徐青霞,潘玉英,2*,楊婷婷,楊金生,張 萌,陳 帆,王瀅贏,唐忠偉

縊蟶對(duì)潮間帶原油污染的氧化應(yīng)激及IBR評(píng)價(jià)

徐青霞1,潘玉英1,2*,楊婷婷1,楊金生3,張 萌1,陳 帆1,王瀅贏1,唐忠偉1

(1.浙江海洋大學(xué),水產(chǎn)學(xué)院,浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋漁業(yè)裝備技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 舟山 316022；3.浙江海洋大學(xué),石油化工與環(huán)境學(xué)院,浙江 舟山 316022)

通過研究不同濃度原油污染對(duì)縊蟶()鰓和內(nèi)臟團(tuán)抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化及鰓結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)合綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR),探討潮間帶原油污染對(duì)生物的毒性效應(yīng).結(jié)果顯示:在劑量-效應(yīng)方面,2種組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和內(nèi)臟團(tuán)中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)總體上表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制效應(yīng);SOD誘導(dǎo)與過氧化氫酶(CAT)抑制同時(shí)出現(xiàn),規(guī)律大致相反.在時(shí)間-效應(yīng)上,SOD活性呈升高-降低-升高的趨勢(shì), CAT與GPx呈先降低后升高的趨勢(shì);谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)在鰓中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),酶活性最高為371.663U/mgprot.暴露前期(6h)縊蟶2種組織中丙二醛(MDA)含量顯著增加,鰓和內(nèi)臟團(tuán)中MDA含量最高值分別為5.030和10.705nmol/mgprot,后期逐漸平穩(wěn).IBR結(jié)果表明鰓中生物標(biāo)志物對(duì)原油污染敏感度更高.原油暴露會(huì)使鰓絲結(jié)構(gòu)發(fā)生變形或引起鰓絲脫離等現(xiàn)象.研究表明,縊蟶鰓更適宜作為潮間帶原油暴露生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)的器官.

原油；縊蟶；抗氧化酶；IBR；組織損傷

原油污染現(xiàn)已成為最為嚴(yán)重的海洋污染之一[1].石油類污染物進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng),很容易被周圍水域的水生動(dòng)物通過體表、鰓或飲食吸收,并在機(jī)體器官和組織內(nèi)富集,對(duì)水生生物產(chǎn)生危害,產(chǎn)生急性和長(zhǎng)期毒性作用[2-3].如雙齒圍沙蠶()會(huì)因海水中的原油產(chǎn)生彈跳、扭動(dòng)等應(yīng)激反應(yīng),隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),則會(huì)出現(xiàn)死亡等毒性效應(yīng)[4].當(dāng)石油類污染物進(jìn)入生物體內(nèi),會(huì)通過自身反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS),如H2O2、O- 2?.過量ROS將對(duì)生物體造成酶失活、脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂等氧化損傷[5-6].為應(yīng)對(duì)過量ROS對(duì)機(jī)體的損傷,生物體會(huì)利用抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS,防止氧化損傷[7].丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中的一類,它可與DNA、膜蛋白和酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),因此MDA含量也可以作為生物標(biāo)志物判斷生物受污染的程度[8].

生物體在受到污染脅迫時(shí),體內(nèi)酶活性既有誘導(dǎo)又有抑制,且存在響應(yīng)時(shí)間偏差的情況,因此單一的生物標(biāo)志物不能全面反映生物受石油污染后的毒害情況[9].綜合生物標(biāo)志物響應(yīng) (IBR) 指標(biāo)能夠?qū)⒉煌纳飿?biāo)志物綜合起來進(jìn)行定量分析.已有研究表明利用IBR能有效評(píng)價(jià)污染物對(duì)生物的毒性效應(yīng),根據(jù)其IBR 大小可知組織中氧化應(yīng)激的能力水平[1].組織切片是一種組織損傷研究技術(shù),能夠直接觀察生物組織結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響的情況,在生態(tài)毒理學(xué)研究中應(yīng)用甚廣[10].目前國(guó)內(nèi)外一些研究表明海洋生物受到重金屬、石油或其他有機(jī)物污染,會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷,出現(xiàn)了細(xì)胞壞死、空泡化等現(xiàn)象[11].目前,有關(guān)原油暴露對(duì)生物抗氧化酶影響和富集效應(yīng)方面的研究較多,然而組織損傷的相關(guān)研究較少.

原油附著在細(xì)粒懸浮沉積物上或與潮灘沉積物直接接觸后仍能持續(xù)存在,受污染沉積物發(fā)生再懸浮事件后亦可產(chǎn)生毒性,加大了對(duì)底棲動(dòng)物毒害的風(fēng)險(xiǎn)[12-13].目前,海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)研究主要集中在海水中原油及其原油組分對(duì)海洋生物的影響,對(duì)生物體內(nèi)生物標(biāo)志物的變化方面也有研究,但關(guān)于潮間帶生態(tài)系統(tǒng)原油污染對(duì)底棲生物的毒性效應(yīng)研究較為少見[14].縊蟶()是一種廣溫廣鹽性潮間帶貝類,常穴居于潮間帶軟泥內(nèi),具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15].其移動(dòng)能力較弱,為濾食性生物,無固著的生活方式及對(duì)有機(jī)污染物的低酶降解率使它們能夠積累高水平的有機(jī)分子[16].有研究表明,雙殼類生物相較于魚類,對(duì)石油烴、重金屬等污染物具有較強(qiáng)的富集能力和耐受力[17-18],因此可作為本研究理想的實(shí)驗(yàn)貝類.

