宋曉慧，李悝悝，趙秒，李唐*，尹恒

1(大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院，遼寧 大連，116023)2(中科院大連化學(xué)物理研究所 遼寧省碳水化合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連市糖類農(nóng)用制劑工程研究中心，遼寧 大連，116023)

果膠是一種形成植物初生細(xì)胞壁和胞間層的結(jié)構(gòu)多糖[1]，因其結(jié)構(gòu)靈活且具有剛性，能夠保護(hù)植物免受植物病原體的侵害[2]。在食品加工行業(yè)中，原材料中的果膠成分會(huì)在過濾過程中出現(xiàn)結(jié)垢的現(xiàn)象[3]，且不溶性的果膠與細(xì)胞碎片中的蛋白質(zhì)、多糖等成分是導(dǎo)致鮮榨果汁立即變渾濁的主要原因[4-5]。利用生物酶制劑代替膨潤(rùn)土等化學(xué)澄清劑進(jìn)行果汁澄清[6]，不僅可以有效節(jié)約成本，而且可以減少對(duì)環(huán)境的污染和能源的消耗[7]。其中，果膠酶廣泛用于飲料行業(yè)，用于提高提取的收率、果汁澄清及增香等過程。

果膠酶是具有果膠降解能力的一類酶的總稱，其中，果膠裂解酶通過β-消除機(jī)理催化果膠底物裂解，主要降解產(chǎn)物為4,5-不飽和寡聚半乳糖醛酸[8]，同時(shí)不產(chǎn)生劇毒副產(chǎn)物甲醇[9]。果膠裂解酶可以直接作用于高酯化的果膠底物，有效降低溶液黏度[10]，而且不會(huì)干擾為果汁帶來特定香氣的酯含量[11]?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，近年來關(guān)于果膠裂解酶的深入挖掘和工業(yè)應(yīng)用研究，受到研究者的廣泛關(guān)注。

果膠裂解酶根據(jù)其對(duì)果膠底物的偏好性分為果膠裂解酶(pectin lyase，Pnl，EC 4.2.2.10)和果膠酸裂解酶(pectate lyase，Pel，EC 4.2.2.2、EC 4.2.2.9)：果膠裂解酶傾向于裂解甲酯化程度高的果膠底物，又稱多聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(polymethylgalacturonate lyase，PMGL)；果膠酸裂解酶則對(duì)酯化程度低的多聚半乳糖醛酸的偏好性更強(qiáng)，因此又叫做多聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase，PGL)[12]。

果膠裂解酶來源廣泛，大多數(shù)報(bào)道的PGL和PMGL來自于細(xì)菌和真菌等微生物，只有少數(shù)來自于植物和動(dòng)物[2]。天然微生物來源的果膠裂解酶作為各種工業(yè)過程的潛在生物催化劑引起了越來越多的關(guān)注。WU等[13]對(duì)果膠裂解酶的廣泛應(yīng)用進(jìn)行了介紹，指出除了酸性果膠裂解酶在飲料工業(yè)中的應(yīng)用外，堿性且耐高溫的果膠裂解酶可以應(yīng)用于紡織工業(yè)中的棉花的精煉工藝和苧麻脫膠工藝，并且在紙漿加工、果膠廢水預(yù)處理和橄欖油提取方面也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

盡管，近年來針對(duì)果膠裂解酶的報(bào)道很多[14-17]，但面對(duì)全球食品加工行業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大、需求量不斷增加[5]，目前已知的果膠裂解酶仍不能滿足生產(chǎn)需求，因此需要深入挖掘，以獲得兼具成本效益和高度活性的果膠酶制劑。曲霉屬真菌作為重要的果膠酶來源菌株，其基因組中編碼的6個(gè)果膠裂解酶也受到了廣泛關(guān)注[18]，在比較轉(zhuǎn)錄組中各種果膠裂解酶的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)PelF表達(dá)水平僅次于PelA[19]，具有巨大的應(yīng)用潛力。

本研究中利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，克隆表達(dá)了來自曲霉屬菌株Aspergilluscostaricensis的酸性果膠裂解酶PnlF，粗酶經(jīng)親和層析和凝膠過濾色譜進(jìn)行了純化，并測(cè)定了其果膠降解酶活力以及酶學(xué)性質(zhì)，用高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography，HPAEC)分析了其降解產(chǎn)物，為后續(xù)拓展其工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

