周羽晗，袁榕穗，蔣受軍，段玉林，邊賀東

（1.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，廣西 南寧 530021）

膠原蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是許多生物體體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)之一。膠原蛋白的主要功能是提供機(jī)體的結(jié)構(gòu)支撐，維持組織的穩(wěn)定性和彈性[1]。在組織和器官中，膠原蛋白主要存在于骨骼、關(guān)節(jié)、肌肉、皮膚、血管、角膜等組織中。此外，膠原蛋白還能作為一種信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)于維持正常的生理功能和機(jī)體的整體健康具有重要的作用[2]。

膠原蛋白在醫(yī)學(xué)、保健和美容領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，膠原蛋白被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)，用于修復(fù)組織缺損和創(chuàng)傷[3]；在保健領(lǐng)域，膠原蛋白被用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病；在美容領(lǐng)域，膠原蛋白被廣泛應(yīng)用于護(hù)膚、美容、減肥等方面。

總之，膠原蛋白對(duì)于機(jī)體的正常生理功能和健康具有重要的作用，重組膠原蛋白的應(yīng)用不僅可以改善人類(lèi)健康和生活質(zhì)量，還可以促進(jìn)醫(yī)療保健和美容產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，形成新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。對(duì)于膠原蛋白的研究和應(yīng)用具有重要的意義。

1 重組膠原蛋白的背景和發(fā)展歷程

1.1 重組膠原蛋白的背景

膠原蛋白是一種在人體內(nèi)廣泛存在的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它在維持人體組織形態(tài)、保持身體健康方面起著非常重要的作用。但是，受到人體的生理和外部環(huán)境等因素的影響，膠原蛋白可能會(huì)受到破壞和損傷，導(dǎo)致身體各種組織器官的功能受到影響，甚至引發(fā)一些疾病。因此，對(duì)膠原蛋白的重組研究具有非常重要的意義[4]。

1.2 重組膠原蛋白的發(fā)展歷程

初期研究階段：20 世紀(jì)50 年代至70 年代初期。人們開(kāi)始對(duì)膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，但受到技術(shù)限制，研究進(jìn)展緩慢。70 年代初期，人們開(kāi)始嘗試通過(guò)體外重組的方式來(lái)制備膠原蛋白。但是，由于制備過(guò)程中需要大量的膠原蛋白和高昂的成本，以及技術(shù)限制，這一階段的研究成果有限[4]。

基因工程技術(shù)應(yīng)用階段：20 世紀(jì)80 年代至90 年代初期。這一階段，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始嘗試通過(guò)重組DNA 技術(shù)來(lái)制備膠原蛋白。通過(guò)基因工程技術(shù)[4]，可以將目標(biāo)基因插入到表達(dá)載體中，并在表達(dá)宿主中表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。這一階段的研究取得了重要進(jìn)展，使得膠原蛋白的體外重組成為可能。此外，還發(fā)展了多種重組膠原蛋白表達(dá)系統(tǒng)，并對(duì)重組膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了深入研究。

應(yīng)用拓展階段：21 世紀(jì)初至今。隨著生物技術(shù)和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域得到了廣泛拓展[4]。