本文通過研究原油暴露對(duì)縊蟶鰓和內(nèi)臟團(tuán)組織抗氧化酶(SOD、CAT、GPx、GST)活性和脂質(zhì)過氧化(MDA)的影響,同時(shí)運(yùn)用IBR定量分析原油暴露對(duì)縊蟶可能的毒性效應(yīng),利用組織切片技術(shù)探究原油暴露對(duì)縊蟶鰓組織損傷的影響,為原油污染潮間帶環(huán)境評(píng)價(jià)與保護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

表1 實(shí)驗(yàn)原油組分及其含量

縊蟶()購(gòu)自浙江舟山,選取平均體長(zhǎng)(5.34±0.33) cm、平均體重(9.19±1.80) g的健康個(gè)體.沉積物取自浙江舟山長(zhǎng)峙島潮間帶,經(jīng)風(fēng)干后過篩,選取孔徑小于0.5mm的粉砂備用.經(jīng)測(cè)定,實(shí)驗(yàn)所用沉積物中石油含量背景值為29.73mg/ kg,遠(yuǎn)小于《海洋沉積物質(zhì)量》(GB 18668-2002)中第一類海域的石油類含量標(biāo)準(zhǔn),符合實(shí)驗(yàn)所需要求[19].

1.2 儀器與試劑

主要儀器:紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)UV-1100B),恒溫水浴箱(上海一恒HWS-24),漩渦混勻器(常州越新XH-C),移液槍(Eppendorf),電子天平(上?；ǔ盪TP-313),石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡BIOCUT),組織攤烤片機(jī)(上海卓的ZD-1145),Nikon顯微鏡(日本奧林巴斯).

主要試劑:正己烷、無水乙醇、冰醋酸均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;用于測(cè)定抗氧化酶活性和MDA含量的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于體積為50L的聚乙烯養(yǎng)殖箱中進(jìn)行,以海水:沉積物=8:7.5的質(zhì)量比模擬潮間帶淤泥質(zhì)環(huán)境,總模擬環(huán)境占箱體1/3.按照《海洋沉積物質(zhì)量》(GB 18668-2002)將原油污染濃度設(shè)為0,500,1000, 1500,10000和15000mg/kg,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行[19].在處理過程中,按不同質(zhì)量比先將原油與沉積物在箱體內(nèi)充分混勻,再加入鹽度為24的天然海水,海水與含油沉積物混勻后靜置,水溫控制在20℃左右.

實(shí)驗(yàn)開始時(shí),在每個(gè)養(yǎng)殖箱中放入11只縊蟶成體,觀察其生存狀況并及時(shí)清除死貝(雙殼緊閉且觸碰無反應(yīng)),實(shí)驗(yàn)期間不喂食.在96h急性原油暴露過程中,各組均無縊蟶死亡記錄.在取樣前記錄縊蟶殼長(zhǎng)、殼寬、殼高以及濕重(包括殼).分別于第3,6,12,24,48,96h時(shí)在每個(gè)養(yǎng)殖箱中隨機(jī)取1只縊蟶,并立即解剖出鰓和內(nèi)臟團(tuán),用0.86%生理鹽水沖洗,吸干組織表面水分后用液氮速凍并放入-80℃冰箱保存至進(jìn)一步分析.于實(shí)驗(yàn)第48h時(shí)從每個(gè)養(yǎng)殖箱中隨機(jī)取縊蟶1只用于組織病理學(xué)觀察.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以隨機(jī)均勻的取樣原則,在每個(gè)養(yǎng)殖箱中各取3份上覆水和沉積物,用于測(cè)定暴露體系中上覆水和沉積物實(shí)際原油濃度.

1.4 樣品處理及測(cè)定

組織樣品按其質(zhì)量加入4倍生理鹽水,于冰浴條件下制備20%的組織勻漿,隨后將組織勻漿進(jìn)行離心(2500r/min,4℃,10min),取上清液用于蛋白含量及其他酶活性測(cè)定.酶活性測(cè)定過程采用南京建成試劑盒說明書進(jìn)行,蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法; SOD采用羥胺法;CAT采用鉬酸銨法;GPx和GST采用分光光度法;MDA采用硫代巴比妥酸法.

解剖出的鰓組織立即用Bouin氏液固定,經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯與石蠟浸蠟、石蠟包埋后,使用切片機(jī)切片,切片厚度5 μm,經(jīng)烤片后用蘇木精-伊紅(H.E)染色,封片后使用Nikon顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu).

依據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378-2007)[20]的第4部分海水分析和第5部分沉積物分析,采用紫外分光光度法測(cè)定各濃度組中上覆水和沉積物含油量.

1.5 數(shù)據(jù)處理及IBR計(jì)算

用SPSS 25.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后,以單因素(ANOVA)方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和組間差異顯著性分析.其中<0.05表示組間差異顯著,<0.01表示差異極顯著,<0.001表示差異極其顯著,并使用Origin 2018進(jìn)行繪圖.

依據(jù)Beliaeff等[21]于2002年首次提出的理論,并參照Marigómez等[22]和Pan等[23]的修正方法計(jì)算IBR.

