趙海君，張皙卉，陳靜，盧靜，張洪峰，常文亮

隨著二孩和三孩政策實(shí)施、生活節(jié)奏加快，女性生育年齡不斷延遲。35歲后女性生育功能迅速下降，常合并卵巢儲(chǔ)備功能減退（diminished ovarian r eserve，DOR），出現(xiàn)卵子數(shù)量和質(zhì)量下降，胚胎發(fā)育潛能降低。生殖領(lǐng)域常把女性年齡≥35歲稱為高齡。高齡患者行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）治療時(shí)常有獲卵少、可利用胚胎不足的情況，周期取消率高，治療結(jié)局不理想[1-2]。目前尚無(wú)高齡導(dǎo)致生育功能衰退的特效治療。開展個(gè)性化促排卵方案，最大限度地利用卵巢儲(chǔ)備，是高齡不孕患者的最佳治療策略[3]。對(duì)于DOR患者，臨床常用的促排卵方案有微刺激方案和促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRHA）方案。近年來(lái)，高孕激素狀態(tài)下促排卵（progestin-primed ovarian stimulation，PPOS）方案在高齡患者中應(yīng)用增多。但哪種方案療效最佳尚有爭(zhēng)議。本研究回顧性分析高齡合并DOR患者行IVF/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療周期資料，比較微刺激方案、GnRHA方案和PPOS方案一次藥物刺激卵巢取卵后形成的胚胎進(jìn)行移植后的治療結(jié)局，探索高齡DOR患者最佳的促排卵方案。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2016年6月—2020年1月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF/ICSI助孕的高齡（35～43歲）DOR患者，共納入186個(gè)周期。根據(jù)促排卵方案分為PPOS組（n=61）、微刺激組（n=65）和拮抗劑組（n=60）。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：①抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）＜1.1 ng/mL；②基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）≥10 U/L；③雙側(cè)卵巢竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicle count，AFC）＜7個(gè)，符合以上3條中的任一條。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多囊卵巢綜合征等內(nèi)分泌疾?。虎诜蚱奕魏我环酱嬖谌旧w異常；③合并子宮畸形、未經(jīng)治療的子宮內(nèi)膜病變、嚴(yán)重的子宮腺肌病等影響IVF/ICSI妊娠結(jié)局的疾??；④合并全身性疾病。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬在治療前均知情同意。

1.2 促排卵方案

1.2.1 PPOS方案 于月經(jīng)來(lái)潮第2天開始口服地屈孕酮（達(dá)芙通，荷蘭蘇威制藥有限公司）20 mg/d，并注射人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG，樂寶得，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）150～225 U/d。定期檢查血清性激素水平和卵泡直徑，根據(jù)卵巢反應(yīng)調(diào)整促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量，直至人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日。

1.2.2 微刺激方案 月經(jīng)來(lái)潮第2～3天開始口服枸櫞酸氯米芬（法地蘭，塞浦路斯高特制藥有限公司）100 mg/d，3 d后加用HMG，起始劑量150～225 U/d。根據(jù)卵巢反應(yīng)調(diào)整Gn用量，持續(xù)用藥至hCG日。

1.2.3 GnRHA方案 月經(jīng)來(lái)潮第2～3天開始注射HMG 150～225 U/d，適時(shí)調(diào)整用量。當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)14 mm或黃體生成素（luteinizing hormone，LH）＞10 U/L或卵泡直徑達(dá)12 mm且雌二醇（estradiol，E2）水平達(dá)1 101 pmol/L（300 pg/mL）時(shí)，皮下注射醋酸西曲瑞克（思則凱，Pierre Fabre Medicament Production，Aquitaine Pharm International）0.25 mg/d，直至hCG日。

