合的方式開(kāi)發(fā)了一種對(duì)汞離子特異性好、靈敏度高的全細(xì)胞生物傳感器。該團(tuán)隊(duì)將轉(zhuǎn)錄因子GolS77 的金離子識(shí)別功能域替換為MerR 的汞離子識(shí)別結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建成為GolS*轉(zhuǎn)錄因子。GolS*轉(zhuǎn)錄因子與Hg2+結(jié)合后可以促進(jìn)PgolB 啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，從而將檢測(cè)金離子的全細(xì)胞生物傳感器改造為檢測(cè)汞離子的全細(xì)胞生物傳感器。（3）功能域突變，即對(duì)轉(zhuǎn)錄因子中的功能域（能獨(dú)立存在的功能單位）進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。例如Kasey 等［28］對(duì)MphR 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別結(jié)構(gòu)域中與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)直接結(jié)合的5 個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建成所有5 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的飽和突變庫(kù)QCMS5，從中篩選了一種對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)特異性更好、靈敏度更高的突變體轉(zhuǎn)錄因子。利用該突變體轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建的全細(xì)胞生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物生物合成基因通路的高通量定向進(jìn)化。此外，D’Oelsnitz 等［29］對(duì)RamR轉(zhuǎn)錄因子與黃連素結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行誘變，構(gòu)建突變文庫(kù)，挑選最佳突變體轉(zhuǎn)錄因子，開(kāi)發(fā)了四氫生物堿的高度特異性和靈敏度的生物傳感器。（4）全蛋白突變，即將原有轉(zhuǎn)錄因子的蛋白隨機(jī)突變篩選出有正向作用的突變體。例如，Chong 等［11］通過(guò)對(duì)dmpR 基因的易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增，將隨機(jī)突變引入整個(gè)DmpR 蛋白，從中篩選出性能更好的特異性響應(yīng)有機(jī)磷的轉(zhuǎn)錄因子，證明了在轉(zhuǎn)錄因子功能域外的氨基酸位點(diǎn)突變也有助于增加其誘導(dǎo)表達(dá)水平。（5）從頭設(shè)計(jì)，即利用酶對(duì)底物識(shí)別的功能域、抗體對(duì)抗原識(shí)別的功能域等部件，從頭創(chuàng)造自然界中不存在的轉(zhuǎn)錄因子［30-31］。例如，Chang 等［30］提出了一種基于單體DNA 結(jié)合域融合的單域抗體的通用框架來(lái)從頭設(shè)計(jì)針對(duì)新靶標(biāo)配體的轉(zhuǎn)錄因子的策略。

對(duì)于改造或從頭設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子，合成生物學(xué)也提供了高效篩選的方案，例如，Liu 等［32］將轉(zhuǎn)錄因子性能與細(xì)胞麥芽糖利用能力相偶聯(lián)，形成了新型篩選策略。與傳統(tǒng)的基于抗生素耐藥性篩選策略相比，基于麥芽糖利用能力的篩選適應(yīng)性更強(qiáng)，即使經(jīng)過(guò)多次選擇，逃逸風(fēng)險(xiǎn)也要低得多。Jia 等［33］設(shè)計(jì)了雙向篩選技術(shù)，以獲得對(duì)鉛離子響應(yīng)靈敏度較高，且不受鋅離子干擾的PbrR 轉(zhuǎn)錄因子突變體。在正向選擇中，PbrR 轉(zhuǎn)錄因子與氨芐青霉素抗性基因amp的表達(dá)相偶聯(lián)，在培養(yǎng)液中加入鉛離子，利用氨芐青霉素篩選出對(duì)鉛離子靈敏度較高PbrR 突變體；在反向篩選中，PbrR 轉(zhuǎn)錄因子與果聚糖合酶基因sacB相偶聯(lián)，在培養(yǎng)液中加入鋅離子，利用蔗糖篩選出對(duì)鋅離子靈敏度較低PbrR 突變體。

1.2 核糖開(kāi)關(guān)

2002年人類(lèi)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)核糖開(kāi)關(guān)，目前為止已知的天然核糖開(kāi)關(guān)僅有20 余種［34］。原核生物中核糖開(kāi)關(guān)主要有3 種類(lèi)型：（1）適配終止子模式。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無(wú)靶標(biāo)物質(zhì)時(shí)，基因上游的5'非編碼形成抗終止子結(jié)構(gòu)，RNA 聚合酶可以順利完成基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有靶標(biāo)物質(zhì)時(shí)，靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合核糖開(kāi)關(guān)，破壞了抗終止子的穩(wěn)定性，而形成終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致RNA 聚合酶從mRNA 分離，關(guān)閉基因表達(dá)。（2）適配RBS 模式。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無(wú)靶標(biāo)物質(zhì)時(shí)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS）被隱藏在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，核糖體無(wú)法結(jié)合到mRNA 上而無(wú)法翻譯。當(dāng)靶標(biāo)結(jié)合核糖開(kāi)關(guān)后，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，暴露出核糖體結(jié)合位點(diǎn)，開(kāi)啟蛋白翻譯。（3）適配核酶模式。當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合到核糖開(kāi)關(guān)區(qū)域后，激活核酶的自切割活性，導(dǎo)致mRNA 降解，從而阻斷蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。以核糖開(kāi)關(guān)作為感應(yīng)元件的細(xì)胞傳感器案例目前較少，例如Wang 等［35］將特異性響應(yīng)鈷/鎳離子的核糖開(kāi)關(guān)與紅色熒光蛋白mCherry 基因相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出高靈敏度和高選擇性的鈷/鎳離子全細(xì)胞生物傳感器。