首先計(jì)算各生物標(biāo)志物在不同取樣時(shí)間下測(cè)定結(jié)果的平均值()和所有時(shí)間點(diǎn)的總平均值()及標(biāo)準(zhǔn)差(),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化得到.

然后取標(biāo)準(zhǔn)化后各時(shí)間點(diǎn)的最小值(min)與相加得到得分B.

使用星狀圖來顯示各生物標(biāo)志物的處理結(jié)果,B在星狀圖中表示為各生物標(biāo)志物下輻射線的長(zhǎng)度.IBR通過星狀圖的面積計(jì)算,即為相鄰生物標(biāo)志物的輻射線圍成的三角形面積之和.

2 結(jié)果與分析

2.1 暴露實(shí)驗(yàn)原油實(shí)測(cè)濃度

如表2,結(jié)果所示,除1000mg/kg濃度組外,其他各組沉積物油濃度實(shí)測(cè)值與理論配制值相比偏低,可能是由于實(shí)驗(yàn)過程沉積物中部分原油受生物體活動(dòng)影響會(huì)釋放至上覆水中,從而造成上覆水油濃度實(shí)測(cè)值升高及沉積物油濃度實(shí)測(cè)值偏低.而1000mg/kg濃度組沉積物油濃度實(shí)測(cè)值較理論配制值略有升高,可能是由于該濃度組生物擾動(dòng)對(duì)沉積物原油釋放影響較小,且沉積物存在含油量本底值.綜上所述,各組上覆水和沉積物油濃度實(shí)測(cè)值均與暴露濃度成正比,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理論值規(guī)律相同,符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求.

表2 各濃度組上覆水和沉積物原油含量理論值和實(shí)測(cè)值

2.2 原油對(duì)縊蟶抗氧化酶活性的影響

以SOD、CAT、GPx、GST酶活性來反映縊蟶體內(nèi)抗氧化酶活性的變化情況,活性高于對(duì)照組表示被誘導(dǎo),低于對(duì)照組則表示活性受到抑制.

2.2.1 鰓 如圖1(a)所示,在12和96h時(shí)各濃度組SOD活性均高于對(duì)照組,表明在實(shí)驗(yàn)期間SOD活性被誘導(dǎo),其中12h的500,1000,1500和15000mg/kg濃度組被顯著誘導(dǎo)(<0.05).暴露6和24h,除10000mg/kg濃度組外,各濃度組SOD活性均受到抑制.各濃度組SOD活性隨濃度變化規(guī)律不明顯,無顯著濃度效應(yīng)關(guān)系,但總體上呈現(xiàn)低濃度(<1000mg/kg)誘導(dǎo)、高濃度抑制.10000mg/kg濃度組在暴露期間SOD活性均高于對(duì)照組,表明在實(shí)驗(yàn)期間SOD活性被誘導(dǎo),于6h酶活性達(dá)到峰值122.136U/mgprot. SOD酶活性最大誘導(dǎo)值出現(xiàn)在48h 的1500mg/kg濃度組,此時(shí)酶活性被顯著誘導(dǎo)為131.767U/mgprot(<0.05).

如圖1(b)所示,隨時(shí)間的增加,500mg/kg濃度組CAT活性呈降低的趨勢(shì),1000,10000和15000mg/kg濃度組CAT活性先降低后升高,1500mg/kg濃度組呈現(xiàn)升高-降低-升高的變化情況.相較于對(duì)照組,各濃度組隨時(shí)間變化規(guī)律差異較大,隨時(shí)間的增加500mg/kg濃度組從6h后受到誘導(dǎo),CAT活性高于對(duì)照組,但在暴露48h后受到抑制低于對(duì)照組,其CAT活性最大抑制值為1.059U/mgprot.1000mg/kg濃度組從6h后受到誘導(dǎo),CAT活性高于對(duì)照組.1500mg/ kg濃度組除暴露12和96h外,均受到抑制低于對(duì)照組.10000和15000mg/kg濃度組隨時(shí)間變化情況相同,除12和48h CAT活性低于對(duì)照組外,均高于對(duì)照組.相較于對(duì)照組,CAT活性隨濃度的增加變化規(guī)律不顯著,暴露96h,除500mg/kg濃度組受到抑制外,其他濃度組均受到誘導(dǎo),其中1500和15000mg/kg濃度組顯著高于對(duì)照組(<0.05).

如圖1(c)所示,暴露前期3～6h內(nèi),除6h的500和15000mg/kg濃度組外,其他濃度組GPx活性均高于對(duì)照組,表明原油暴露前期GPx活性受到誘導(dǎo).暴露3h,500,1500和15000mg/kg濃度組GPx活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)并達(dá)到峰值,GPx活性分別為178.827,169.752和167.589U/mgprot.暴露12h,除500和1500mg/kg濃度組外,其余濃度組GPx活性開始受到抑制.暴露24h,各濃度組GPx活性均極顯著低于對(duì)照組(<0.01).暴露48h,各濃度組GPx活性開始升高,至96h時(shí),除500和15000mg/kg濃度組外,各濃度組活性高于對(duì)照組.