曲霉屬菌株(Aspergilluscostaricensis)，大連化學(xué)物理研究所1805課題組。大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10菌株，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；畢赤酵母(Pichiapastoris)X-33及表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA，Invitrogen公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基低鹽LB(low salt LB,LLB)、YPD、含山梨醇的YPD(YPD with 1 mol/L sorbitol, YPDS)、BMGY、BMMY均按照Invitrogen公司提供畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)說明書制備。無氨基酸酵母氮源(yeast nitrogen base,YNB)，BD Biosciences公司；生物素，Amresco公司；博萊霉素(Zeocin)，Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、PmeⅠ，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒，美國(guó)Axygen公司；預(yù)染蛋白Marker，MBI Fermentas公司；BM 5000+DNA Marker，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；橘皮果膠，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Ni-NTA resin填料，美國(guó)GE公司；HiLoad 16/600 Superdex 200 pg分子篩，美國(guó)Cytiva公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PL2002電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；CR-22E高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；GenePulserXcellTM電轉(zhuǎn)儀、PowerPac 300蛋白電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；GelDoc-ItTM310紫外凝膠-顯微成像儀，UVP公司；Eon酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰BioTek儀器有限公司；ICS 3000高效液相色譜系統(tǒng)，戴安(中國(guó))有限公司；AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國(guó)GE公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PnlF序列分析及結(jié)構(gòu)模擬

黑曲霉PnlF是一種分泌蛋白，首先利用在線信號(hào)肽預(yù)測(cè)網(wǎng)站(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)對(duì)PnlF的氨基酸序列(GenBank accession No.XP_025536336.1)進(jìn)行了分析，確定了PnlF信號(hào)肽序列的C末端氨基酸殘基，然后將去除信號(hào)肽的蛋白質(zhì)序列利用SWISS-MODEL網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模，獲得的三維結(jié)構(gòu)模型依據(jù)全局模型質(zhì)量評(píng)估(global model quality estimate, GMQE)值和全局定性模型能量分析(QMEANDisCo Global)值進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)。此外，利用CLUSTALW軟件和ESPript在線比對(duì)工具(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)對(duì)PnlF與已知晶體結(jié)構(gòu)的高度同源的PnlF(PDB ID：1QCX、1IDJ)進(jìn)行基于蛋白結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)分析。

1.2.2 重組PnlF表達(dá)載體構(gòu)建

重組PnlF采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行分泌表達(dá)。首先對(duì)PnlF的編碼序列(不含信號(hào)肽)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，以利于其在彼此酵母中表達(dá)。優(yōu)化后的基因序列的N末端添加了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ和6×His蛋白純化標(biāo)簽的編碼序列，在C末端添加了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NotⅠ。通過蘇州金唯智生物科技有限公司對(duì)優(yōu)化后的PnlF編碼基因進(jìn)行了合成，然后通過雙酶切連接的方法插入到pPICZαA質(zhì)粒的EcoRI-NotI位置上。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZαA-AcPnlF轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含有100 μg/mL博萊霉素的LLB平板進(jìn)行篩選，最后通過測(cè)序的方法對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞

挑取活化平板酵母單菌落，接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～18 h，使OD600值達(dá)到1.3，冰上孵育15 min，于4 ℃、2 200 r/min離心5 min，棄上清液，50 mL預(yù)冷的無菌水，振蕩重懸。重復(fù)洗滌2次，2 200 r/min離心5 min，棄上清液，用20 mL預(yù)冷的1 mol/L的無菌山梨醇溶液，重懸菌體，4 ℃、2 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入少量1 mol/L的無菌山梨醇溶液重懸。

取80 μL新鮮制備的酵母感受態(tài)，加入10 μL經(jīng)過PmeⅠ線性化、脫鹽、重懸等處理的重組質(zhì)粒，輕彈混勻，移入電轉(zhuǎn)杯，冰浴5 min。調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀參數(shù)：電壓2 000 V；電阻200 Ω；電容25 μF；脈沖時(shí)間約5 ms，1次電擊。電擊后,馬上在電轉(zhuǎn)杯中加入400 μL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液, 輕微混勻，轉(zhuǎn)移至無菌1.5 mL離心管，28 ℃靜置培養(yǎng)2 h，涂布含有100 μg/mL博萊霉素的YPDS平板(YPDSZ)平板，28 ℃培養(yǎng)3～5 d檢測(cè)單菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4 表達(dá)菌株的篩選與鑒定

