張平,陳美容,馬文杰,陸兆新,呂紫巖,呂鳳霞,趙海珍,別小妹*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 211198)

抗菌脂肽Bacillomycin D屬于伊枯草菌素(Iturin)家族,是一類由枯草芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌等芽胞桿菌屬微生物合成的脂肽類物質(zhì),由脂質(zhì)和脂肽2部分構(gòu)成,脂質(zhì)部分為β-氨基脂肪酸鏈(C11—C17),脂肽氨基酸序列為Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr,2部分通過蘇氨酰-β-氨基鍵連接。Bacillomycin D對黃曲霉菌、赭曲霉菌、匍枝根酶菌等病原真菌具有很強的抑制效果[1-4],有潛力成為高效安全的食品防腐劑,應(yīng)用于食品和糧食的防腐。

Bacillomycin D屬于非核糖體肽,其合成由bmy基因簇控制,包含bmyD、bmyA、bmyB和bmyC4個基因[5]。在bmyC編碼的Bmy C亞基C末端含有1個硫酯酶TE結(jié)構(gòu)域,屬于α/β水解酶家族,能斷裂多肽載體蛋白(PCP)和?；肿又g的共價硫脂鍵[6],負(fù)責(zé)環(huán)脂肽中間體的環(huán)化和水解。TE結(jié)構(gòu)域具有典型的Ser-His-Asp催化三聯(lián)體,Asp對His殘基有穩(wěn)定作用,通過His接受Ser羥基的質(zhì)子H,Ser作為親核試劑?；钚晕稽c區(qū)域上方有1個lid 區(qū)域,作用是控制底物與活性位點的結(jié)合,以防止不需要的底物結(jié)合[6],此外lid結(jié)構(gòu)域還可以根據(jù)底物寡聚程度而采用多種構(gòu)象,并最終控制環(huán)化[7]。

TE結(jié)構(gòu)域具有區(qū)域特異性、化學(xué)特異性和立體特異性[6]。目前針對大環(huán)內(nèi)酯TE結(jié)構(gòu)域的研究大多集中于在TE結(jié)構(gòu)域的底物特異性和晶體結(jié)構(gòu)表征:體外表達(dá)gramicidin S合成酶中的迭代雙模塊體系PCP-TE,具有二聚化和三聚化活性,但隨著底物肽鏈長度的不斷增加,PCP-TE的二聚化和三聚化反應(yīng)能力降低[8]。Liu等[9]分析了PCP-TE的晶體結(jié)構(gòu),指出疏水作用力介導(dǎo)了兩結(jié)構(gòu)域結(jié)合的相互作用,而?；?TE中間體的結(jié)構(gòu)表征[10]有利于確定假定的氧陰離子空穴存在,并證明了TE結(jié)構(gòu)域中l(wèi)id 區(qū)域與底物的相互作用。非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)具有模塊化生物合成規(guī)則,有利于對其進行改造,增強其生物催化特性或天然產(chǎn)物多樣性。Niquille等[11]對酪氨酸合成途徑中識別L-Phe的A結(jié)構(gòu)域進行隨機突變與高通量篩選,篩選出的A結(jié)構(gòu)域能以近天然的特異性和效率接受和處理底物(S)-β-Phe。Steiniger等[12]依次使用cyclosporine合成途徑中的模塊2、4、7和10取代了ennitain和bassianolide生物合成途徑中的第2個模塊,生成了新型環(huán)脂肽類似物。但是關(guān)于Bacillomycin D合成酶系及其TE結(jié)構(gòu)域的研究國內(nèi)外鮮見報道。