如圖1(d)所示,各濃度組GST活性隨時(shí)間的變化總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì).暴露3h,所有濃度組GST活性均低于對(duì)照組,表明暴露前期GST活性被抑制.暴露6h,各濃度組GST活性開始升高,其中500和1000mg/kg濃度組GST活性受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組,其余濃度組GST活性仍受到抑制.暴露12～48h,各濃度組GST活性均受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組,其中48h的500,1500和10000mg/kg濃度組GST活性達(dá)到各濃度組峰值,分別為371.663,359.265和356.293U/mgprot,與對(duì)照組差異極其顯著(<0.001).暴露后期96h,各濃度組GST活性受到抑制均低于對(duì)照組,其中500,1000及1500mg/kg濃度組極顯著低于對(duì)照組(<0.01),達(dá)到各濃度組最小值,分別為124.854,101.17和140.135U/mgprot.

圖1 原油對(duì)縊蟶鰓SOD、CAT、GPx和GST活性的影響

*表示與對(duì)照組相比差異顯著<0.05,**表示與對(duì)照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對(duì)照組相比差異極其顯著<0.001

2.2.2 內(nèi)臟團(tuán) 如圖2(a)所示,除500和1000mg/kg濃度組外,各濃度組內(nèi)臟團(tuán)SOD活性隨時(shí)間的變化呈降低-升高-降低的趨勢(shì),內(nèi)臟團(tuán)SOD活性明顯低于鰓.內(nèi)臟團(tuán)SOD活性隨濃度變化波動(dòng)較大.暴露3h,除1000mg/kg濃度組外,各濃度組SOD活性均高于對(duì)照組,表明此時(shí)內(nèi)臟團(tuán)SOD活性受到誘導(dǎo).暴露6h,10000mg/kg濃度組SOD活性低于對(duì)照組,表明受到抑制,其他濃度組SOD活性受到誘導(dǎo)均高于對(duì)照組,500和1000mg/kg 濃度組SOD活性于6h達(dá)到峰值,其活性分別為37.736和34.54U/mgprot.暴露12h, 500,1000和1500mg/kg濃度組SOD活性明顯下降,10000和15000mg/kg濃度組SOD活性略有上升.暴露24h,除1000mg/kg濃度組外,其他濃度組SOD活性均有上升但仍低于對(duì)照組,1500和10000mg/kg濃度組SOD活性極顯著低于對(duì)照組(<0.01).暴露48h,各濃度組SOD活性開始上升并高于對(duì)照組, SOD酶活性最大誘導(dǎo)值出現(xiàn)在48h的1500mg/kg濃度組,此時(shí)酶活性被極顯著誘導(dǎo)為38.603U/mgprot (<0.01),與鰓中情況相同.至暴露96h,各濃度組SOD活性雖有降低但仍高于對(duì)照組.

如圖2(b)所示,暴露期間各濃度組主要呈現(xiàn)抑制效應(yīng).暴露3h,各濃度組CAT活性均低于對(duì)照組,其中1500和15000mg/kg濃度組CAT活性極其顯著低于對(duì)照組(<0.001),其活性分別為10.855和8.275U/ mgprot.暴露6h,除1500mg/kg濃度組外,各濃度組CAT活性均高于對(duì)照組.暴露12h,各濃度組CAT活性總體上雖有升高,但1500和10000mg/kg濃度組CAT活性低于對(duì)照組.暴露24h,各濃度組CAT活性持續(xù)升高,但CAT活性均低于對(duì)照組,表明CAT活性受到抑制.暴露48～96h,除48h的15000mg/kg和96h的1000mg/kg濃度組外,其他各濃度組CAT濃度仍受到抑制低于對(duì)照組. 15000mg/kg濃度組CAT活性隨暴露時(shí)間的增加而升高.

如圖2(c)所示,各濃度組GPx活性隨時(shí)間的增加總體上呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì),與鰓中GPx活性變化趨勢(shì)相似.暴露3h,除1500mg/kg濃度組外,各濃度組GPx活性受到抑制低于對(duì)照組.暴露6h,除10000mg/kg濃度組外,各濃度組GPx活性受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組,其中500mg/kg濃度組GPx活性極其顯著高于對(duì)照組(<0.001),1000mg/kg濃度組顯著高于對(duì)照組(<0.05).暴露12h,各濃度組GPx活性降低,1000和1500mg/kg濃度組GPx活性低于對(duì)照組.暴露24h,各濃度組內(nèi)臟團(tuán)GPx活性升高但均低于對(duì)照組.暴露48h,GPx活性持續(xù)升高并高于對(duì)照組,各濃度組GPx活性均極顯著高于對(duì)照組,除500mg/kg濃度組外,其余濃度組達(dá)到各組峰值,活性峰值范圍為201.392～240.490U/mgprot.暴露96h,除500mg/kg濃度組GPx活性升高,各濃度組GPx活性均有降低.

如圖2(d)所示,暴露3h,各濃度組GST活性受到抑制低于對(duì)照組.暴露6～12h,內(nèi)臟團(tuán)中GST活性受到誘導(dǎo),開始高于對(duì)照組活性.暴露24～48h,除15000mg/kg濃度組GST活性高于對(duì)照組外,其余各濃度組GST活性均低于對(duì)照組.暴露96h,各濃度組GST活性均高于對(duì)照組.相較于對(duì)照組,GST活性隨濃度的增加變化規(guī)律不顯著.500,1000和10000mg/ kg濃度組隨時(shí)間的變化情況相似,呈升高-降低-升高的趨勢(shì).1500mg/kg濃度組在暴露前期受到抑制低于對(duì)照組,于96h受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組.15000mg/kg濃度組在暴露前期受到抑制低于對(duì)照組,于12h受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組.

