牛乃琪，蘇艷芳，楊 曼，侯欣華，王立剛，張龍超

(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

脊椎動物胚胎發(fā)育從一個單細胞到一個獨立的個體，是通過高度復雜而又協調的機制在時間和空間上共同發(fā)揮作用的，其中一個關鍵階段就是脊椎軸向骨骼的形成。在胚胎發(fā)育過程中，體節(jié)是軸向骨骼形成的前提，最初的體節(jié)是由中胚層分化形成，并在形態(tài)上是相似的，但它們具有沿體軸方向的解剖學特征。最終形成具有復雜特征的枕骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎[1-3]。在物種內每個域中的椎骨數量是固定的，但在物種之間每個域中的椎骨數量各不相同，從而產生了特定于物種的軸向公式[4]。而豬是為數不多的胸、腰椎數可變的經濟動物之一[5]。豬胸、腰椎總數與胴體性狀相關性較強，研究表明隨著胸、腰椎數的增加，胴體長[6]和胴體重[7]也隨之增加。

體節(jié)作為脊椎形成最重要的前體結構，在形成過程中受到多個基因及基因家族的調節(jié)，包括時鐘基因Hes7[8]和Lfng[9]，以及Hox基因家族[10]等。其中Homeobox(Hox)基因在組織特性規(guī)范中起關鍵作用，其表達受到嚴格的時間調控，賦予了軸向特性，還可以控制肢芽的位置，形成側板中胚層，因此，Hox基因的表達指定了解剖學上不同的脊柱亞型[2]。Hox基因被認為在脊椎動物胚胎發(fā)生過程中參與前后軸(a-p)模式[11]，在生物體的軸向發(fā)育模式中起著重要作用[12]。哺乳動物有將近40個Hox基因家族成員，分成4個簇：HoxA、HoxB、HoxC和HoxD，這些基因的形成主要是通過祖先簇的重復以及隨后的基因丟失或重復引起[13]。Hox基因具有相似的序列和相對位置被劃分為13個組，13組基因在簇內的位置具有功能相關性，反映了基因在前后軸上的時間和空間表達順序，這一特征稱為共線性[14]。脊椎動物的Hox簇在組中是緊湊的，具有統(tǒng)一的轉錄方向，共線Hox基因的激活被翻譯成沿軸的空間表達模式[15]。其中HoxB簇基因在不同發(fā)育階段和多個組織中的表達存在空間共線性[16]。HoxB簇基因共包含10個基因(HoxB1-9和HoxB13)。前期本團隊對北京黑豬進行GWAS和GO富集分析將HoxB1-7、HoxB9和HoxB13作為影響脊椎數的候選基因[17]。

北京黑豬是1960年由巴克夏、大白和中國地方豬種雜交形成的一個培育豬種[18]，在北方豬肉市場中占有重要地位，但是北京黑豬在Hox基因多態(tài)性與性狀的關聯分析方面未見報道。本研究對HoxB簇中9個基因所有外顯子區(qū)進行PCR及測序檢測突變位點并將其與表型進行關聯分析，以期探索影響性狀變異候選基因功能位點，為性狀變異遺傳機理的闡釋奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗群體

北京黑豬群體均飼養(yǎng)在北京黑六牧業(yè)科技有限公司，共251頭個體，所有豬健康狀況良好。管理方式和飼喂方式均一致。251頭北京黑豬于220日齡在北京二商集團有限責任公司進行屠宰，在屠宰中收集其組織樣本并記錄脊椎數和胴體性狀(胴體長、胴體斜長、胴體直長和胴體重)。

1.2 DNA提取及檢測

使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進行組織樣品的DNA提取，使用IMPLEN超微量分光光度計進行DNA質量檢測(DNA濃度、核酸與蛋白及酚類物質最高吸收峰的吸收波長比值(OD260 nm/OD280 nm)、核酸與碳水化合物最高吸收峰的波長比值(OD260 nm/OD230 nm)的檢測)，并用2%瓊脂糖凝膠進行DNA質檢，檢測合格的DNA樣品用于后期試驗。

1.3 引物設計及合成

本試驗的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設計，引物序列均由賽默飛(ThermoFisher)合成。本研究設計9個基因(HoxB1 (ENSSSCT0000 0019086.4)、HoxB2 (ENSSSCT00000019087.4)、HoxB3 (ENSSSCT00000019088.4)、HoxB4 (EN SSSCT00000019089.5)、HoxB5 (ENSSSCT00000 019094.5)、HoxB6 (ENSSSCT00000019093.5)、HoxB7 (ENSSSCT00000019092.4)、HoxB9 (ENS SSCT00000101474.1)、HoxB13 (ENSSSCT00-000019095.5))共45對引物，其中檢測到SNPs的引物有6對(表1)。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 聚合酶鏈式反應(PCR)