本試驗對硫脂酶TE結(jié)構(gòu)域進行前移,在體內(nèi)改變其在Bacillomycin D合成酶系中的位置,構(gòu)建新的合成酶系,形成一系列截短的Bacillomycin D脂肽類似物,分析其結(jié)構(gòu)和抑菌活性等,明確硫酯酶結(jié)構(gòu)域位移對Bacillomycin D類似物合成的影響,旨在探索合成酶結(jié)構(gòu)修飾與新型抗菌脂肽的合成及構(gòu)效規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株和質(zhì)粒本試驗所用菌株解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)fmbJ、克隆宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、黃曲霉菌(Aspergillusflavus)均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室保藏。克隆宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)JM110 購買自北京全式金生物公司;克隆載體 pMD19-T購買自TaKaRa生物公司,溫敏型質(zhì)粒pKS2由本課題組保存。

1.1.2 工具酶和試劑細(xì)菌基因組提取試劑盒購自美國OMEGA公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;T4DNA連接酶購自大連寶生物公司;氨芐青霉素、紅霉素、卡那霉素及低熔點瓊脂購自上海生工生物工程公司;酵母提取物、胰蛋白胨等購自英國Oxoid公司;其他化學(xué)試劑均為分析純,購自國藥集團公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和溶液配制LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,1 000 mL去離子水。LBS培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入山梨醇91.0 g。種子培養(yǎng)基:牛肉浸膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,1 000 mL去離子水,pH(7.0～7.2)。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g,L-谷氨酸5.0 g,酵母浸膏1.0 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,CuSO4·5H2O 0.15 mg,FeSO4·7H2O 1.2 mg,MnSO45 mg,1 000 mL去離子水,pH7.0。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂20 g,1 000 mL去離子水。電轉(zhuǎn)化液:0.5 mol·L-1海藻糖,0.5 mol·L-1山梨醇,0.5 mol·L-1甘露醇,10%(體積分?jǐn)?shù))甘油。

1.1.4 主要儀器PTC-100TM PCR儀購于MJ Research 公司;電轉(zhuǎn)化儀MicroPulserTM購于Bio-Rad 生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;Ultimate3000 高效液相分析系統(tǒng)購于美國 Dionex 公司;NanoDrop 2000 微量紫外-可見分光光度計購于美國 Thermo 公司;HYG-A全溫?fù)u瓶柜購于太倉實驗設(shè)備廠;Eppendorf 5418 離心機購于德國 Eppendorf 公司;G2-XS-QTof高分辨液相質(zhì)譜購于Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組整合質(zhì)粒pKS2-M5-TELong和pKS2-M6-TELong的構(gòu)建根據(jù)B.amyloliquefaciensfmbJ全基因組序列,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計PCR反應(yīng)特異引物,序列見表1,由金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 用于質(zhì)粒構(gòu)建的PCR引物Table 1 Primers for plasmids construction

參照OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取B.amyloliquefaciensfmbJ基因組DNA,以基因組DNA為模板,分別采用M5-TELong-U-F/R擴增上游同源臂M5-TELong-U;采用M5-TELong-D-F/R擴增下游同源臂 M5-TELong-D,上、下游同源臂有部分序列同源。以上述同源臂為模板,重疊延伸PCR擴增目的基因,進行TATA克隆,獲得T-M5-TELong質(zhì)粒;同理獲得T-M6-TELong質(zhì)粒,送蘇州金唯智生物科技有限公司測序驗證。

將測序正確的質(zhì)粒和溫敏型質(zhì)粒pKS2進行SalⅠ和KpnⅠ雙酶切處理,瓊脂糖凝膠電泳后回收目的基因和線性pKS2片段,采用T4DNA連接酶進行連接,構(gòu)建重組整合質(zhì)粒。測序驗證后,轉(zhuǎn)入E.coliJM110,獲得可用于電轉(zhuǎn)化的去甲基化重組整合質(zhì)粒,pKS2-M5-TELong和pKS2-M6-TELong。

1.2.2 解淀粉芽胞桿菌前移菌株fmbJ-M5-TELong和fmbJ-M6-TELong的構(gòu)建制備B.amyloliquefaciensfmbJ電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞和電轉(zhuǎn)化的具體過程參照文獻(xiàn)[13]。溫敏型質(zhì)粒pKS2介導(dǎo)的同源重組過程參照文獻(xiàn)[14],將經(jīng)PCR和測序驗證正確的重組突變菌株-80 ℃保存,并分別命名為fmbJ-M5-TELong和fmbJ-M6-TELong。