圖2 原油對(duì)縊蟶內(nèi)臟團(tuán)SOD、CAT、GPx和GST活性的影響

*表示與對(duì)照組相比差異顯著<0.05,**表示與對(duì)照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對(duì)照組相比差異極其顯著<0.001

2.3 原油對(duì)縊蟶脂質(zhì)過氧化程度的影響

如圖3(a)所示,鰓中MDA含量隨時(shí)間變化總體呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢(shì),但各濃度組隨時(shí)間變化規(guī)律各有不同.暴露6h,各濃度組MDA含量相較于3h略有升高,表明鰓中為應(yīng)對(duì)原油暴露存在脂質(zhì)過氧化情況,1500mg/kg濃度組MDA含量達(dá)到峰值為5.030nmol/mgprot.暴露12h,各濃度組MDA含量與6h相比有所降低.暴露24h,除15000mg/kg濃度組MDA含量略低于對(duì)照組外,其余濃度組MDA含量均高于對(duì)照組,MDA含量隨濃度的增大而降低,其中500mg/kg濃度組極其顯著高于對(duì)照組(<0.001), 1000mg/kg濃度組極顯著高于對(duì)照組(<0.01), 1500mg/kg濃度組顯著高于對(duì)照組(<0.05).暴露48～96h,MDA含量降低并逐漸低于對(duì)照組,MDA含量最低是48h的500mg/kg濃度組,含量為1.294nmol/mgprot.

*表示與對(duì)照組相比差異顯著<0.05,**表示與對(duì)照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對(duì)照組相比差異極其顯著<0.001

如圖3(b)所示,各濃度組MDA含量隨時(shí)間的變化規(guī)律不顯著.暴露3h,除1500mg/kg濃度組MDA含量低于對(duì)照組外,其余濃度組MDA含量均高于對(duì)照組,其中500mg/kg濃度組極其顯著高于對(duì)照組(<0.001).暴露6h,除15000mg/kg濃度組MDA含量低于對(duì)照組外,其余濃度組MDA含量均高于對(duì)照組,其中500和1000mg/kg濃度組均極其顯著高于對(duì)照組(<0.001),500mg/kg濃度組MDA含量達(dá)到峰值為10.705nmol/mgprot.暴露12h,MDA含量與暴露濃度呈現(xiàn)低濃度(<1000mg/kg)誘導(dǎo)、高濃度抑制的效應(yīng)關(guān)系.暴露24h,除15000mg/kg濃度組MDA含量高于對(duì)照組外,其余濃度組MDA含量均低于對(duì)照組.暴露48h,各濃度組MDA含量升高,至暴露96h又降低.500mg/kg濃度組在暴露3～12h內(nèi)MDA含量高于對(duì)照組,暴露24～96h內(nèi)MDA含量低于對(duì)照組.1000mg/kg濃度組除暴露24h,其余暴露期MDA含量均高于對(duì)照組.1500mg/kg濃度組除暴露6和48h,其余暴露期均低于對(duì)照組.10000mg/kg濃度組在暴露期間MDA含量變化不大.15000mg/kg濃度組于48h達(dá)到該濃度峰值,極其顯著高于對(duì)照組(<0.001),于96h達(dá)到最小值為4.191nmol/mgprot (<0.01).

2.4 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR)評(píng)價(jià)原油暴露對(duì)縊蟶的影響

本文共選取SOD、CAT、GPx、GST和MDA 5種生物標(biāo)志物,利用IBR進(jìn)行綜合分析,以不同時(shí)間段為范圍,繪制IBR星狀圖.不同濃度原油暴露96h對(duì)縊蟶鰓和內(nèi)臟團(tuán)的星狀圖如圖4～5所示,IBR隨時(shí)間的變化如圖6所示.

2.4.1 鰓 由圖4可知,除暴露12h外各時(shí)間點(diǎn)下,各濃度組鰓中不同生物標(biāo)志物Bi值分布情況相似.暴露3h,SOD、CAT和GPx的Bi值較高,表明暴露前期SOD、CAT和GPx酶活性響應(yīng)較快.暴露6h, CAT的Bi值略有下降,MDA的Bi值升高.暴露12～ 24h,GST的Bi值升高,表明GST酶開始發(fā)揮作用導(dǎo)致活性升高.暴露48h,SOD的Bi值升高,但MDA的Bi值降低.暴露96h,SOD和GST的Bi值降低,而MDA的Bi值升高.

由圖6(a)可知,各濃度組鰓中IBR值隨暴露時(shí)間的增加主要呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢(shì),暴露前期IBR值明顯大于暴露后期.暴露3～24h,除3h的1500mg/kg、6和24h的15000mg/kg濃度組外,其余濃度組IBR值均高于對(duì)照組.暴露48～96h,除48h的1000和1500mg/kg及96h的10000mg/kg濃度組外,各濃度組IBR值均低于對(duì)照組.原油暴露濃度為500mg/kg時(shí),各時(shí)間點(diǎn)IBR累積值最大,為58.084.總體來看,低濃度組(￡1500mg/kg)IBR值存在高于高濃度組(310000mg/kg)現(xiàn)象.