對(duì)于自然界中不存在天然核糖開(kāi)關(guān)的靶標(biāo)物質(zhì)，可以通過(guò)篩選、改造等方式開(kāi)發(fā)人工核糖開(kāi)關(guān)，而RNA 合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為核糖開(kāi)關(guān)的智能靶向設(shè)計(jì)提供了新的契機(jī)。通過(guò)體外篩選得到的能與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性結(jié)合的核酸短鏈被稱為適配體。適配體的三維構(gòu)象與其所處的體系環(huán)境具有密切關(guān)系，如何保證體外環(huán)境中篩選的適配體在傳感器細(xì)胞內(nèi)正確折疊仍是該領(lǐng)域需要突破的技術(shù)瓶頸。Jang 等［36］通過(guò)體外-體內(nèi)雙重篩選解決這一問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了一種人工己內(nèi)酰胺核糖開(kāi)關(guān)，靈敏度達(dá)到50 mmol/L，并可用于篩選工業(yè)生產(chǎn)菌株以提高己內(nèi)酰胺的產(chǎn)量。該團(tuán)隊(duì)［37］以及Xiu 等［38］又利用該策略篩選得到了特異性響應(yīng)柚皮素的核糖開(kāi)關(guān)。然而該體外體內(nèi)雙重篩選策略工作量大，成功率低，無(wú)法從根本上解決適配體的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用問(wèn)題。深入研究適配體序列、構(gòu)象、環(huán)境之間的關(guān)系，才是從根本上解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵［34,39-40］。

2 合成生物學(xué)細(xì)胞傳感系統(tǒng)的報(bào)告元件

細(xì)胞傳感器的報(bào)告元件是指?jìng)鞲衅骷?xì)胞中生成人類(lèi)或已有儀器可識(shí)別信號(hào)的元件。報(bào)告元件通常為蛋白質(zhì)，也有少量為功能核酸。目前已經(jīng)發(fā)展成熟和正在研發(fā)的各類(lèi)報(bào)告元件可分為八類(lèi)（圖1）。

圖1 細(xì)胞傳感器報(bào)告元件種類(lèi)Fig.1 Types of reporter elements used in whole-cell biosensors

2.1 熒光素酶

自然界中能夠與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)統(tǒng)稱為熒光素，該反應(yīng)的速率在沒(méi)有酶催化的情況下非常慢，而生物體內(nèi)許多能夠在鈣離子作用下大大加快這一反應(yīng)速率的酶，統(tǒng)稱為酶熒光素酶（luciferase），常用作報(bào)告元件的熒光素酶包括細(xì)菌熒光素酶（bacterial luciferase，Lux）、螢火蟲(chóng)熒光素酶（firefly luciferase，Luc）和水母素（aequorin）等。

2.2 熒光蛋白

熒光蛋白一般由單個(gè)基因表達(dá)，蛋白自身可以產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光，不需要任何底物，除了溶氧外，其表達(dá)和熒光強(qiáng)度基本不受底盤(pán)細(xì)胞代謝的影響，這些優(yōu)點(diǎn)使熒光蛋白成為最理想的細(xì)胞傳感器報(bào)告元件?，F(xiàn)階段，90%以上的合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器使用熒光蛋白作為報(bào)告元件。在熒光蛋白的選擇方面，細(xì)胞傳感器的設(shè)計(jì)者需要考慮如下因素［41］：第一，熒光蛋白在底盤(pán)細(xì)胞中能夠有效表達(dá)并成熟，并且能提供最夠強(qiáng)度的熒光信號(hào)；第二，熒光蛋白在檢測(cè)過(guò)程中要保持光穩(wěn)定性；第三，熒光蛋白對(duì)底盤(pán)細(xì)胞應(yīng)是沒(méi)有毒性的；第四，熒光蛋白應(yīng)該對(duì)檢測(cè)體系的環(huán)境因素不敏感。