2 重組膠原蛋白的制備和檢測(cè)方法

2.1 重組膠原蛋白的制備方法

2.1.1 基于原核表達(dá)系統(tǒng)的制備方法

唐云平等通過(guò)在大腸桿菌中將類(lèi)人膠原蛋白基因與人脯氨酰-4-羥化酶（P4H）和D-阿拉伯-1，4-內(nèi)酯氧化酶（ALO）共表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)羥基化類(lèi)人重組膠原蛋白，并且研究了5 種不同的培養(yǎng)基以及誘導(dǎo)條件對(duì)該蛋白可溶性表達(dá)的影響。該方法制備周期短、成本低，適用于制備規(guī)模較小的重組膠原蛋白。但由于重組膠原蛋白的復(fù)雜性較高，可能會(huì)存在結(jié)構(gòu)和功能的問(wèn)題。重組膠原蛋白傳統(tǒng)提取法生產(chǎn)主要是利用酸、堿水解法從羊皮、牛皮、魚(yú)、豬皮等中提取，由于蛋白質(zhì)的復(fù)雜性較高提取過(guò)程中會(huì)或多或少喪失其部分的生物活性，并且提取產(chǎn)品成分非常復(fù)雜。文獻(xiàn)中提到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)還具有原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后的加工修飾體系不完善、產(chǎn)生的致熱原使膠原蛋白難以應(yīng)用于臨床等,也使得表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。此外，國(guó)外雖然早就在真核系統(tǒng)中表達(dá)出多種膠原蛋白，但很少有在原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)膠原蛋白或其片段進(jìn)行表達(dá)的報(bào)道，所以這也是我們需要努力的方向。

2.1.2 基于真核表達(dá)系統(tǒng)的制備方法

該方法可以制備較高質(zhì)量的重組膠原蛋白，并且可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的復(fù)雜修飾。構(gòu)建含有Ⅵ型膠原蛋白基因的真核表達(dá)載體，并使其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，為深入研究Ⅵ型膠原蛋白的活性功能及其生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。漆佳麗等構(gòu)建鼠Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（COL1A1）C 端甘氨酸重復(fù)序列的真核表達(dá)載體，探究其與成纖維細(xì)胞(Rat-1)的相互作用。為研究Ⅰ型膠原蛋白在成纖維細(xì)胞表面上的受體復(fù)合物奠定了基礎(chǔ)。

2.1.3 基于化學(xué)合成的制備方法

本法提供了一條快速、高效的蛋白質(zhì)制備途徑，同時(shí)它能方便地引入非天然氨基酸改變碳鏈骨架以及進(jìn)行其他化學(xué)修飾來(lái)提高蛋白質(zhì)活性構(gòu)建新的蛋白。Kumar V 等利用36 個(gè)氨基酸殘基膠原，模擬多肽自組裝設(shè)計(jì)膠原納米纖維，研究發(fā)現(xiàn)，自組裝膠原納米纖維具有三螺旋結(jié)構(gòu)，這種人工合成仿生膠原纖維具有促進(jìn)愈合的作用，可用于止血。但它也有缺點(diǎn)：成本較高，需要較高的技術(shù)水平和設(shè)備條件，同時(shí)蛋白質(zhì)的修飾也存在一定限制。

2.2 重組膠原蛋白的檢測(cè)方法

2.2.1 SDS-PAGE 法

何越等用SDS-PAGE 方法對(duì)微生物發(fā)酵并經(jīng)純化獲得的膠原蛋白進(jìn)行電泳鑒別，上樣質(zhì)量濃度為1 g/L，上樣量10 μL，同時(shí)點(diǎn)樣Marker，樣品直接恒壓90 V 跑到底，之后采用染色液染色1 h，脫色液處理3 h，觀察電泳條帶情況。純化后獲得的重組膠原蛋白具有較高的純度，表達(dá)量高說(shuō)明所用的發(fā)酵體系膠原表達(dá)高效、穩(wěn)定。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低，所以取發(fā)酵上清液做SDS-PAGE 鑒定，培養(yǎng)基1 中目的蛋白表達(dá)量最高，條帶最粗，說(shuō)明此培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量最高。同樣為探究目的蛋白表達(dá)的最適甲醇誘導(dǎo)濃度，同理制備SDS-PAGE 電泳樣品電泳檢測(cè)，使用凝膠成像軟件分析表明甲醇誘導(dǎo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，條帶最粗。那治國(guó)等為了檢測(cè)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)運(yùn)用SDS-PAGE 觀察圖譜，一條在α 鏈97.2 kDa 處，另一條在116 kDa 附近出現(xiàn)兩條條帶，由鏈和鏈泳帶顏色的深淺及光密度可以大致推斷兩者含量，由此推斷膠原蛋白分子是由兩條相同的鏈和一條不同的鏈組成的異源三聚體結(jié)構(gòu)。但該方法不能對(duì)重組膠原蛋白的完整性進(jìn)行判斷。

