周語桐,楊 英*,李衛(wèi)華,張?zhí)锾?吳 亮，程志龍

(安徽建筑大學(xué) a.環(huán)境與能源工程學(xué)院，b.水污染控制與廢水資源化安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601)

0 引言

胞外聚合物 (Extracellular Polymeric Substances,EPS)是指細胞在新陳代謝時分泌的復(fù)雜高分子混合物，成分和微生物的胞內(nèi)物質(zhì)類似，主要是多糖、蛋白質(zhì)和核酸等高分子聚合物。除細胞與水分以外，EPS是活性污泥的第3種重要組成部分，約占活性污泥總有機質(zhì)的50% ～ 90%[1]。細胞外高分子具有疏水性，不但可以與陽離子相結(jié)合，而且對污泥絮凝沉淀和脫水特性也有較大的影響。確定一種有效的提取方法是研究胞外聚合物對污泥性能的影響及分析EPS組成的重要前提。

目前，EPS的提取方法一般有離心法、超聲法、熱萃取法、氫氧化鈉法、EDTA 法、陽離子交換樹脂法、“甲醛+NaOH”法和硫酸法等。超聲法因不會造成二次污染被廣泛使用。該方法可以使水相中的生物絮凝體分散開來，并將大顆粒物破碎分解成小顆粒物[2]，但是提取效率低，只能提取部分EPS。

表面活性劑是一種被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)，可以有效地減少兩相之間的界面張力，具有增溶、潤濕、潤滑、絮凝、分散、抗靜電等諸多特性，可用于分離污泥中的EPS，使細胞的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均發(fā)生改變[3]。表面活性劑增強超聲法是一種常用提取方法，可以大大提高胞外聚合物的提取效率。本文將以表面活性劑增強超聲法提取污泥胞外聚合物，并與超聲法和表面活性法進行對比分析，旨在為未來廢物資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

活性污泥取自合肥經(jīng)濟開發(fā)區(qū)廢水廠中的二次沉淀池，呈深褐色，從污水廠取回實驗室后應(yīng)立即進行EPS提取。

1.2 試驗儀器

試驗用儀器包括：電子分析天平(AS 220.RS，RADWAG公司)；超聲波清洗儀(GTSONIC-D20，廣東固特超聲股份有限公司)；恒溫震蕩箱(ZQTY-70S，上海知楚儀器有限公司)；冷凍高速離心機(FC-18R，廣州市方統(tǒng)生物科技有限公司)；水浴鍋(HH-S2，常州萬達升實驗儀器有限公司)；紫外-可見光分光光度計(UV-1800，日本島津制作所)。

1.3 試驗方法

取30 mL污泥樣品,在3 220 g的離心力下離心10 min后倒掉上清液，再分別加入含0，3，6，9，12，15 g NaCl的重懸液恢復(fù)至原體積。磷酸鹽緩沖液為40 mL 0.1 moL/L NaH2PO4·2H2O和60 mL 0.1 moL/L Na2HPO4·12H2O。

試驗過程中采用的提取方法有：①超聲法，將重新懸浮后的污泥放置于槽式超聲波清洗儀中進行超聲；②表面活性劑法，向重新懸浮后的污泥中添加不同的表面活性劑，再放置于恒溫震蕩箱中以200 r/min的轉(zhuǎn)速分別震蕩0，15，30，45，60 min；③表面活性劑增強超聲法，向重新懸浮后的活性污泥中添加表面活性劑，以200 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫震蕩箱中震蕩1 h，再進行超聲。提取結(jié)束后,將所有樣品置于冷凍離心機中，在10 000 g的條件下離心15 min,再采用0.45 μm的水系濾膜過濾清液，并檢測多糖、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)。

1.4 分析方法

用蒽酮-硫酸比色法測定多糖含量，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；采用考馬斯亮藍G250法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；采用二苯胺法測定DNA，小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。所有樣品測定3次，取平均值為最終測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相環(huán)境對EPS提取效果的影響

NaCl投加量對EPS各組分提取效果的影響如圖1所示。由圖1可知，NaCl的投加量對EPS各組分的提取效果影響很大。投加9 g NaCl時，EPS的提取量最高。當(dāng)NaCl投加量在3～9 g時，隨著投加量增大，多糖與蛋白質(zhì)提取量也在不斷增加；而超過9 g時，多糖與蛋白質(zhì)的含量均下降。DNA提取量隨著投加量增大而緩慢增加。因此，重懸液確定為投加量為9 g NaCl的PBS溶液，不僅能確保細胞始終處于相對完整的狀態(tài)，也能促進EPS釋放。

圖1 NaCl投加量對EPS各組分提取效果的影響

2.2 表面活性劑對EPS提取效果的影響

表面活性劑對EPS各組分提取效果的影響如圖2所示。由圖2可知，添加表面活性劑可有效提高EPS提取量。其中，添加CTAB的EPS提取量最高，尤其是多糖的提取量提升最為顯著，其次是SDS。這是由于EPS和二價陽離子均對生物的絮凝作用有顯著影響。吐溫對提高EPS各組分的提取量的作用雖然最低，但其DNA含量卻高于SDS，并且這3種表面活性劑的DNA含量都顯著高于空白組，說明高濃度的表面活性劑有可能導(dǎo)致細胞破裂。因此，采用CTAB提取EPS。