2.3 熒光適配體

RNA 適配體熒光報(bào)告元件是指與無(wú)熒光或弱熒光靶物質(zhì)結(jié)合后能形成強(qiáng)熒光復(fù)合物的適配體。RNA 適配體熒光報(bào)告元件信號(hào)輸出的過(guò)程則只需要經(jīng)歷“轉(zhuǎn)錄”的過(guò)程，理論上，RNA 適配體報(bào)告元件的信號(hào)輸出所需時(shí)間更短。在長(zhǎng)度上，由于蛋白元件的每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)DNA 上3 個(gè)堿基，而RNA元件的每個(gè)核糖核酸對(duì)應(yīng)DNA 上的1 個(gè)堿基，RNA元件所對(duì)應(yīng)的基因通常更短。在元件設(shè)計(jì)上，RNA比蛋白質(zhì)在裁剪、劈裂、拼接等方面都更加便利。因此，RNA 適配體作為報(bào)告元件具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前可用作報(bào)告元件的熒光適配體有孔雀石綠熒光適配體（malachite green aptamer）［42］、菠菜綠熒光適配體（spinach aptamer）［43］、芒果黃熒光適配體（mango aptamer）［44］、西蘭花熒光適配體（broccoli aptamer）［45］。

2.4 色素報(bào)告元件

色素（microbial pigments）是一類(lèi)由微生物或動(dòng)植物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因其具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠?qū)饩€造成反射、干涉、散射或吸收等效果，而呈現(xiàn)出不同的顏色。雖然色素本身不是蛋白類(lèi)物質(zhì)，但其合成受到色素生成酶的嚴(yán)格控制，因此可以作為合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器的報(bào)告元件。與熒光蛋白報(bào)告元件相比，微生物色素報(bào)告元件產(chǎn)生的輸出信號(hào)是人類(lèi)肉眼可見(jiàn)的，因此更適合用于可視化細(xì)胞傳感器的開(kāi)發(fā)。常見(jiàn)的微生物色素包括類(lèi)胡蘿卜素［46］、黑色素［47］、靈菌紅素［48］、紫色桿菌素［49］、靛藍(lán)素［50］等。色素報(bào)告元件的性能，取決于傳感器底盤(pán)細(xì)胞中底物的存在情況，由底物到產(chǎn)物所需的基因元件數(shù)量，從底物到產(chǎn)物顏色變化在視覺(jué)上的顯著性等。

2.5 氣體報(bào)告元件

對(duì)于不透明的樣品，如土壤、谷物等，較難利用光學(xué)報(bào)告元件進(jìn)行檢測(cè)，故近年來(lái)出現(xiàn)了以氣體的生成作為輸出信號(hào)的全細(xì)胞生物傳感器，由于氣體可以自發(fā)集中到檢測(cè)體系的頂空，因此無(wú)論在透明介質(zhì)還是不透明介質(zhì)中均可應(yīng)用。常見(jiàn)的氣體報(bào)告元件［51］如norB基因（催化生成一氧化二氮）、efe基因（催化生成乙烯）［52］、mht基因（催化生成鹵甲烷）［53］、dsr基因（催化生成甲硫醇）。

2.6 磁小體（magnetosome）

1975年，美國(guó)人R.P.Blakemore 首次發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)運(yùn)動(dòng)方向能隨外加磁場(chǎng)極性改變而變化的細(xì)菌，并將其命名為趨磁細(xì)菌（magnetotacitic bacterium）。隨后科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種類(lèi)型的趨磁細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)它們細(xì)胞內(nèi)都含有生物膜包被，單磁疇級(jí)晶體鐵磁顆粒，稱為磁小體。目前磁小體尚不能在大腸桿菌等工程菌株中表達(dá)，若隨著磁小體生成機(jī)制的深入研究［54］，這一技術(shù)瓶頸得以突破，則可以將大部分基因整合到大腸桿菌基因組上進(jìn)行組成型表達(dá)，將少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵基因作為信號(hào)輸出元件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，傳感器細(xì)胞能產(chǎn)生完整的磁小體，從而釋放磁信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)磁性強(qiáng)弱，反映靶標(biāo)物質(zhì)的濃度。

2.7 冰核蛋白

自然界存在一類(lèi)細(xì)菌能在-5℃--2℃誘發(fā)植物細(xì)胞水結(jié)冰而發(fā)生霜凍，這類(lèi)細(xì)菌稱為冰核細(xì)菌。冰核細(xì)菌能產(chǎn)生一種特殊的蛋白質(zhì)，具有特定的重復(fù)序列，可以使水分子排列成冰核，進(jìn)而形成規(guī)則、細(xì)膩和微小的冰晶，這類(lèi)蛋白被稱為冰核蛋白。冰核蛋白報(bào)告元件提供了一種延時(shí)檢測(cè)的方法。由于冰核蛋白結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，保存時(shí)間較長(zhǎng)，故可以將產(chǎn)生冰核蛋白的過(guò)程與檢測(cè)冰核蛋白的過(guò)程進(jìn)行分離。冰核蛋白報(bào)告元件的優(yōu)點(diǎn)是將對(duì)樣品物性的要求降到最低，缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)［55-56］。