2.4.2 內(nèi)臟團(tuán) 由圖5可知,相同時(shí)間點(diǎn)下,各濃度組中內(nèi)臟團(tuán)不同生物標(biāo)志物的Bi值分布情況相似.暴露3h,SOD、CAT和GST的Bi值較高.暴露6～12h,除6h的500和1000mg/kg濃度組外,其余濃度組SOD和CAT的Bi值下降.暴露24h,SOD、CAT和GPx的Bi值升高.暴露48h,SOD和MDA的Bi值升高,但CAT的Bi值降低.暴露96h,SOD和MDA的Bi值降低,但GST和CAT的Bi值升高.

由圖6(b)可知,暴露3～12h,6h的500和1000mg/kg濃度組IBR值明顯高于對(duì)照組,3h的500和10000mg/kg、6h的1500mg/kg以及12h的500和1000mg/kg濃度組IBR稍高于對(duì)照組,其余濃度組IBR值均低于對(duì)照組,呈現(xiàn)低濃度組IBR值高于高濃度現(xiàn)象,與鰓中情況相似.暴露24h,各濃度組IBR值均低于對(duì)照組.暴露48～96h,除500mg/ kg濃度組外,各濃度組IBR值均高于對(duì)照組.除500和1000mg/kg外,其他濃度組暴露前期IBR值小于暴露后期.暴露濃度為500mg/kg時(shí),各時(shí)間點(diǎn)IBR累積值達(dá)到峰值為61.925,與鰓中情況類似.

圖6 不同濃度原油暴露下鰓和內(nèi)臟團(tuán)組織IBR隨時(shí)間的變化

2.5 原油暴露對(duì)鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

縊蟶的鰓組織由位于外套膜兩側(cè)的鰓瓣組成,鰓瓣均由與身體縱軸相垂直的鰓絲組成,鰓絲中主要包含扁平細(xì)胞、柱狀細(xì)胞以及少量粘液細(xì)胞等[24-25].不同濃度原油暴露48h對(duì)縊蟶鰓組織的影響如圖7所示,對(duì)照組(圖7a)鰓絲結(jié)構(gòu)完整,纖毛無損傷,鰓絲與鰓絲之間排列緊密.原油暴露48h后,各濃度組出現(xiàn)鰓絲與軟組織脫離的現(xiàn)象(圖7b-f),伴隨暴露濃度的增大該現(xiàn)象愈加明顯.500mg/kg濃度組對(duì)縊蟶鰓組織影響較小,雖有輕微鰓絲脫離現(xiàn)象,但無明顯結(jié)構(gòu)變化(圖7b).在1000 和10000mg/kg濃度組中,縊蟶鰓內(nèi)腔出現(xiàn)明顯變小、變窄,鰓絲變形嚴(yán)重(圖7c、e).在1000和1500mg/kg濃度組中,鰓纖毛出現(xiàn)脫落現(xiàn)象(圖7c、d).在15000mg/kg濃度組中,出現(xiàn)色素細(xì)胞大量增多的現(xiàn)象(圖7f).

圖7 不同濃度原油暴露48h對(duì)縊蟶鰓顯微結(jié)構(gòu)的影響

a:對(duì)照組(400×); b:500mg/kg暴露組(400×); c:1000mg/kg暴露組(400×); d:1500mg/kg暴露組(400×); e:10000mg/kg暴露組(400×); f:15000mg/kg

暴露組(400×)(BJ:鰓絲; BJS:鰓絲與軟組織脫離; BM:基膜; Ci:纖毛; PC:色素細(xì)胞; WT:水管腔)

3 討論

原油是一種具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)的化學(xué)混合物[26],原油泄漏發(fā)生時(shí),會(huì)對(duì)周圍生物及環(huán)境產(chǎn)生危害[27].抗氧化酶在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生理過程中發(fā)揮重要作用,當(dāng)生物受到原油脅迫時(shí),生物體會(huì)產(chǎn)生大量ROS并對(duì)機(jī)體造成損傷,抗氧化酶系統(tǒng)通過誘導(dǎo)或抑制效應(yīng)來發(fā)揮作用,以清除過量自由基[28-29].

SOD、CAT和GPx具有協(xié)同作用[30].SOD是唯一能使自由基O- 2?發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2或H2O2的抗氧化酶,H2O2可被CAT和GPx降解生成H2O和氧氣O2,從而起到保護(hù)機(jī)體的作用[10,31-32].SOD和CAT是最早參與自由基清除的酶,SOD活性誘導(dǎo)通常和CAT活性抑制現(xiàn)象一起出現(xiàn)[3,33].本研究中,鰓中SOD活性在暴露初期受到誘導(dǎo),增強(qiáng)了機(jī)體內(nèi)清除自由基的能力,導(dǎo)致H2O2急劇增加.過量H2O2會(huì)抑制CAT活性,使其活性降低.暴露6h時(shí)SOD活性開始降低,受到抑制,CAT活性降低但高于對(duì)照組;暴露48h,SOD活性開始升高并高于對(duì)照組,此時(shí)CAT活性受到顯著抑制;當(dāng)暴露時(shí)間過長(zhǎng)時(shí),機(jī)體會(huì)因細(xì)胞損傷出現(xiàn)SOD活性降低,CAT活性升高的現(xiàn)象.GPx與CAT具有相似的作用能促進(jìn)H2O2的分解,因此鰓中GPx與CAT變化規(guī)律相似[34].內(nèi)臟團(tuán)中GPx活性在暴露初期主要受到抑制,在暴露后期受到顯著誘導(dǎo),隨濃度總體呈現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制效應(yīng).生物體內(nèi)抗氧化酶活性被顯著誘導(dǎo)或時(shí)而被顯著抑制,這可能是由于縊蟶受原油暴露后,機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)失衡,這與張林寶等[35]柴油水溶性成分對(duì)菲律賓蛤仔的研究結(jié)果一致.