圖2 表面活性劑對EPS各組分提取效果的影響

2.3 CTAB投加量對EPS提取效果的影響

CTAB投加量對EPS各組分提取效果的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著CTAB投加量從4 mg增加到48 mg，多糖和蛋白質(zhì)的提取量大幅度提升；而當(dāng)投加量繼續(xù)提升至60 mg時，多糖的提取量增加緩慢，蛋白質(zhì)提取量基本不變。其原因在于，較高濃度的表面活性劑對細胞的破壞程度較大，使胞內(nèi)的物質(zhì)(蛋白質(zhì)、酸性多糖)被提取出來，又由于其自身具有絮凝作用而部分沉淀在污泥中。隨著CTAB投加量增加，DNA提取量不斷上升，說明更高濃度的表面活性劑對細胞的破壞程度更大，胞內(nèi)物質(zhì)可能會污染EPS。綜合考慮，確定投加48 mg CTAB提取EPS。

圖3 CTAB投加量對EPS各組分提取效果的影響

2.4 提取時間對EPS提取效果的影響

提取時間對EPS各組分提取效果的影響如圖4所示。

圖4 提取時間對EPS各組分提取效果的影響

由圖4可知，在0～45 min時，CTAB對多糖和蛋白質(zhì)的提取量均隨著時間增加而增加；提取時間達到45 min時,EPS的提取量達到最高值;提取時間繼續(xù)增加到60 min時，EPS提取量下降。這是因為部分EPS的提取只有在厭氧的條件下才能正常進行，EPS在長時間震蕩的情況下會與氧氣充分接觸，無法達到厭氧條件。此外，隨著時間增加，DNA的提取量先逐步上升，在30～60 min時始終保持穩(wěn)定狀態(tài)。綜合考慮確定CTAB的最佳提取時間為45 min。Fr?lund等[4]曾提出EPS最佳提取時間為0.5～1 h，此時細胞裂解的風(fēng)險最低。

2.5 提取方法對EPS提取效果的影響

提取方法對EPS各組分提取效果的影響如圖5所示。由圖5可知，表面活性劑聯(lián)合超聲波法對EPS的提取量高于超聲波法和表面活性劑法。這是由于表面活性劑中的親水和疏水基團具有降低界面間表面張力的作用，從而導(dǎo)致超聲的空化現(xiàn)象增加。一般認為，降低表面張力能夠有效提升超聲波的處理效果，降低超聲過程的能耗。

圖5 提取方法對EPS各組分提取效果的影響

2.6 超聲條件對EPS提取效果的影響

超聲條件對EPS各組分提取效果的影響如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)提取功率相同時,隨著作用時間從2 min增加到10 min,多糖和蛋白質(zhì)的提取量均有所上升。這是由于隨著時間增加,在超聲波作用下部分大顆粒物的粒徑因水力剪切作用變小,從而使溶解度提高。當(dāng)作用時間相同時,隨著提取功率增加,多糖和蛋白質(zhì)的提取量雖略有增加，但是總體趨勢趨于平緩。這表明高的超聲功率與表面活性劑的交叉相關(guān)性較差。因為超聲波的功率越大,消耗的能量越大,考慮到能量損耗,最后確定最佳提取功率為100 W。在功率為100 W時，時間越長，EPS提取量越高,但是在2～5 min之間,DNA的提取量變化較為穩(wěn)定,繼續(xù)增加到10 min時,DNA的提取量急劇上升。這是因為超聲波作用時間越長,細胞的受損程度越大,細胞內(nèi)的DNA更容易泄露出來。綜合考慮,超聲條件確定為100 W，5 min。

圖6 超聲條件對EPS各組分提取效果的影響

3 紅外光譜與熒光光譜分析

3.1 紅外光譜分析

不同方法提取的活性污泥EPS的紅外光譜如圖7所示。

圖7 不同方法提取的活性污泥EPS的紅外光譜

3.2 熒光光譜分析

不同方法提取的EPS的三維熒光光譜如圖8所示。提取的EPS主要包含酪氨酸、色氨酸類蛋白質(zhì)、腐殖酸和富里酸。3種方法所提取的EPS在物質(zhì)濃度以及熒光特性上存在區(qū)別。其中，表面活性劑法不能對腐殖酸和富里酸進行有效提取。超聲法和表面活性劑增強超聲法均含有色氨酸特征峰、腐殖酸特征峰和富里酸特征峰，表面活性劑聯(lián)合超聲法的光譜圖中還出現(xiàn)了酪氨酸特征峰，表明此種方法對酪氨酸的提取優(yōu)于超聲法。表面活性劑聯(lián)合超聲法提取EPS的熒光強度最高，表面活性劑法熒光強度次之，超聲法熒光強度最弱。

(a) 表面活性劑法 (b) 表面活性劑聯(lián)合超聲法 (c) 超聲法圖8 不同方法提取的EPS的三維熒光光譜

4 結(jié)論

表面活性劑增強超聲法EPS提取量最高，提取組分最全面。添加CTAB后，EPS的提取量高于添加其他表面活性劑，且其最佳投加量為48 mg，最佳提取時間為45 min；在超聲功率為100 W，有效超聲時間為5 min的優(yōu)化條件下使用CTAB表面活性劑會使提取效率提高。