2.8 Curli蛋白

大腸桿菌和沙門(mén)氏菌（Salmonellaspp.）的生物膜中含有名為Curli 的功能性淀粉樣蛋白，它們可以在細(xì)胞外自組裝成納米級(jí)纖維蛋白。研究表明，Curli 和類(lèi)似的功能性淀粉樣蛋白是一種關(guān)鍵性生物膜成分，能夠促進(jìn)基底的黏附、生物膜的結(jié)構(gòu)強(qiáng)化和宿主細(xì)胞的入侵。Tay 等［57］利用特異性響應(yīng)汞離子的轉(zhuǎn)錄因子MerR 控制curli基因的表達(dá)，構(gòu)建了檢測(cè)汞離子的全細(xì)胞生物傳感器。該傳感器細(xì)胞與樣品進(jìn)行孵育后，上清的OD 值與汞離子濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

3 基于合成生物學(xué)的食品安全檢測(cè)基因回路

感應(yīng)元件和報(bào)告元件通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控的方式相偶聯(lián)，即可構(gòu)建成為簡(jiǎn)單的細(xì)胞傳感器基因回路（圖2），用于單一靶標(biāo)物質(zhì)的直接檢測(cè)。若要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞傳感系統(tǒng)的信號(hào)放大、多元檢測(cè)、延時(shí)報(bào)告等復(fù)雜功能，則需要借助于其他功能元件或由幾個(gè)相關(guān)功能元件組成的完成某一任務(wù)的功能模塊，構(gòu)建成為復(fù)雜的細(xì)胞傳感器基因回路。合成生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，正是推動(dòng)簡(jiǎn)單基因回路向復(fù)雜基因回路演進(jìn)的主要?jiǎng)恿Α?/p>

3.1 信號(hào)放大

合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器在檢測(cè)各種食品污染物方面具有很大的潛力，然而細(xì)胞傳感器的檢測(cè)限通常較高，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，常常不能滿足實(shí)際需要。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在基因回路中加入模式化的信號(hào)放大模塊是一種有效的方案（圖2-A），能夠?qū)z測(cè)限降低2-3 個(gè)數(shù)量級(jí)，并且也可以在一定程度上提高檢測(cè)速度。

圖2 合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器的基因回路Fig.2 Gene circuits of whole-cell biosensors in synthetic biology

3.1.1 基于轉(zhuǎn)錄因子疊加的放大信號(hào) Karig 等［58］為了放大qsc 啟動(dòng)子對(duì)?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）的響應(yīng)，使Placlq啟動(dòng)子控制rhlR基因的表達(dá)，高效的cl（LVA）抑制基因置于qsc 啟動(dòng)子的下游，同時(shí)λP（R-O12）啟動(dòng)子控制熒光報(bào)告基因的表達(dá)，將這三部分基因回路進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建信號(hào)放大基因回路。當(dāng)外源性C4HSL 擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)并與rhlR基因表達(dá)的RhlR 受體蛋白結(jié)合，C4HSL/RhlR 復(fù)合物激活qsc 啟動(dòng)子，導(dǎo)致Cl 蛋白的產(chǎn)生，Cl 蛋白會(huì)調(diào)控基因eyfp的表達(dá)水平。

3.1.2 基于正反饋回路的信號(hào)放大 反饋可以放大對(duì)誘導(dǎo)劑的響應(yīng)，并產(chǎn)生二進(jìn)制輸出和滯后，是許多基因回路調(diào)節(jié)中常用的機(jī)制。正反饋也被用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞和組織特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，為增強(qiáng)基因表達(dá)提供了一種方法。例如，Sayut 等［59］利用人工正反饋環(huán)（PFLs）來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，作者利用LuxR 在高濃度的3-氧-己酰高絲氨酸內(nèi)酯（OHHL）存在下可以激活PluxI 啟動(dòng)子，構(gòu)建了正反饋的基因回路。在基因回路中，外源添加的OHHL 會(huì)導(dǎo)致LuxR 激活PluxI 啟動(dòng)子，從而導(dǎo)致LuxR 和gfpuv 的表達(dá)，而LuxR 表達(dá)的增加進(jìn)一步增強(qiáng)了PluxI 啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致正反饋，從而增強(qiáng)了弱啟動(dòng)子的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大。

3.1.3 通過(guò)信號(hào)串聯(lián)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大 使用核糖開(kāi)關(guān)在大腸桿菌的敏感菌株和報(bào)告菌株之間啟動(dòng)信號(hào)傳遞，與核糖開(kāi)關(guān)直接控制熒光表達(dá)相比，增加了配體結(jié)合產(chǎn)生的熒光量。例如，Goodson 等［60］使用一個(gè)核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)分子C4，該分子可被“放大器”細(xì)胞類(lèi)型的啟動(dòng)子（“PRhl”）檢測(cè)，激活綠色熒光蛋白的表達(dá)。與核糖開(kāi)關(guān)直接控制熒光表達(dá)相比，增加了配體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熒光量。