YPDSZ平板篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過高濃度博萊霉素抗性(8 mg/mL)平板復(fù)篩。復(fù)篩的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子利用改良的微波法提取基因組，利用載體通用引物AOX進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.5 重組PnlF在畢赤酵母中的異源表達(dá)

高抗性平板上生長(zhǎng)的驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種到裝有100 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600約1.3時(shí)，2 500 r/min離心5 min收集上述菌體，去除上清液，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)入200 mL該培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24 h，向200 mL BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)充1 mL無水甲醇，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)120 h后，12 000 r/min離心30 min收集上清液。12%SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 重組PnlF的Ni-NTA親和純化

經(jīng)過超濾濃縮的發(fā)酵上清液，用平衡緩沖液A(包含50 mmol/L Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、pH 7.8)稀釋4倍后，用于親和純化。50 mL稀釋過的粗酶液，加入緩沖液A平衡過的Ni-NTA層析柱中，通過不斷提高平衡緩沖液中咪唑濃度(20、40、200 mmol/L)進(jìn)行洗脫，收集各步洗脫組分，經(jīng)過12% SDS-PAGE驗(yàn)證純化效果，同時(shí)測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)PnlF活性。

1.2.7 重組PnlF的分子篩純化

將Ni-NTA親和純化獲得的樣品利用10 kDa截留的超濾管濃縮至約1.5 mL，將濃縮的蛋白樣品用0.22 μm濾膜過濾，然后加載到已經(jīng)用平衡緩沖液A平衡好的分子篩上，流速1 mL/min，收集洗脫峰并用SDS-PAGE檢測(cè)純度，同時(shí)測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)PnlF活性。

1.2.8 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法，采用Bradford法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 TBA法測(cè)定重組PnlF活性

參考NEDJMA等[20]提出的TBA檢測(cè)法稍加改良。30 μL 10 g/L果膠溶液50 ℃孵育5 min后，加入2 μL待測(cè)酶液，50 ℃恒溫反應(yīng)15 min，加入30 μL 1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，80 ℃孵育10 min，冷卻至室溫后加入36 μL 1 mol/L HCl酸化反應(yīng)體系，混勻后加入30 μL 0.04 mol/L TBA溶液，80 ℃反應(yīng)10 min顯色，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。酶活力單位定義為：1 min使550 nm紫外吸光值增加0.01所需要的酶量。

1.2.10 重組PnlF的酶學(xué)性質(zhì)表征

在最適pH 5.0條件下，以10 g/L果膠為底物，在不同溫度(20～80 ℃)進(jìn)行酶活力測(cè)定，將50 ℃的PnlF活性定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性，確定酶的最適反應(yīng)溫度；將酶液在上述溫度中孵育30 min，在最適條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定，并和未處理的酶活力進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)酶活性。

在最適反應(yīng)溫度50 ℃條件下，以10 g/L果膠為底物，在pH值為2.0～11.0的不同緩沖液(pH 2.0～3.0：50 mmol/L甘氨酸-HCl；pH 4.0～5.0：50 mmol/L NaAc-HAc；pH 6.0～8.0：50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4；pH 9.0～11.0：50 mmol/L甘氨酸-NaOH)條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定，將pH 5.0條件下的PnlF活性定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性，確定酶的最適反應(yīng)pH值；將酶液在上述pH的緩沖液中稀釋，4 ℃孵育60 h，在最適條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定，并和未處理的酶活力進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)酶活性。

在最適反應(yīng)條件下測(cè)定了終濃度1 mmol/L、10 g/L或0.1%(體積分?jǐn)?shù))的金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)PnlF酶活性的影響，Na+濃度則分別采用50、100、200 mmol/L，并和未處理的酶活力進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)酶活性。

1.2.11 重組PnlF的降解產(chǎn)物分析

以1 mL 10 g/L果膠底物與200 μL酶液的反應(yīng)混合物在37 ℃、180 r/min條件下反應(yīng)24 h。PnlF樣品除去蛋白質(zhì)后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，50 μL反應(yīng)混合物上樣至PA-100色譜柱，流速0.3 mL/min，檢測(cè)器在30 ℃穩(wěn)定。流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：8 mol/L NaOH溶液，流動(dòng)相C：2 mol/L NaAc溶液。洗脫梯度描述如下：1～60 min，V(A)∶V(B)∶V(C)=30∶50∶20和15∶50∶35；60～120 min，V(A)∶V(B)∶V(C)=15∶50∶35和10∶50∶40；120～130 min，V(A)∶V(B)∶V(C)=30∶50∶20。用coularray軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PnlF的多序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)模擬