1.2.3 抗菌脂肽Bacillomycin D類似物的HPLC和MS分析將原始菌株fmbJ以及突變菌株活化后的單菌落,接種于種子培養(yǎng)基,在37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)生長期,按照5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基,33 ℃、180 r·min-1發(fā)酵培養(yǎng)120 h后即得發(fā)酵粗提液。Bacillomycin D提取方法參照Qian等[2]的方法進行,高效液相色譜(HPLC)檢測條件和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)條件參照Gong等[1]的方法進行。

1.2.4 抗菌脂肽Bacillomycin D類似物抑菌試驗將黃曲霉菌接種PDA培養(yǎng)基,于 30 ℃ 培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子。加入5 mL無菌生理鹽水,清洗孢子,用血球計數(shù)板調(diào)整孢子懸液濃度至 1×106mL-1。添加1 mL孢子懸液至50 ℃左右的PDA中,倒入平板中,晾干后打孔,加入50 μL Bacillomycin D類似物粗提液,以甲醇作為對照,30 ℃培養(yǎng)48～72 h,觀察并記錄抑菌圈大小。

1.2.5 TE結(jié)構(gòu)域前移對PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域的影響與預(yù)測采用AlphaFold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://colab.research.google.com/github/deepmind/alphafold/blob/main/notebooks/AlphaFold.ipynb)對結(jié)構(gòu)域前移菌株和野生菌株的Bacillomycin D合成酶末端的PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)構(gòu)象進行預(yù)測,利用Ligplot+軟件[15]分析PCP-TE結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌突變菌株fmbJ-M5-TELong和fmbJ-M6-TELong的構(gòu)建

通過溫敏型質(zhì)粒pKS2參與的兩步法同源重組敲除Bacilomycin D pKS/NRPS合成酶系末端2個模塊(8 540 bp)和最后1個模塊(4 563 bp),將負(fù)責(zé)環(huán)化和水解的硫酯酶結(jié)構(gòu)域TE分別前移至模塊5末端和模塊6末端,改造后的合成酶系見圖1。

兩步法同源重組雙交換后,平板法篩選出在抗生素平板上不能生長但在無抗性平板能夠生長的抗生素敏感菌株,分別以M5-TELong-U-F/R和M6-TELong-U-F/R為引物對進行PCR驗證。圖2-A中,泳道2、3和泳道5～7有略低于2 000 bp的條帶,產(chǎn)物測序驗證為前移菌株fmbJ-M5-TELong;泳道1、4和8無條帶,為回復(fù)型突變菌株。圖2-B中,泳道1、2和泳道4～6有略低于2 000 bp的條帶,產(chǎn)物測序為前移菌株fmbJ-M6-TELong;泳道3和7沒有條帶,為回復(fù)型突變菌株。

圖1 Bacillomycin D合成酶系中硫酯酶結(jié)構(gòu)域TE前移示意圖[5,16]Fig.1 A schemmatic represention of thioesterase domain TE forward in Bacillomycin D synthetases[5,16] A. 原始的Bacillomycin D合成酶Natural Bacillomycin D synthetases;B. TE結(jié)構(gòu)域前移至模塊6末端后的Bacillomycin D合成酶Bacillomycin D synthetases after TE moved forward to the end of module 6;C. TE結(jié)構(gòu)域前移至模塊5末端后的Bacillomycin D合成酶Bacillomycin D synthetases after TE moved forward to the end of module 5.

圖2 抗生素敏感菌株菌落的PCR凝膠電泳檢測Fig.2 Gel electrophoresis detection of colony PCR of antibiotic sensitive strain M.2000 DNA marker;A. Lane 1-8:fmbJ-M5-TELong抗生素敏感菌株Antibiotic sensitive strains of fmbJ-M5-TELong;B. Lane 1-7:fmbJ-M6-TELong抗生素敏感菌株Antibiotic sensitive strains of fmbJ-M6-TELong.