3.1.4 基于質(zhì)?？截悢?shù)核糖開(kāi)關(guān)信號(hào)放大 控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)可以增強(qiáng)熒光信號(hào)。Dwidar 等［61］設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一個(gè)雙核糖開(kāi)關(guān)質(zhì)粒，在單個(gè)質(zhì)粒上引入兩個(gè)配體激活的核糖開(kāi)關(guān)，對(duì)相同的配體作出反應(yīng)。一個(gè)核糖開(kāi)關(guān)控制目的基因，另一個(gè)控制質(zhì)粒復(fù)制，配體的加入導(dǎo)致目的基因的表達(dá)量增多以及質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加，從而使核糖體開(kāi)關(guān)在基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的改善。

3.1.5 利用幾種方式集合的方法構(gòu)建信號(hào)放大系統(tǒng) 例如，Wan 等［62］通過(guò)3 種方法聯(lián)合開(kāi)發(fā)了一種新穎的模塊化傳感器信號(hào)放大方法，設(shè)計(jì)了超靈敏的砷和汞細(xì)胞傳感器，將檢測(cè)限和輸出分別提高了5 000 倍和750 倍，第一種方法是調(diào)節(jié)傳感模塊中的細(xì)胞內(nèi)受體蛋白密度，以增加傳感器的靈敏度，即改變感應(yīng)元件中組成型啟動(dòng)子（PC）的強(qiáng)度，受體蛋白的密度由PC啟動(dòng)子的強(qiáng)度決定（啟動(dòng)子越弱傳感器的靈敏度越高，動(dòng)態(tài)范圍越大），且受體蛋白與配體結(jié)合后將抑制同源啟動(dòng)子PR的表達(dá)，抑制綠色熒光蛋白的產(chǎn)生；第二是在計(jì)算模塊中設(shè)計(jì)一個(gè)高增益轉(zhuǎn)錄放大器，該放大器放大來(lái)自PR啟動(dòng)子的傳感器信號(hào)，從而增加檢測(cè)范圍；第三種方法是串聯(lián)多個(gè)這樣的放大器來(lái)放大傳感器信號(hào)并進(jìn)一步提高了傳感性能。

3.2 邏輯計(jì)算（邏輯門(mén)）

多元靶標(biāo)檢測(cè)是細(xì)胞傳感器的發(fā)展趨勢(shì)之一。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞傳感器檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，可以構(gòu)建并行檢測(cè)通道，即每一種靶標(biāo)對(duì)應(yīng)一種信號(hào)報(bào)告元件；也可以進(jìn)行信號(hào)整合，即將多個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)邏輯運(yùn)算整合成一個(gè)報(bào)告信號(hào)。實(shí)現(xiàn)邏輯運(yùn)算的模塊被稱為邏輯門(mén)，常見(jiàn)的邏輯門(mén)包括與門(mén)（AND Gate）（圖2-B），或門(mén)（OR Gate）（圖2-D），非門(mén)（NOT Gate）（圖2-E），或非門(mén)（NOR Gate）等。與門(mén)的運(yùn)算規(guī)則為當(dāng)所有靶標(biāo)均為陽(yáng)性時(shí)產(chǎn)生報(bào)告信號(hào)，或門(mén)的運(yùn)算規(guī)則為所有靶標(biāo)中任意一個(gè)為陽(yáng)性即產(chǎn)生報(bào)告信號(hào)，非門(mén)的運(yùn)算規(guī)則為檢測(cè)靶標(biāo)均為陰性時(shí)產(chǎn)生報(bào)告信號(hào)，或非門(mén)為所有靶標(biāo)均為陰性時(shí)產(chǎn)生報(bào)告信號(hào)。合成生物學(xué)利用核糖開(kāi)關(guān)、轉(zhuǎn)錄因子、重組酶等元件構(gòu)建了基因線路的邏輯門(mén)模塊，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞傳感器多元靶標(biāo)檢測(cè)時(shí)的邏輯運(yùn)算及信號(hào)整合。

3.2.1 基于核糖開(kāi)關(guān)的邏輯門(mén) RNA 工程系統(tǒng)為許多生物體的基因表達(dá)提供了簡(jiǎn)單而通用的控制，其中核糖開(kāi)關(guān)的設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)來(lái)操縱順式反應(yīng)器中的任何報(bào)告裝置，以低代謝成本執(zhí)行嚴(yán)格的時(shí)間和空間控制。這種由核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)的設(shè)備組裝成高階遺傳電路，可以有效地處理邏輯運(yùn)算。核糖開(kāi)關(guān)即設(shè)置特定的RNA 序列，使其可以形成特定環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可以與一些抗生素進(jìn)行結(jié)合從而不再與核糖體結(jié)合，從而阻止了翻譯的進(jìn)行。例如，Schneider 等［25］采用了著名的ROC 分析，并推導(dǎo)出了一種新的邏輯門(mén)性能指標(biāo)。從新霉素和四環(huán)素結(jié)合核糖開(kāi)關(guān)開(kāi)始，設(shè)計(jì)了一個(gè)能夠傳遞NOT 和NOR 邏輯行為的阻遏門(mén)。單個(gè)輸入對(duì)應(yīng)于NOT 邏輯；將兩個(gè)核糖開(kāi)關(guān)進(jìn)行“串聯(lián)”形成NOR邏輯門(mén)。當(dāng)四環(huán)素和新霉素分子不存在時(shí)可以結(jié)合核糖體進(jìn)行翻譯表達(dá)綠色熒光蛋白，四環(huán)素和新霉素存在一種以上都不能結(jié)合核糖體不表達(dá)綠色熒光。