A.costaricensis來源的PnlF基因(pnlF)共編碼475個(gè)氨基酸殘基，其N末端第1～19個(gè)氨基酸經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測(cè)為信號(hào)肽，去除信號(hào)肽后的蛋白質(zhì)序列的理論分子質(zhì)量(Mw)和等電點(diǎn)(pI)分別為47.3 kDa和5.84。對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank,PDB)的同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)PnlF與同樣來源于黑曲霉的PelA(PDB ID：1IDJ)和PelB(PDB ID：1QCX)序列相似性最高(圖1)，分別為41%和43%。因此，以PelB的三維結(jié)構(gòu)為模板對(duì)PnlF進(jìn)行了同源建模，得到該酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。該模型的GMQE值和QMEANDisCo Global值分別為0.65和(0.77±0.05)，這2個(gè)值都是介于0和1之間，越接近1表示模型質(zhì)量越好，可信度越高。

圖1 PnlF與其結(jié)構(gòu)相似的PelA和PelB的序列比對(duì)Fig.1 Structure based multiple amino acid sequence alignment of PnlF with PelA and PelB

PnlF的結(jié)構(gòu)與PelB非常相似[21]，且同屬于PL1家族[22]。PnlF的結(jié)構(gòu)如圖2所示，主要由β折疊片構(gòu)成，其核心包含3個(gè)平行的β片層，折疊成一個(gè)大的橫截面有凹坑的右手螺旋。在N末端(Phe72-Gly125)，平行β片層結(jié)構(gòu)向外延伸，盤繞成一個(gè)大的右手圓柱體型結(jié)構(gòu)。另外，PnlF在C末端具有一段結(jié)構(gòu)未知的序列(Leu383-Tyr475)，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上屬于無規(guī)卷曲，這段序列被認(rèn)為是不同來源的果膠裂解酶F所特有的[19]。

a-側(cè)面示意圖；b-頂部示意圖圖2 同源建模獲得的PnlF三維結(jié)構(gòu)模型的示意圖Fig.2 Three dimensional structure of PnlF from homology modeling注：蛋白的核心結(jié)構(gòu)域用粉紅色表示，參與構(gòu)成一個(gè)大的右手圓柱體型結(jié)構(gòu)的N末端片段(Phe72-Gly125)(用藍(lán)色標(biāo)記，結(jié)構(gòu)的 N末端和C末端分別用字母進(jìn)行標(biāo)記)

2.2 重組果膠裂解酶PnlF真核表達(dá)菌株構(gòu)建

成功構(gòu)建了果膠裂解酶PnlF酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZαA-AcPnlF，質(zhì)粒圖譜如圖3-a所示。將目標(biāo)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取基因組，然后通過PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化情況，如圖3-b所示，1～5號(hào)菌落均在約1 800 bp位置檢測(cè)到的目的條帶，其中1、3、5號(hào)菌落條帶明亮，表示轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)較高，可以用于下一步誘導(dǎo)表達(dá)。

a-PnlF的表達(dá)載體；b-菌落PCR驗(yàn)證(M-DNA Marker；泳道1～5-挑選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子)圖3 pPICZαA-PnlF的表達(dá)載體和菌落PCRFig.3 Expression vector and Colony PCR of pPICZαA-PnlF

SDS-PAGE分析重組PnlF的表達(dá)情況，如圖4-a(泳道1)所示，發(fā)酵上清液在約50 kDa附近有明顯條帶，隨后對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行PnlF活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該粗酶液中PnlF活力高達(dá)529.7 U/mg。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組的PnlF在畢赤酵母中成功表達(dá)，并在粗酶液中表現(xiàn)出較高的PnlF活力。

a-PnlF各純化步驟的樣品的SDS-PAGE分析(M-蛋白MARKER；1-粗酶液；2-Ni-NTA親和層析后樣品；3-分子篩純化后樣品)；b-PnlF分子篩純化圖譜圖4 PnlF的表達(dá)與純化Fig.4 Expression and purification of PnlF