2.2.2 圓二色譜法

文獻(xiàn)中提到使用蛋白質(zhì)溶液的圓二色譜可以反映出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，得到數(shù)據(jù)后膠原三螺旋結(jié)構(gòu)特征性參數(shù)為正吸收峰與負(fù)吸收峰的比值，膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)完整性與比值呈正相關(guān)，所以說(shuō)明三重螺旋結(jié)構(gòu)完整。此文獻(xiàn)作者將該蛋白樣品按照終質(zhì)量濃度250 mg/mL 溶解于Tris-HCL 溶液后，經(jīng)圓二色譜檢測(cè)，觀察峰的高低變化找到明顯的吸收峰區(qū)得到膠原蛋白的氨基酸殘基中極少含有芳香族氨基酸。但是該方法的成本較高，需要較高的技術(shù)水平和設(shè)備條件，蔡思澤在研究人源Ⅲ型膠原蛋白時(shí)，pPIC9K-COL3-4 菌株的發(fā)酵液進(jìn)行Western Blot 驗(yàn)證，在預(yù)期42 kDa 位置附近有明顯條帶，表明雙串聯(lián)膠原蛋白在畢赤酵母中能夠成功表達(dá)，且能分泌到胞外，但該方法需要特定的抗體，且操作較為繁瑣。

總的來(lái)說(shuō)，選擇合適的方法取決于所需的量和質(zhì)量、設(shè)備條件、操作時(shí)間和成本等因素。

3 重組膠原蛋白的純化

常見(jiàn)的重組膠原蛋白質(zhì)純化技術(shù)包括柱層析其核心是樣品中的不同組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，各組分隨著流動(dòng)相的移動(dòng)而在兩相中進(jìn)行不斷的分配。其種類(lèi)主要分為親和層析、離子交換層析、疏水作用層析以及凝膠層析4 方面。蔡思澤等通過(guò)SDS-PAGE 和western-blot 方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，并根據(jù)表達(dá)量篩選高產(chǎn)菌株。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)硫酸銨沉淀、親和層析純化重組膠原蛋白，進(jìn)而研究了重組膠原蛋白的抗氧化活性。并通過(guò)電鏡觀察膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，為膠原蛋白的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。潘明利通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵的方式來(lái)表達(dá)重組膠原蛋白，并通過(guò)鎳離子柱親和層析及隨后的蛋白質(zhì)透析的方法對(duì)獲得的重組膠原蛋白進(jìn)行分離和純化。為了盡可能采取最少的工藝步驟，來(lái)獲得最大的回收率。朱少瑜用畢赤酵母表達(dá)重組人白細(xì)胞介素11（rhIL-11）的純化生產(chǎn)工藝和以特寶rhIL-11（特爾康）的純化生產(chǎn)工藝為對(duì)比，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是相同的。王皓等使用柱層析技術(shù)在重組試驗(yàn)采用Ni Sepharose6Fast Flow 樹(shù)脂親和層析進(jìn)行純化，取收集的洗脫液進(jìn)行SDSPAGE 電泳，并用洗脫Buffer 做空白對(duì)照，純化后得到了目的蛋白經(jīng)軟件分析可知其純度＞90%，為重組膠原蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，純化時(shí)費(fèi)用偏高，純化費(fèi)用占總生產(chǎn)成本的20%～30%。因此，在進(jìn)行蛋白純化工藝的設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)根據(jù)自己實(shí)際情況來(lái)選擇合適的柱層析種類(lèi)。