3.2.2 基于復(fù)合型轉(zhuǎn)錄因子的邏輯門(mén) 原核生物中存在一些由不同組分組裝構(gòu)成的復(fù)合型轉(zhuǎn)錄因子，如異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子以及某些需要伴侶組分的轉(zhuǎn)錄因子。將不同靶標(biāo)物質(zhì)對(duì)應(yīng)復(fù)合型轉(zhuǎn)錄因子的一種組分的表達(dá)，即可構(gòu)建AND 型邏輯門(mén)。例如，Moon 等［65］利用InvF 轉(zhuǎn)錄因子及其伴侶蛋白SicA構(gòu)建了AND 邏輯門(mén)。InvF 轉(zhuǎn)錄因子及SicA 單獨(dú)存在時(shí)均不具有開(kāi)啟報(bào)告元件基因表達(dá)的能力，但二者同時(shí)存在時(shí)，可以組裝形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，結(jié)合到相應(yīng)的啟動(dòng)子上開(kāi)啟報(bào)告元件基因的表達(dá)。將兩種靶標(biāo)物質(zhì)分別控制InvF 和SicA 的表達(dá)，即可形成只有在兩種靶標(biāo)物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)才會(huì)產(chǎn)生報(bào)告信號(hào)的AND 邏輯門(mén)細(xì)胞傳感器。

3.2.3 基于Toehold 的邏輯門(mén) Green 等［63］設(shè)計(jì)了一種轉(zhuǎn)錄因子的邏輯門(mén)模型“核糖計(jì)算”系統(tǒng)。由全新設(shè)計(jì)的部件組成，通過(guò)可預(yù)測(cè)和可設(shè)計(jì)的堿基配對(duì)規(guī)則運(yùn)行，減少擴(kuò)散介導(dǎo)的信號(hào)損失，降低代謝成本，并提高電路可靠性。其將RNA 設(shè)計(jì)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)不夠緊密的“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，而可以與環(huán)中一段RNA 完全互補(bǔ)配對(duì)的一段RNA 稱為反義RNA，有反義RNA 存在時(shí)設(shè)計(jì)的RNA 不形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)而與其結(jié)合表達(dá)熒光信號(hào)。將幾種環(huán)狀結(jié)構(gòu)“串聯(lián)”即可形成OR 邏輯門(mén)，將其“并聯(lián)”即可形成AND 邏輯門(mén)，添加兩段方向相反的反義RNA 即可組成NOT邏輯門(mén)。

3.2.4 基于熒光適配體劈裂的邏輯門(mén) Alam 等［66］提出了二進(jìn)制“Split-Broccoli”系統(tǒng)作為一個(gè)獨(dú)立的RNA 邏輯門(mén)，并作為一個(gè)監(jiān)測(cè)RNA 的設(shè)備在體內(nèi)進(jìn)行RNA 雜交。Split Broccoli 是第一個(gè)在體內(nèi)運(yùn)行的功能性分裂適體系統(tǒng)。Split-Broccoli 系統(tǒng)的兩條自主RNA 鏈被指定為頂部和底部。這兩條鏈都不包含形成功能性西蘭花單體所需的完整序列，而且都不會(huì)折疊成類(lèi)似功能性單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。以這種方式設(shè)計(jì)分裂花椰菜系統(tǒng)，其中只有在存在兩條或兩條底部鏈（輸入）的情況下，才能激活，從而創(chuàng)建一個(gè)能夠完全作為RNA 執(zhí)行和報(bào)告邏輯操作的“AND”門(mén)。

3.3 記憶元件

基于合成生物學(xué)的記憶元件的構(gòu)建一般有兩種方式（圖2-C），例如Kotula 等［67］使用了最常見(jiàn)的一種實(shí)現(xiàn)方式，一個(gè)切換開(kāi)關(guān)，其中阻遏器抑制彼此的表達(dá)，一個(gè)記憶狀態(tài)對(duì)應(yīng)于一個(gè)阻遏器的支配，維持記憶狀態(tài)的反饋回路需要連續(xù)使用能量和材料來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，類(lèi)似于電子電路中的易失性記憶；第二種方法是利用重組酶結(jié)合兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，并將中間的DNA 轉(zhuǎn)化，對(duì)應(yīng)于這兩個(gè)方向的狀態(tài)即使在細(xì)胞死亡后也會(huì)保持。例如Yang 等［64］用不可逆的大型絲氨酸噬菌體（LSTP）整合酶，該整合酶參與介導(dǎo)噬菌體在其同源識(shí)別位點(diǎn)——attB（細(xì)菌）和attP（噬菌體）之間整合和切除到細(xì)菌基因組中，通過(guò)LSTP 整合酶切割、旋轉(zhuǎn)和重新連接DNA，將這些位點(diǎn)放置在相反的方向上，使位點(diǎn)之間的區(qū)域反轉(zhuǎn)，構(gòu)建了一個(gè)能夠記錄211（2 048）種狀態(tài)組合（1.375 bytes 的信息）的存儲(chǔ)陣列。