GST同樣參與自由基的清除,促進(jìn)對(duì)自由基的防御機(jī)制,可催化谷胱甘肽等生物內(nèi)源性的水溶性分子與Ⅰ相代謝產(chǎn)物結(jié)合,形成更為親水的物質(zhì)排出體外,尤其是對(duì)于石油烴的解毒環(huán)節(jié)有重要作用[32,36-37].本研究中,鰓中GST活性在暴露3h受到抑制,6～48h內(nèi)各濃度組活性高于對(duì)照組,表明其受到誘導(dǎo)對(duì)污染物進(jìn)行解毒,96h時(shí)GST活性降低表明受到抑制.內(nèi)臟團(tuán)中GST活性隨時(shí)間的變化與鰓中相似,出現(xiàn)了先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象,但兩個(gè)組織中GST活性抑制響應(yīng)時(shí)間存在偏差.任加云等[38]利用櫛孔扇貝研究發(fā)現(xiàn)石油烴脅迫下鰓絲中同樣呈現(xiàn)GST活性先誘導(dǎo)后抑制的情況.上述現(xiàn)象可能是由于生物體在暴露前期受到污染脅迫GST活性表現(xiàn)出誘導(dǎo)性,暴露后期解毒代謝過程不斷進(jìn)行導(dǎo)致谷胱甘肽(GSH)被大量消耗,從而使GST活性下降.

縊蟶受到原油污染時(shí)所產(chǎn)生的ROS會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化,氧化降解的過程中會(huì)產(chǎn)生脂過氧化自由基(LOO-)、MDA以及丙醛等多種自由基[10].本研究中,暴露前期(6h)各處理組鰓和內(nèi)臟團(tuán)中MDA含量均顯著增加,可能此時(shí)縊蟶處于氧化應(yīng)激狀態(tài),細(xì)胞無法應(yīng)對(duì)過量的自由基,導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),MDA水平升高;隨時(shí)間的增加,MDA含量逐漸平穩(wěn)降低或低于對(duì)照組,這可能是由于抗氧化酶清除了過氧化自由基,使MDA的積累減少[39].

不同生物標(biāo)志物在生物體內(nèi)存在效應(yīng)不同,因此本文將SOD、CAT、GPx、GST及MDA進(jìn)行綜合分析.研究表明,IBR可以作為確定污染物對(duì)海洋生物群有害影響的有效工具[40],現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于原油、重金屬或其他污染物對(duì)生物的毒害評(píng)價(jià)[39,41].本研究中,鰓和內(nèi)臟團(tuán)中IBR均出現(xiàn)低濃度組高于對(duì)照組,高濃度組低于對(duì)照組現(xiàn)象,且鰓中表現(xiàn)更明顯,這與縊蟶體內(nèi)SOD、GPx受原油暴露后呈現(xiàn)的低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制效應(yīng)有關(guān),IBR值所反應(yīng)的結(jié)果與酶活性差異一致,與Pan等[23]研究結(jié)果相似.從時(shí)間上來看,鰓中IBR值暴露前期較高,而在內(nèi)臟團(tuán)中IBR值暴露后期較高.這可能是由于組織之間存在一種補(bǔ)償機(jī)制,以保護(hù)細(xì)胞免受促氧化條件的影響[42].鰓是最先接觸到原油的器官,因此其對(duì)原油暴露響應(yīng)較高[10],隨著暴露時(shí)間的增加,內(nèi)臟團(tuán)中消化腺開始發(fā)揮解毒作用,酶活性開始響應(yīng)并逐漸升高,以更好的保護(hù)機(jī)體.對(duì)比圖6中IBR變化趨勢(shì),鰓對(duì)原油污染敏感性和差異性更顯著,更適合作為污染監(jiān)測(cè)的研究器官.

濾食性貝類鰓的主要功能是呼吸和運(yùn)送食物,亦是整個(gè)機(jī)體中最先與污染物接觸的器官,對(duì)污染物反應(yīng)敏感[43].原油中的碳?xì)浠衔飼?huì)加大鰓中呼吸上皮細(xì)胞的損傷,Agamy[44]研究表明原油會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)紋石斑魚()發(fā)生水腫、上皮細(xì)胞壞死等病變.而鰓絲中異常細(xì)胞增加、纖毛腫脹、細(xì)胞壞死和其他病理形態(tài)學(xué)改變也常作為雙殼貝類受到外源性污染物損傷的標(biāo)志.本研究中,低濃度原油暴露對(duì)縊蟶鰓造成了輕微結(jié)構(gòu)損傷,隨著原油暴露濃度的增加,出現(xiàn)了明顯的鰓絲與軟組織脫離、鰓絲變形和纖毛脫落等病理變化.薛秀玲等[45]通過研究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)縊蟶鰓的影響也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果,有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致鰓出現(xiàn)纖毛脫落、鰓絲間隔與結(jié)締組織增生等病理學(xué)變化.其他外源性污染物對(duì)雙殼貝類也存在相似的影響.陳彩芳等[46]以Pb2+對(duì)泥蚶()進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示Pb2+同樣會(huì)造成泥蚶鰓絲脫離軟骨組織的現(xiàn)象,高濃度暴露還會(huì)導(dǎo)致鰓絲呼吸上皮細(xì)胞脫落.生物體發(fā)生水腫、鰓絲脫離和壞死等病理學(xué)變化往往與外源性污染物脅迫所帶來的脂質(zhì)過氧化有關(guān)[47].抗氧化酶系統(tǒng)能夠使自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài),而重金屬、原油類等外源性污染物能引發(fā)生物體的氧化應(yīng)激效應(yīng),當(dāng)抗氧化酶系統(tǒng)的防御作用小于外源性污染物的損傷作用時(shí),過量的自由基累積會(huì)導(dǎo)致機(jī)體引發(fā)脂質(zhì)過氧化和組織損傷[48-49].