2.3 重組PnlF的純化與活性分析

由于表達(dá)的PnlF在蛋白序列的N末端帶有6×His純化標(biāo)簽，于是利用Ni-NTA親和凝膠樹脂對(duì)PnlF表達(dá)液進(jìn)行了親和層析，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的蛋白樣品除目標(biāo)條帶外，在34 kDa處有非特異性條帶(圖4-a，泳道2)。最后采用分子篩層析的方法對(duì)樣品進(jìn)一步純化，在81 mL處收集到單一洗脫峰，SDS-PAGE結(jié)果顯示在約50 kDa處有單一條帶(圖4-a，泳道3)，且酶活力達(dá)到536.7 U/mg。表觀分子質(zhì)量(50 kDa)與理論分子質(zhì)量(47.3 kDa)的差異可能是由于N端His純化標(biāo)簽的存在以及蛋白表面的糖基化修飾所導(dǎo)致。詳細(xì)的純化和酶活力回收情況在表1中列出。

表1 重組果膠裂解酶PnlF的純化表Table 1 Purification of recombinant pectin lyase PnlF

2.4 重組PnlF的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 溫度對(duì)PnlF活性的影響

通過測(cè)定PnlF在不同溫度下的酶活力變化，繪制了變化曲線(圖5-a)，試驗(yàn)結(jié)果表明了PnlF的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，并且在40～55 ℃的溫度范圍內(nèi)相對(duì)活性>60%。圖5-b展示了不同溫度條件下酶的穩(wěn)定性，在20 ℃條件下孵育30 min，PnlF的活力下降了20%；當(dāng)孵育溫度提高至30 ℃時(shí)，殘余酶活力降低至50%；當(dāng)孵育溫度提高至40 ℃及以上時(shí)，殘余的PnlF活力降低至10%以下。

a-溫度對(duì)PnlF活性的影響；b-PnlF的熱穩(wěn)定性圖5 溫度對(duì)PnlF活性的影響及該酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on pectinase activity and its thermal stability

由于天然產(chǎn)生Pnl的微生物存在于各種環(huán)境中，Pnl在較寬的溫度范圍內(nèi)(30～70 ℃)均有活性[23]。對(duì)比文獻(xiàn)報(bào)道，PnlF較其他天然來源的酸性Pnl溫度穩(wěn)定性低，無花果曲霉來源的酸性Pnl在20～40 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定[24]；黑曲霉來源的Pnl能在43 ℃，60 min內(nèi)維持80%以上活性，但在50 ℃，20 min就喪失了70%的活性[17]。

2.4.2 pH對(duì)PnlF活性的影響

如圖6-a所示PnlF的最適反應(yīng)pH為5.0，是一種酸性Pnl，當(dāng)pH>6或pH<4時(shí)，酶活力明顯下降。該酶的pH穩(wěn)定性如圖6-b所示，其在pH 5～6的弱酸性條件下較為穩(wěn)定，4 ℃孵育60 h仍保持60%以上的裂解酶活力。

a-pH對(duì)PnlF活性的影響；b-PnlF的pH穩(wěn)定性圖6 pH值對(duì)PnlF活性的影響及pH穩(wěn)定性Fig.6 Effect of pH on pectinase activity and its pH stability

Pnl的最適反應(yīng)pH的條件決定了其在工業(yè)應(yīng)用中的適用范圍，如紡織和紙漿工業(yè)加工一般在堿性條件下運(yùn)行，而飲料加工則在酸性條件下[13]。黑曲霉來源的PNL-ZJ5處理蘋果果汁時(shí)，蘋果汁黏度比對(duì)照降低了38.8%，透光率提高了86.3%[17]。PnlF在酸性條件下較為穩(wěn)定，表明該酶可能適合用于飲料加工業(yè)。

2.4.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)PnlF的影響

金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)PnlF的影響如表2所示。

表2 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)PnlF活性的影響Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the enzyme activity of PnlF

PnlF的活性可以被多數(shù)金屬陽(yáng)離子激活，包括1 mmol/L Co2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+等二價(jià)金屬陽(yáng)離子。而Li+、Na+、K+等一價(jià)陽(yáng)離子也可以在一定程度上提高PnlF的活力，而且Na+對(duì)PnlF活性的促進(jìn)作用隨離子濃度的提高而增強(qiáng)。相反，Ag+、Cu2+、Mn2+、Fe3+4種過渡態(tài)金屬離子強(qiáng)烈抑制PnlF的活性，同樣抑制PnlF活性的還有離子型去垢劑SDS、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，以及常見的蛋白酶活性抑制劑苯甲磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)。有趣的是EDTA作為金屬離子螯合劑對(duì)PnlF的活性并未產(chǎn)生抑制作用，這表明PnlF的催化活性是非金屬依賴的，但是可以被多種金屬離子所激活，EDTA的存在有利于清除溶液中抑制PnlF活性的金屬離子，對(duì)該酶起到保護(hù)作用。此外，還原劑二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)和β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，β-ME)在1 mmol/L的濃度下對(duì)PnlF的活性有少量的促進(jìn)作用，這意味著較低濃度的還原劑并不能破壞該酶結(jié)構(gòu)上的二硫鍵，反而可以通過還原反應(yīng)清除溶液中的氧化物金屬離子，對(duì)PnlF起到保護(hù)作用。非離子型去垢劑吐溫-20對(duì)PnlF的影響較小。