4 基于合成生物學(xué)的食品安全檢測(cè)系統(tǒng)及商業(yè)化呈現(xiàn)形式

微生物細(xì)胞易于培養(yǎng)，繁殖迅速，代謝相對(duì)簡(jiǎn)單，因此現(xiàn)階段微生物細(xì)胞是合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器的主要細(xì)胞類(lèi)型。近年來(lái)，受到無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的啟發(fā)，合成生物學(xué)“無(wú)細(xì)胞”（Cell-Free）或稱“擬細(xì)胞”生物傳感器被開(kāi)發(fā)出來(lái)，利用細(xì)胞破碎液、細(xì)胞抽提液或人工配制的細(xì)胞模擬液作為合成生物學(xué)基因回路的工作環(huán)境。

4.1 微生物細(xì)胞傳感系統(tǒng)

工程化大腸桿菌基因背景清楚，質(zhì)粒工具和基因編輯工具豐富，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)成本低，相對(duì)安全?；蚪M簡(jiǎn)化的大腸桿菌可以進(jìn)一步減少背景基因的干擾，降低潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，提高細(xì)胞傳感器的工作效率［68］。大腸桿菌的生存環(huán)境較為廣泛，在一般的樣品環(huán)境下可以完成檢測(cè)功能，但在一些較為特殊的檢測(cè)環(huán)境，或者對(duì)食品安全性要求較高的檢測(cè)環(huán)境下，大腸桿菌并非最佳選擇。選用樣品中原始存在的菌株作為傳感器的底盤(pán)細(xì)胞，可能更加有利于檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。（1）在土壤樣品的污染物檢測(cè)中，除了大腸桿菌，還可以選用一些土壤原生菌株，包括農(nóng)桿菌［56］、希瓦氏菌［53］、假單胞菌［69］、腸桿菌［55］、羅爾斯通氏菌［70］等。（2）在發(fā)酵產(chǎn)品的原位實(shí)時(shí)檢測(cè)中，可以選用發(fā)酵菌株，如莽草酸發(fā)酵過(guò)程中利用谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）構(gòu)建細(xì)胞傳感器［71］，麥納醌發(fā)酵過(guò)程中利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）構(gòu)建細(xì)胞傳感［72］，柚皮素發(fā)酵過(guò)程中利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）構(gòu)建的細(xì)胞傳感器［73］。

4.2 擬細(xì)胞傳感系統(tǒng)

擬細(xì)胞傳感系統(tǒng)的建立主要涉及細(xì)胞破碎以獲取細(xì)胞提取液的過(guò)程，常見(jiàn)的細(xì)胞破碎方法包括冰浴超聲破碎、球磨破碎、液氮破碎、電激破碎等。在破碎后的提取液中，加入人工構(gòu)建的帶有合成生物學(xué)基因回路的質(zhì)粒以及必要的補(bǔ)充物質(zhì)，即可構(gòu)建成擬細(xì)胞傳感體系［74］。與微生物細(xì)胞傳感系統(tǒng)相比，擬細(xì)胞傳感系統(tǒng)打破了細(xì)胞界限，突破了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的限制，這為其帶來(lái)了以下的優(yōu)勢(shì)：首先，省去了待測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的過(guò)程，提升了檢測(cè)效率；其次，可以更容易地實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)體系離子環(huán)境的調(diào)控，對(duì)于某些在細(xì)胞內(nèi)較難應(yīng)用的生物元件或方法，如體外篩選的適配體、細(xì)胞內(nèi)易被降解核酸元件，以及基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、CRISPR-Cas9 的交叉方法等［75］，在擬細(xì)胞傳感系統(tǒng)中更加容易應(yīng)用；再次，對(duì)于一些具有遺傳毒性、氧化應(yīng)激毒性的有毒靶標(biāo)物質(zhì)，擬細(xì)胞傳感器受到的影響相對(duì)較小，毒性抗性更強(qiáng)。然而完整細(xì)胞體系的破壞，也導(dǎo)致了細(xì)胞傳感器的一些傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)的喪失，如擬細(xì)胞傳感器生產(chǎn)成本的提升，對(duì)檢測(cè)環(huán)境變化的抵抗能力較差等?？傊?xì)胞傳感器和擬細(xì)胞傳感器各具優(yōu)勢(shì)，在今后有可能形成兩條不同的發(fā)展路線。