綜上,生物體是一個(gè)有機(jī)整體,原油暴露造成氧化脅迫,引起抗氧化酶活性的變化和脂質(zhì)過氧化,從而會(huì)引起組織損傷,而IBR可以綜合反映各生物標(biāo)志物的變化情況,可作為環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)的評(píng)價(jià)指標(biāo).

4 結(jié)論

4.1 縊蟶在原油污染暴露下,鰓和內(nèi)臟團(tuán)組織中抗氧化酶活性和MDA含量均受到不同程度的誘導(dǎo)或抑制,用于清除機(jī)體內(nèi)的ROS.SOD活性總體表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制效應(yīng);SOD誘導(dǎo)與CAT抑制同時(shí)出現(xiàn),規(guī)律大致相反; MDA與SOD在鰓中變化規(guī)律相反;而內(nèi)臟團(tuán)中GPx與SOD變化規(guī)律相似,總體呈低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制效應(yīng).在時(shí)間-效應(yīng)上,SOD活性呈升高-降低-升高的趨勢(shì),鰓中酶活性最高為131.767U/mgprot,內(nèi)臟團(tuán)中酶活性被極顯著誘導(dǎo)至38.603U/mgprot;CAT與GPx活性變化規(guī)律相似,呈先降低后升高的趨勢(shì); GST在鰓中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),最高為371.663U/mgprot,內(nèi)臟團(tuán)中GST隨時(shí)間變化不明顯.原油暴露前期縊蟶鰓和內(nèi)臟團(tuán)中MDA含量顯著增加, 2種組織最高值分別為5.030和10.705nmol/mgprot,后期逐漸恢復(fù)至平穩(wěn)狀態(tài).

4.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到的星狀圖及IBR值,和酶活性差異結(jié)果一致,可作為生物毒性評(píng)價(jià)的有效補(bǔ)充指標(biāo).IBR評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)SOD和CAT是最早參與自由基清除的酶.縊蟶的鰓組織對(duì)原油暴露的影響高于內(nèi)臟團(tuán),更適合作為原油污染生物監(jiān)測(cè)的器官.

4.3 組織切片結(jié)果顯示原油暴露會(huì)導(dǎo)致鰓結(jié)構(gòu)變形及鰓絲與軟骨組織脫離等現(xiàn)象,且隨暴露濃度的增加而愈加嚴(yán)重.

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Oxidative stress and IBR evaluation ofon intertidal oil pollution.

XU Qing-xia1, PAN Yu-ying1,2*, YANG Ting-ting1, YANG Jin-sheng3, ZHANG Meng1, CHEN Fan1, WANG Ying-ying1, TANG Zhong-wei1

(1.College of Fisheries of Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China；2.Key Laboratory of Marine Fishery Equipment and Technology of Zhejiang, Zhoushan 316022, China；3.College of Petrochemical Engineering & Environment, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)., 2023,43(1)：328～340

To discuss the toxic effect which induced by intertidal crude oil pollution to organisms, antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in gills and visceral mass, the changes of gills structure as well as Integrated Biomarker Response (IBR) ofexposed to different oil concentration were studied. The results showed that superoxide dismutase (SOD) activities in gills and visceral mass as well as glutathione peroxidase (GPx) activities in visceral mass appeared low concentration induction and high concentration inhibition effect in terms of dose-response. SOD induction and catalase (CAT) inhibition appeared at the same time while the rules were roughly opposite. In the time-effect, the SOD activities showed an increase-decrease-increase trend, while CAT and GPx activities showed the decrease-increase trend. The Glutathione S-transferase (GST) activities in gills showed an increase-decrease trend, the maximum value was 371.663U/mgprot. The malondialdehyde (MDA) content in the two tissues ofincreased significantly in the early stage of exposure (6h), the highest MDA content in gills and visceral mass were 5.030 and 10.705 nmol/mgprot, respectively, then gradually stabilized in the later stage. IBR results showed that biomarkers in gills were more sensitive to crude oil contamination. The crude oil exposure can deform the gills filament structure or cause their detachment. The results showed that gills ofwere more suitable as the organ for biological monitoring and evaluation of oil exposure in intertidal zone.

crude oil；；antioxidant enzyme activity；IBR；tissue damage

A

1000-6923(2023)01-0328-13

徐青霞(1998-),女,浙江紹興人,浙江海洋大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)槌练e物石油污染生物毒性效應(yīng).

2022-06-02

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY19D060003);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃)項(xiàng)目(2021R411006);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202110340052);浙江省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2019J00023)

* 責(zé)任作者, 副教授, panyuying@zjou.edu.cn