2.2 抗菌脂肽Bacillomycin D類似物的HPLC-MS分析

突變菌株fmbJ-M5-TELong和fmbJ-M6-TELong發(fā)酵粗提液HPLC檢測結(jié)果顯示,突變菌株產(chǎn)物的保留時間與fmbJ一致,初步推測為截短的Bacilomycin D類似物(圖3)。高分辨率LC-ESI-MS/MS檢測結(jié)果顯示,在fmbJ-M5-TELong發(fā)酵粗提液中,檢出了預(yù)測的Bacilomycin D衍生脂肽(線性五肽和環(huán)狀五肽)的分子量,通過MS/MS分析進一步確定了上述Bacilomycin D衍生脂肽的結(jié)構(gòu)(表2)。以線性五肽離子分子量(m/z)861.5為母離子進行MS/MS 碎片離子分析(圖4),肽鍵斷裂后形成b-和y-這2種電荷離子,從實際檢測到的b-和y-離子分子量確定了母離子分子量為861.5的脂肽的肽端部分為Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu,脂肪酸鏈部分為含有14個碳的β-NH2脂肪酸,分子式為C41H64O12N8。此外還檢測出母離子峰分子量875.5,與之前的線性五肽分子量間相差14,是由C15的脂肪酸鏈組成的線性五肽同系物。母離子m/z843.5和857.5與線性五肽的分子量相差18,選取母離子m/z843.5進行MS/MS分析,由生成的二級碎片特征離子峰227.102 6、617.365 4和212.103 2,確定其結(jié)構(gòu)為環(huán)狀五肽C14β-NH2FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu),分子式為C41H62O11N8。

圖3 突變菌株產(chǎn)物的HPLC檢測Fig.3 HPLC detection of products of mutant strains1～4.發(fā)酵產(chǎn)物的色譜峰Chographic peaks of fermentation products.

表2 從突變菌株中檢測到的 Bacillomycin D衍生新型脂肽Table 2 Novel Bacillomycin D derivatives detected in crude extracts isolated from mutants

圖4 環(huán)狀脂五肽離子m/z為843.5(A)和線性脂五肽離子m/z為861.5(B)的MS/MS碎片離子分析Fig.4 MS/MS fragment ion analysis of the cyclic pentapeptide at m/z 843.5(A)and linear pentapeptide at m/z 861.5(B)

突變菌株fmbJ-M6-TELong發(fā)酵粗提液中,檢測出m/z948.5、962.5、976.5、990.6,m/z分別相差14,依次為C14、C15、C16和C17的同系物,以m/z948.5為母離子進行MS/MS分析(圖5),b-特征離子峰340.257 8→503.321 5→617.362 7→697.393 4→843.457 5,y-特征離子峰332.145 0→446.188 4→609.250 3,由此確定肽端為Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser,脂肪酸鏈部分為含有14個碳的β-NH2脂肪酸,分子式為 C44H69O14N9,此外還檢測出了m/z902.5、916.5、930.5、958.5和972.5,與線性六肽相差18,以m/z930.5為母離子,由生成的二級碎片特征離子峰341.143 8、590.354 9,確定其結(jié)構(gòu)為環(huán)狀脂六肽C14β-NH2FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser),分子式為C44H67O13N9。

圖5 環(huán)狀六肽離子m/z為930.5(A)和線性六肽離子m/z為 948.5(B)的 MS/MS 碎片離子分析Fig.5 MS/MS fragment ion analysis of the cyclic hexapeptide at m/z 930.5(A) and linear hexapeptide at m/z 948.5(B)