使用諾唯贊(Code：P505-d1，Vazyme)的高保真酶進行PCR，本試驗對251頭北京黑豬個體采用25 μL反應體系(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL 聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，8.5 μL 無菌水，1 μL 模板)進行PCR。程序如下(ABI, Singapore)：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產物通過切膠回收單一條帶在北京六合華大基因科技有限公司平臺進行雙向Sanger測序。

1.5 基因分型及數據統(tǒng)計分析

將測序結果使用SeqMan進行基因分型，使用Microsoft Excel 2016進行基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計。采用SAS軟件的GLM程序，以基因型為固定效應，采用單因素方差分析(ANOVA)分析基因型效應。動物模型如下:Y=μ+基因型+e，其中Y為表型值，μ為共同均值，e為隨機誤差。采用Duncan’s多重檢驗估計不同基因型間最小二乘均值(LSM)的差異。數據使用“平均值±標準誤”表示，P<0.05判定為差異顯著。

2 結 果

2.1 北京黑豬脊椎數和胴體性狀的表型統(tǒng)計

251頭北京黑豬個體的表型值(脊椎數和胴體性狀)見表2，脊椎數的均值為20.95節(jié)，變異系數為2.67%；胴體長的均值為98 cm，變異系數為5.19%；胴體直長的均值為89.74 cm，變異系數為4.83%；胴體斜長的均值為76.06 cm，變異系數為4.38%；胴體重的均值為64.37 kg，變異系數為12.47%。

表2 脊椎數和胴體性狀的表型值統(tǒng)計Table 2 Statistics of phenotypic values of the vertebral number and carcass traits

2.2 北京黑豬HoxB1-7、HoxB9和HoxB13基因的多態(tài)性檢測及基因型頻率和等位基因頻率分析

通過對HoxB簇中9個基因的mRNA序列進行變異位點檢測共發(fā)現12個SNPs(表3)均在UTR區(qū)，其中1個5′UTR突變(HoxB2)，11個3′UTR突變分別在HoxB5、HoxB9、HoxB13中(表3)。這12個突變位點的等位基因頻率變化范圍為4%～96%，其基因型頻率變化范圍為1%～93%。

表3 北京黑豬HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of HoxB2, HoxB5, HoxB9 and HoxB13 in Beijing black pigs

2.3 北京黑豬HoxB1-7、HoxB9和HoxB13基因的12個SNPs與脊椎數和胴體性狀的關聯分析

本研究將HoxB簇中的9個基因通過PCR擴增及變異檢測篩選到12個(1個HoxB2基因5′UTR，2個HoxB5基因3′UTR，2個HoxB9基因3′UTR，7個HoxB13基因3′UTR)SNPs與脊椎數和胴體性狀進行關聯分析，結果見表4。HoxB2上的1個5′UTR突變c.40 C>T、HoxB5上的2個3′UTR突變c.1766 A>G、c.1767 A>G與性狀關聯不顯著；HoxB9上的2個3′UTR突變中c.2743 C>T與胴體性狀關聯顯著，其中CT基因型對應的胴體性狀有優(yōu)勢，而c.2254 A>G與性狀關聯不顯著；HoxB13上的7個3′UTR突變中c.1863 G>A、c.1440 A>C與脊椎數性狀顯著關聯，兩個位點中AA基因型對應的脊椎數更有優(yōu)勢，而c.1736 G>A、c.1444 G>C、c.1433 A>C、c.1310 A>G及c.1221 G>A與性狀關聯不顯著。

表4 HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13基因5個SNPs與脊椎數和胴體性狀的關聯分析Table 4 The association analysis of 5 SNPs of HoxB2,HoxB5,HoxB9 and HoxB13 genes with vertebral number and carcass traits

3 討 論

豬的脊椎數作為一個高遺傳力的有重要經濟價值的優(yōu)良性狀，一直以來都受到研究者的高度青睞。研究者利用QTL定位和GWAS技術在豬的多個經濟性狀進行檢測，發(fā)現了大量的QTLs[19]。豬QTL數據庫共記錄34 333個QTLs(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index，2021年12月27日)，其中對于脊椎數的研究顯示，QTLs主要集中在SSC1和SSC7上，而對于胴體長和胴體重每條染色體上都存在QTL。Mikawa等[20]通過對3個F2群體進行最小二乘區(qū)間映射分析，發(fā)現SSC1和SSC7上存在與脊椎數相關的QTL。大量的研究表明，影響脊椎數變異的QTL主要集中在SSC7上[21]。對于胴體性狀也進行了大量的QTL定位和GWAS研究，發(fā)現QTL在SSC7上也有定位[22-24]。但在北京黑豬的GWAS結果中除了SSC7上出現了經典的QTL以外，在SSC12上出現了一個新的QTL，并且在QTL中定位到了HoxB簇的9個基因為影響脊椎數變異的候選基因[17]。