不同的離子對(duì)不同來源的Pnl影響存在差異，與PnlF類似，黃曲霉MTCC 7589來源的堿性Pnl受到Co2+和Mn2+的促進(jìn)，被Ag+和Cu2+完全抑制。而黑曲霉來源的酸性Pnl能夠被Mg2+、Ca2+、Fe3+等激活，同時(shí)受到Ni2+、Zn2+的抑制[17]。

2.5 重組PnlF的產(chǎn)物分析

此外，PnlF降解果膠得到的產(chǎn)物利用配有脈沖檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD)進(jìn)行了檢測(cè)分析。如圖7所示，在pH 5.0時(shí)，使用PnlF處理1 mg/mL的商品化果膠12 h，產(chǎn)物在線性洗脫至30 min后，出現(xiàn)規(guī)律的降解產(chǎn)物峰，根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)PnlF降解產(chǎn)物偏好性的研究[19]，推測(cè)32 min洗脫的果膠寡糖聚合度為3，而且產(chǎn)生的降解產(chǎn)物聚合度分布較廣(3～9)。

圖7 PnlF酶解果膠產(chǎn)物的HPAEC-PAD分析Fig.7 HPAEC-PAD analysis of the pectin hydrolysate

但目前對(duì)于PMGL降解產(chǎn)物的分析較少，黑曲霉來源的Pnl在降解橘皮果膠時(shí)，含有2個(gè)甲酯取代的半乳糖醛酸三聚體(gA3m2)和3個(gè)甲酯取代的半乳糖醛酸三聚體(gA3m3)，是降解過程中的主要產(chǎn)物，PnlF表現(xiàn)出了對(duì)不同乙?；潭鹊木酆隙葹?產(chǎn)物的耐受性，而且在降解過程中高聚合度(6～7)的產(chǎn)物很少[19]。

3 結(jié)論

該文實(shí)現(xiàn)了黑曲霉來源的PnlF在畢赤酵母X-33細(xì)胞中的異源分泌表達(dá)，相較于文獻(xiàn)報(bào)道利用黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行黑曲霉來源的PnlF過表達(dá)的研究[18-19]，酵母體系下PnlF的表達(dá)更加穩(wěn)定，表達(dá)量高。

PnlF的分子質(zhì)量是黑曲霉編碼的5種Pnl中最大的，全長(zhǎng)蛋白約50 kDa；相較于對(duì)多聚半乳糖醛酸的降解，PnlF更傾向于降解復(fù)雜的果膠底物，因此應(yīng)當(dāng)屬于PMGL。經(jīng)過純化的PnlF比活力達(dá)到536.7 U/mg。目前已知的活性最高的Pnl(EC 4.2.2.10)的報(bào)道，是邊緣假單胞菌來源的1株P(guān)nl，純化后比活力高達(dá)1 502 U/mg，該數(shù)據(jù)是通過檢測(cè)235 nm紫外吸光值變化測(cè)得的[25]。PnlF的反應(yīng)最適溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為5.0，屬于酸性Pnl，而且pH在5～6的弱酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定。Ca2+和Mg2+可以大幅度提高PnlF的裂解酶活力；而Ag+和Cu2+則會(huì)嚴(yán)重抑制其活力；此外SDS、TritonX-100、PMSF等化學(xué)試劑對(duì)該酶活性的抑制作用較強(qiáng)。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，PnlF具有相對(duì)較高的最適反應(yīng)溫度、酸堿穩(wěn)定性，具有一定的工業(yè)應(yīng)用的潛在價(jià)值。PnlF的產(chǎn)物分析表明其降解果膠的產(chǎn)物聚合度分布較廣，PMGL作為一類內(nèi)切酶，在生產(chǎn)具有不同聚合程度的單糖和低聚糖方面具有巨大的潛力[2]。

重組PnlF的溫度穩(wěn)定性較差，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，下一步可以通過提高酶自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高對(duì)溫度的耐受，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用。