2.3 抗菌脂肽Bacillomycin D類似物抑菌效果

如圖6所示:fmbJ-M5-TELong發(fā)酵合成的線性五肽和環(huán)狀五肽Bacillomycin D類似物的抑菌圈直徑(22.89±0.20)mm顯著大于fmbJ的抑菌圈直徑(21.05±0.18)mm,但隨著黃曲霉的生長,抑菌效果逐漸變差,圈內(nèi)出現(xiàn)部分菌絲,不能完全抑制黃曲霉菌的生長;fmbJ-M6-TELong發(fā)酵合成的線性六肽和環(huán)狀六肽抗菌脂肽類似物的抑菌圈直徑(23.91±0.28)mm大于fmbJ和 fmbJ-M5-TELong合成的脂肽類似物,但抑菌效果也隨著黃曲霉菌的生長逐漸降低。綜上所述,盡管新型脂肽前期的抑菌圈直徑顯著大于天然Bacillomycin D,但是后期并不能完全抑制。

2.4 TE結(jié)構(gòu)域前移對PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域的影響

TE結(jié)構(gòu)域前移至模塊5和模塊6末端后,Bacillomycin D合成酶末端的PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域相對構(gòu)象發(fā)生變化。如圖7所示:PCP蛋白由4個α-螺旋和1個短螺旋(4個氨基酸)構(gòu)成,TE蛋白則由7個α-螺旋和7個β-折疊構(gòu)成,此外,天然的PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域蛋白中TE結(jié)構(gòu)域的第1個β-折疊能被正確預(yù)測,而TE前移后的雙結(jié)構(gòu)域中TE蛋白在第1個本應(yīng)是β-折疊處顯示為loop區(qū)域。使用Ramachandran plot法[17]對3個PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)進行評估,圖8顯示了3個結(jié)構(gòu)模型中α-C原子和N原子間的二面角φ以及α-C原子和羰基C原子間鍵的二面角ψ的分布情況,M7-PCP-TE、M6-PCP-TE和M5-PCP-TE中分別有99.7%、100%和99.3%的φ和ψ二面角分布在合理區(qū)域內(nèi),均屬于正常分布,且可信度較高。

圖6 fmbJ(A)、fmbJ-M5-TELong(B)和fmbJ-M6-TELong(C)發(fā)酵產(chǎn)物抑菌圖譜Fig.6 Antibacterial spectrum of fermentation products of fmbJ(A),fmbJ-M5-TELong(B) and fmbJ-M6-TELong(C)

圖7 Bcillomycin D合成酶末端PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)比對示意圖Fig.7 Schematic diagrams of three-dimensional structure comparison of PCP-TE didomains at the end of Bcillomycin D synthases A.M7-PCP-TE和M5-PCP-TE示意圖Diagrams between M7-PCP-TE and M5-PCP-TE;B. M7-PCP-TE和M6-PCP-TE示意圖Diagrams between M7-PCP-TE and M6-PCP-TE.

圖8 PCP-TE三級結(jié)構(gòu)的拉氏構(gòu)象圖Fig.8 Ramachandran plots of three-dimensional structure of PCP-TE A. M7-PCP-TE的拉氏構(gòu)象圖Ramachandran plots of M7-PCP-TE;B. M5-PCP-TE的拉氏構(gòu)象圖Ramachandran plots of M5-PCP-TE;C. M6-PCP-TE的拉氏構(gòu)象圖Ramachandran plots of M6-PCP-TE.

使用Ligplot+軟件分析天然的模塊7末端的PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域之間的相互作用力,如圖9-A所示,包括α2PCP/α3PCP和β1TE/α1TE之間的疏水作用力,α2PCP和TE結(jié)構(gòu)域lid regions(α5TE/α6TE)之間的疏水作用力,PCP結(jié)構(gòu)域上His48和TE結(jié)構(gòu)域上Asp119形成的一個鹽橋相互作用;當(dāng)TE結(jié)構(gòu)域前移至模塊5末端時,PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域之間的相互作用見圖9-B,包括α2PCP和TE結(jié)構(gòu)域lid regions(α5TE/α6TE)之間的疏水作用力,α3PCP和β1TE/α1TE之間的疏水作用力。PCP結(jié)構(gòu)域上Thr36和TE結(jié)構(gòu)域上Ser217形成的一個氫鍵相互作用;當(dāng)TE結(jié)構(gòu)域前移至模塊6末端時,只有α2PCP和TE結(jié)構(gòu)域lid regions(α5TE/α6TE)之間的疏水作用力與PCP結(jié)構(gòu)域上Ser30和TE結(jié)構(gòu)域上Tyr209形成的一個氫鍵相互作用(圖9-C)。綜上所述,硫酯酶TE易位前后,PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域蛋白的相對構(gòu)象發(fā)生變化,雙結(jié)構(gòu)域之間的相互作用力也隨之變化,但α2PCP和TE結(jié)構(gòu)域lid regions(α5TE/α6TE)之間的疏水作用力無明顯差異,表明此疏水作用是維系PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)和功能的主要作用力。