每簇的3′端Hox基因首先表達，而更多的5′端Hox基因在稍后時間表達，這種現象被稱為“時間共線性”[25]。Hox基因在動物胚胎發(fā)育過程中調節(jié)軸向區(qū)域特征，最初在原腸胚形成期間被激活。HoxB 簇包含10個基因，HoxB1-9和HoxB13。HoxB簇基因中缺失90 kb的小鼠表現出一系列有序的沿頸椎和胸椎柱的單節(jié)前部同源異位轉化以及胸骨形態(tài)發(fā)生缺陷[26]。在雞胚中，對HoxB簇基因的研究表明，HoxB1-3基因均在原始條紋附近表現出更高水平的表達，而在周圍細胞中表達水平逐漸降低[16]；HoxB5基因表達模式與其他HoxB簇基因顯著不同，它始于后原始條紋，隨后沿條紋向前延伸；HoxB8基因沿原始條紋和Hensen節(jié)點表達，偶爾以不對稱方式表達；且HoxB9與HoxB8基因表達非常相似。研究表明，HoxB9基因在Alpha5 亞基缺陷小鼠的胚胎中表達減少，Alpha5beta1纖連蛋白的互作對于中胚層衍生物的維持以及某些神經嵴細胞的存活至關重要，影響了中胚層的發(fā)育[27]。并且HoxB9基因還對體節(jié)發(fā)育中胸腔的形成以及前肢的發(fā)育有重要作用[28-30]。HoxB13基因在主動終止沿前后軸的后延伸中至關重要[31-34]。此外，HoxB13基因敲除對于小鼠體節(jié)的增加有顯著影響[35]。同時將其啟動子進行過表達，發(fā)現小鼠胚胎缺失大部分甚至全部尾巴[31]。因此，先前大量的研究均表明Hox家族在發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，從原腸胚形成階段開始，到胚胎前后軸的形成、肢體發(fā)育以及器官形成都起到關鍵作用[15，30，36-37]。因此，本研究對北京黑豬SSC12上HoxB簇的9個基因進行多態(tài)性分析，發(fā)現在mRNA的5′和3′UTRs存在SNPs。其中，有個通常高度保守的從幾個到幾百個核苷酸不等的3′UTRs[38]。儲存在3′UTRs中的遺傳信息可以通過3′UTRs介導的蛋白質互作(PPI)的形成傳遞給蛋白質[39]。高度保守的序列特征表明3′UTRs具有重要的調控作用，如mRNA的定位、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯等占有重要地位；另一方面，3′UTRs存在異構體，可以用來區(qū)分高度相似的蛋白質功能[40]。

先前對于HoxB簇基因進行了多態(tài)性研究，對東亞人HoxB簇基因多態(tài)性與牙齒和咬合特征進行關聯性分析[41]。對HoxB13基因的多態(tài)性進行探索也發(fā)現了與前列腺癌關聯的SNPs[42]。對肺癌的研究中，在HoxB2基因中也發(fā)現了與其關聯顯著的SNPs[43]。在本研究中，發(fā)現3′UTRs存在與脊椎數和胴體性狀顯著相關的SNPs。本研究在HoxB9基因的3′UTR中通過關聯分析發(fā)現1個SNP(c.2743 C>T)與胴體性狀關聯顯著。因此，HoxB13基因對前后軸的完成有至關重要的作用，主要是在主動終止沿前AP軸的后延伸[31-34]。但在本研究中對其兩個外顯子進行PCR擴增及關聯分析發(fā)現，3′UTR中2個SNPs(c.1863 G>A、c.1440 A>C)與脊椎數性狀關聯顯著，與胴體性狀關聯不顯著。

4 結 論

在北京黑豬群體中，HoxB9基因上的c.2743 C>T位點與胴體性狀關聯顯著，HoxB13基因中c.1863 G>A、c.1440 A>C與脊椎數性狀關聯顯著。這3個位點的發(fā)現為豬脊椎數和胴體性狀的分子標記輔助選育工作提供了基礎。