4.3 商業(yè)化呈現(xiàn)形式

基于合成生物學(xué)的細(xì)胞或擬細(xì)胞傳感器具有成本低，抗干擾能力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，安全可靠等優(yōu)勢(shì)，因此理論上很適合在食品安全現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。若要構(gòu)建可商業(yè)化的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，必須將合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器在一定平臺(tái)上進(jìn)行呈現(xiàn)?？膳c合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器對(duì)接的便攜式平臺(tái)有試管（圖3-A）、口罩（圖3-B、E）、手環(huán)（圖3-C）、可穿戴設(shè)備（圖3-D）、試紙（圖3-F）、芯片［76］等。大部分合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器在研發(fā)階段是在試管中進(jìn)行的，在商業(yè)化應(yīng)用中，細(xì)胞或擬細(xì)胞傳感系統(tǒng)可以凍干后儲(chǔ)存在試管中，在使用時(shí)通過(guò)加水活化，加入預(yù)處理的待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞傳感器和擬細(xì)胞傳感器也可以凍干固定化在濾紙、消化纖維素膜等紙基材料中制備食品安全檢測(cè)試紙條，使用時(shí)將樣品與稀釋液混合，滴加在試紙條上進(jìn)行檢測(cè)［77］，與試管相比，試紙條成本更低、更加便攜和安全。最近，Nguyen 等［78］報(bào)道了將細(xì)胞或擬細(xì)胞傳感器整合到輕質(zhì)、柔性底物和紡織品中，并利用這些制品做成了手環(huán)、服裝等可穿戴設(shè)備。將合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器整合到可穿戴設(shè)備中，可以擴(kuò)大其對(duì)生理狀態(tài)、疾病狀態(tài)和暴露于病原體或毒素的非侵入性監(jiān)測(cè)的能力。

圖3 基于合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器的商業(yè)化呈現(xiàn)形式Fig.3 Commercial presentation forms of whole-cell biosensors based on synthetic biology

5 總結(jié)與展望

5.1 合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器面臨的挑戰(zhàn)

與其他食品安全快速檢測(cè)方法相比，合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器在檢測(cè)速度上存在劣勢(shì)。以細(xì)菌為底盤(pán)細(xì)胞的傳感器從加樣到讀數(shù)約需要20 min 至數(shù)小時(shí)，而以酵母等真核微生物為底盤(pán)細(xì)胞的傳感器這一過(guò)程需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天。這方面的技術(shù)突破需要依靠合成生物性功能核酸元件的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，例如適配體感應(yīng)元件、RNA 信號(hào)放大元件、熒光適配體報(bào)告元件等。其次，合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器作為一種轉(zhuǎn)基因微生物及其制品，環(huán)境釋放后的生物安全性需要進(jìn)一步保障。在商業(yè)化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用中，傳感器細(xì)胞的基因回路片段很難完全破壞，置于環(huán)境中存在轉(zhuǎn)移并整合到其他微生物基因組內(nèi)的可能性，導(dǎo)致生物安全性風(fēng)險(xiǎn)。這方面的技術(shù)突破需要依靠合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器與納米材料技術(shù)的結(jié)合。再次，合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器在知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面如何保障是其商業(yè)化過(guò)程中需要解決的重要問(wèn)題。購(gòu)買(mǎi)者在得到商業(yè)化合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器產(chǎn)品后，很容易從產(chǎn)品中分離細(xì)胞并自行擴(kuò)增培養(yǎng)，而不會(huì)再次購(gòu)買(mǎi)同類(lèi)產(chǎn)品。這方面的技術(shù)突破可以通過(guò)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的改造，構(gòu)建需要依賴特殊營(yíng)養(yǎng)因子的傳感器細(xì)胞，使購(gòu)買(mǎi)者在無(wú)法得知特殊營(yíng)養(yǎng)因子種類(lèi)的情況下，無(wú)法自行擴(kuò)增培養(yǎng)傳感器細(xì)胞。

5.2 合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器的發(fā)展方向

合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器未來(lái)將向著靶標(biāo)多元化、功能擴(kuò)展化、設(shè)計(jì)智能化的方向發(fā)展。所謂靶標(biāo)多元化，即每個(gè)細(xì)胞傳感器可以檢測(cè)多種靶標(biāo)物質(zhì)，以此大大提高檢測(cè)效率。多元化的實(shí)現(xiàn)，依賴邏輯計(jì)算基因回路將多個(gè)靶標(biāo)信號(hào)的整合，并且需要解決各個(gè)靶標(biāo)的信號(hào)之間的串?dāng)_問(wèn)題。所謂功能擴(kuò)展化，即合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器除了檢測(cè)功能外，還可以通過(guò)讓傳感器細(xì)胞表達(dá)蛋白酶、脂肪酶、植酸酶等以完成食品有機(jī)物消化功能，以及通過(guò)表達(dá)催化靶標(biāo)反應(yīng)的酶完成靶標(biāo)轉(zhuǎn)化功能，通過(guò)這些功能擴(kuò)展，可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器所需的樣品預(yù)處理的過(guò)程。所謂設(shè)計(jì)智能化，是指通過(guò)功能基因元件數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)準(zhǔn)化元件接口，以及自動(dòng)化設(shè)計(jì)工具，完成合成生物學(xué)細(xì)胞傳感器基因回路的智能化、定制化設(shè)計(jì)。