3 討論

非核糖體肽合成方式廣泛存在于細(xì)菌和真菌中,合成一些具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物,如達(dá)托霉素、表面活性劑、環(huán)孢菌素A等,相當(dāng)多的天然產(chǎn)物為大環(huán)化合物,化學(xué)合成此類物質(zhì)難度較大,而NRPS具有酶復(fù)合物-亞單位-模塊-結(jié)構(gòu)域的分級結(jié)構(gòu)[18],其模塊化生物合成邏輯和共線性規(guī)則激發(fā)了研究人員對其結(jié)構(gòu)域和模塊重新編程的熱情[19-20],設(shè)計新的NRPS裝配線,以建立無法化學(xué)合成的新化合物庫。位于NRPS裝配線末端的TE結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)水解和環(huán)化中間產(chǎn)物,形成線性或大環(huán)產(chǎn)物,有研究指出TE結(jié)構(gòu)域的N-端延伸結(jié)構(gòu),即天然的PCP-TE-linker,是聯(lián)系PCP結(jié)構(gòu)域和TE結(jié)構(gòu)域的有效通訊工具[21],對維持TE蛋白穩(wěn)定性和正確執(zhí)行相應(yīng)水解或環(huán)化功能有不可或缺的作用。

本研究采用組合生物學(xué)方法對Bacillomycin D合成酶進行改造,將TE結(jié)構(gòu)域分別前移至模塊5和模塊6的末端,同時保留了天然的module7-PCP-TE-linker。在突變菌株fmbJ-M5-TELong和fmbJ-M6-TELong發(fā)酵液中,分別檢出了截短的新型脂肽,線性脂五肽(C14-15β-NH2FA-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)和線性脂六肽(C14-17β-NH2FA-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser)。產(chǎn)生線性脂肽的原因可能是水分子作為親核試劑捕獲acyl-O-TE中間產(chǎn)物并進行水解作用,而水解作用很大程度上取決于肽底物的立體化學(xué)和空間特征[22]。同時,我們還在突變菌株發(fā)酵液中檢測出了截短的環(huán)狀脂五肽[C14-15β-NH2FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)]和環(huán)狀脂六肽[C12-14,16-17β-NH2FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser)]。這與環(huán)脂肽 Plipastatin的NRPS復(fù)合酶系中TE結(jié)構(gòu)域的易位結(jié)果相一致[21],Bacillomycin D合成酶系中TE結(jié)構(gòu)域能夠識別新合成酶系的末端底物氨基酸:谷氨酸(Glu)和絲氨酸(Ser),催化它們與脂肪酸鏈的β-NH2形成酰胺鍵,從而生成環(huán)狀脂五肽和脂六肽。同時也表明了相較于高選擇性的A結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域[12,23],TE結(jié)構(gòu)域具有一定的底物耐受性。研究表明,硫酯酶TE的體外表達(dá)可有效催化Skyllamycin B 底物類似物進行環(huán)化反應(yīng)[24],Surugamide生物合成途徑中的硫酯酶SurE更是能夠環(huán)化來自2條不同NRPS裝配線的結(jié)構(gòu)不相似的底物,體現(xiàn)了SurE廣泛的底物耐受性[25],本文結(jié)果與之相同。上述結(jié)果表明,硫酯酶TE前移后,Bacillomycin D合成酶仍能夠合成新型脂肽,TE結(jié)構(gòu)域的底物耐受性則可能是新NRPS合成酶系仍保留脂肽合成功能的原因之一。