4 重組膠原蛋白的多方面應(yīng)用

重組膠原蛋白可以作為皮膚再生和修復(fù)的生物材料，用于治療各種皮膚損傷和疾病，如燒傷、創(chuàng)傷、疤痕、痤瘡等。它可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)皮膚的再生和修復(fù)，改善皮膚的外觀和質(zhì)量。劉講嬌研究重組膠原蛋白貼敷料將其應(yīng)用于術(shù)后皮膚修復(fù)使皮膚屏障功能、創(chuàng)面恢復(fù)時(shí)間、舒適度這幾方面取得了一些實(shí)際效果，并在酵母重組膠原蛋白貼敷料中加入甘油能夠增加敷料的黏性，可提升患者舒適度。

重組膠原蛋白可用于骨折愈合、關(guān)節(jié)置換、脊柱融合等骨科手術(shù)中，促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖和骨組織的形成。張珊珊構(gòu)建大鼠5mm 顱骨缺損模型，采用CT、MRI 等儀器對(duì)顱骨缺損模型進(jìn)行分析觀察，結(jié)果表明重組膠原蛋白CL 有望作為一種生物醫(yī)用材料用于骨修復(fù)。重組膠原蛋白作為一種生物材料，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。另外，重組膠原蛋白還可以作為心肌修復(fù)的支架材料，用于心肌缺血和心肌梗死的治療。Yang 等利用重組Ⅲ型膠原蛋白制備三維多孔支架及水凝膠材料已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究中。

組織工程是一種利用生物材料、生物活性分子和細(xì)胞等技術(shù)，構(gòu)建組織和器官的新方法。曾斐鴻[5]進(jìn)行了重組Ⅳ-α1 蛋白理化性質(zhì)的初步探究,為重組膠原蛋白Ⅳ-α1 應(yīng)用于組織工程材料打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。重要的是，這是首次通過(guò)HEK293F 細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了膠原蛋白Ⅳ-al 編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的分泌表達(dá)，為重組膠原蛋白Ⅳ-al 應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)和組織工程材料拉開(kāi)了序幕。再生醫(yī)學(xué)是一種利用生物學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，通過(guò)激發(fā)和促進(jìn)組織、器官或整個(gè)身體的自我修復(fù)和再生能力，治療各種疾病的新興醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。李偉娜等為提高重組畢赤酵母發(fā)酵重組人Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量，采用響應(yīng)面對(duì)其生長(zhǎng)階段的BMGY 培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)Placket-Burman 試驗(yàn)使該重組膠原蛋白對(duì)大鼠乙酸灼傷胃黏膜有明顯修復(fù)作用,為生物醫(yī)用材料的應(yīng)用制備奠定了基礎(chǔ)。

總之，重組膠原蛋白在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景，有望為眾多臨床醫(yī)療問(wèn)題提供有效的解決方案。

5 未來(lái)展望和挑戰(zhàn)

隨著人們對(duì)生活品質(zhì)和健康水平要求的提高，重組膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景更是不可限量。但是在應(yīng)用過(guò)程中也面臨一些挑戰(zhàn)和問(wèn)題。其中最主要的挑戰(zhàn)是如何解決重組膠原蛋白的穩(wěn)定性和成本問(wèn)題。重組膠原蛋白在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中易受到熱、光、pH 等因素的影響而發(fā)生變性或降解，從而導(dǎo)致其性質(zhì)和功能的損失。此外，重組膠原蛋白的制備成本也較高，需要進(jìn)一步降低成本以推廣其應(yīng)用。

為了解決這些問(wèn)題，科學(xué)家們正在開(kāi)展一系列的研究。研究人員正在探索使用表面改性、交聯(lián)和包覆等手段來(lái)提高重組膠原蛋白的穩(wěn)定性。同時(shí)，新的生產(chǎn)技術(shù)，如分子印跡、發(fā)酵技術(shù)等，也被引入到制備過(guò)程中，以提高產(chǎn)量和降低成本。

此外，也有研究人員探索使用合成材料替代天然的膠原蛋白。這些合成材料具有更好的穩(wěn)定性和可控性，同時(shí)具有良好的生物相容性，可以有效地替代膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。