除了TE結(jié)構(gòu)域的底物耐受性,本研究還從蛋白質(zhì)相互作用角度探討了硫酯酶易位后Bacillomycin D合成酶系仍具有脂肽合成功能的原因。對M5-PCP-TE、M6-PCP-TE和M7-PCP-TE這3個預(yù)測結(jié)構(gòu)模型進行分析比較,原始合成酶末端的M7-PCP-TE之間的疏水相互作用與前人研究基本一致[9];硫酯酶TE易位后,PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域的相對構(gòu)象和蛋白間相互作用都發(fā)生變化,但α2PCP與TE結(jié)構(gòu)域lid regions(α5TE/α6TE)之間的疏水作用力一直存在,是維系PCP-TE雙結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)和功能的主要作用力,也可能是新NRPS合成酶系仍保留脂肽合成功能的原因之一。研究表明原本與C結(jié)構(gòu)域相互作用的PCP結(jié)構(gòu)域在新NRPS裝配線中不能有效地與TE結(jié)構(gòu)域相互作用[26],而本研究中模塊5和模塊6中PCP結(jié)構(gòu)域均能與TE結(jié)構(gòu)域建立起有效的通訊,合成新型脂肽。此外,本研究還觀察到硫酯酶TE易位縮小了PCP-TE之間的疏水作用界面,對NRPS合成酶復(fù)雜空間構(gòu)象造成了較大程度的干擾,這也從側(cè)面解釋了硫酯酶易位后的Bacillomycin D合成酶合成大環(huán)產(chǎn)物的能力下降。研究人員對此提出了交換單元Xus[27]和XUCs[28]的概念,精準(zhǔn)定位交換接頭的保守基序[19,29],以保持受體和供體單位之間的蛋白質(zhì)相互作用,最小化鏈延長期間復(fù)雜構(gòu)象變化的干擾,并保持聚酮合成酶系PKS和非核糖體肽合成酶系NRPS的整體結(jié)構(gòu)[30]。

Bacillomycin D具有兩親性,能有效抑制病原真菌,破壞其脂質(zhì)雙分子層,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性、流動性和完整性發(fā)生變化,從而使細(xì)胞質(zhì)成分外泄,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[31]。本研究中,硫酯酶易位后產(chǎn)生的Bacillomycin D衍生物,并不能完全抑制黃曲霉的生長,除了新型衍生物產(chǎn)量低外,推測原因還可能是:一方面為線性脂五肽和線性脂六肽的空間結(jié)構(gòu)較為靈活,未經(jīng)環(huán)化作用將其限制在生物活性構(gòu)象中,而與線性脂肽相比,環(huán)狀脂肽具有更高的特異性和親和力,其蛋白水解抗性也更強[32];另一方面為絲氨酸和蘇氨酸都是極性氨基酸,硫酯酶TE前移后,環(huán)肽的空間構(gòu)象發(fā)生較大變化,天然Bacillomycin D的親水面遭到破壞,而親水區(qū)負(fù)責(zé)與細(xì)胞膜的磷脂相結(jié)合[33],關(guān)系著環(huán)肽的生物活性,所以環(huán)狀脂五肽和脂六肽無法完全破壞黃曲霉菌孢子和菌絲體的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜[1]。

綜上所述,本研究將Bacillomycin D合成酶系末端的TE結(jié)構(gòu)域分別前移至模塊5和模塊6末端,新NRPS合成酶系仍能合成Bacillomycin D類似物,TE結(jié)構(gòu)域的底物耐受性與其易位前后PCP-TE之間一直存在的疏水相互作用是新NRPS合成酶系仍保留脂肽合成功能的原因,可圍繞TE結(jié)構(gòu)域進一步探索合成酶結(jié)構(gòu)修飾與新型抗菌脂肽的合成及構(gòu)效規(guī)律。