1.3 取卵及IVF/ICSI-ET當(dāng)主導(dǎo)卵泡發(fā)育至有1～2枚直徑達(dá)18 mm，給予hCG（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）5 000～10 000 U或重組hCG（艾澤，德國(guó)默克雪蘭諾有限公司）250μg，36～38 h后行經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。根據(jù)男方精子情況行IVF/ICSI授精，加入精子16～18 h后在倒置顯微鏡下觀察卵子原核和極體，確認(rèn)受精情況。正常受精第3天胚胎卵裂球數(shù)≥6個(gè)、細(xì)胞碎片比例≤25%的胚胎為可利用胚胎[5]，其中有7～9個(gè)卵裂球、大小符合發(fā)育階段、碎片＜10%、無(wú)多核化的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎[6]。微刺激組和拮抗劑組患者在取卵后3天常規(guī)行新鮮胚胎移植，若有以下情況之一則行全胚冷凍：①子宮內(nèi)膜厚度≤6 mm；②hCG日孕酮水平＞4.77 nmol/L（1.5 ng/mL）；③宮腔積液或?qū)m腔粘連；④患者合并其他全身癥狀不宜行新鮮胚胎移植。PPOS組均行全胚冷凍。凍融胚胎移植（frozenthawed embryo transfer，F(xiàn)ET）采用激素替代周期、自然周期或促排卵周期等方案行內(nèi)膜準(zhǔn)備。新鮮胚胎移植及FET每次移植1～2枚胚胎，至少含1枚優(yōu)質(zhì)胚胎，術(shù)后均按常規(guī)給予黃體支持。所有移植患者均隨訪至妊娠結(jié)束。移植后28～35 d超聲檢查見妊娠囊者為臨床妊娠，包括宮內(nèi)妊娠和異位妊娠。妊娠28周后出生至少1個(gè)存活嬰兒為活產(chǎn)。

1.4 觀察指標(biāo)①一般情況指標(biāo)：記錄女方年齡、不孕時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、AMH、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH，基礎(chǔ)E2和AFC。②促排卵和胚胎情況指標(biāo)：Gn時(shí)間、Gn用量、hCG日E2、hCG日LH、獲卵數(shù)、成熟卵率、雙原核（two pronucleus，2PN）受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和周期取消率。③妊娠結(jié)局指標(biāo)：FET周期率、種植率、累積妊娠率和累積活產(chǎn)率。

計(jì)算公式：成熟卵率=成熟卵母細(xì)胞數(shù)/總卵母細(xì)胞數(shù)×100%；2PN受精率=2PN受精卵數(shù)/總卵母細(xì)胞數(shù)×100%；2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%；周期取消率=無(wú)可利用胚胎周期數(shù)（包括未取卵、未獲卵等各種原因無(wú)可利用胚胎的周期）/促排卵周期數(shù)×100%，周期取消率的計(jì)算不納入因全胚冷凍未行新鮮胚胎移植的周期；FET周期率=FET周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%；種植率=著床胚胎總數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%；累積妊娠率=累積妊娠周期數(shù)（包括取卵周期新鮮胚胎移植與FET后首次獲得的臨床妊娠）/取卵周期數(shù)×100%，剩余未達(dá)到妊娠，仍處于冷凍狀態(tài)的胚胎不計(jì)入累積妊娠率；累積活產(chǎn)率=累積活產(chǎn)周期數(shù)（包括取卵周期新鮮胚胎移植與FET后首次獲得的活產(chǎn)）/取卵周期數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較及兩兩比較用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。定性資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)，校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.017。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較3組患者的年齡、不孕時(shí)間、BMI、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2、AMH和AFC比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 患者一般情況比較

2.2 3組患者促排卵和胚胎情況比較3組Gn時(shí)間、Gn用量、hCG日E2水平、hCG日LH水平、獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和周期取消率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；3組成熟卵率、2PN受精率、2PN卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，與微刺激組相比，PPOS組和拮抗劑組Gn時(shí)間延長(zhǎng)，Gn用量增加，hCG日E2水平升高，獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)增加，周期取消率降低（均P＜0.05）。微刺激組hCG日LH水平較另外2組高，與拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與PPOS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組患者促排卵和胚胎情況比較

2.3 3組患者臨床妊娠結(jié)局比較3組FET周期率、累積妊娠率和累積活產(chǎn)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；3組胚胎種植率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，PPOS組FET周期率較另外2組升高，拮抗劑組FET周期率較微刺激組升高（均P＜0.05）。與微刺激組比較，PPOS組和拮抗劑組累積妊娠率和累積活產(chǎn)率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 3組患者臨床妊娠結(jié)局比較 %（n/n）

3 討論

3.1 DOR患者助孕現(xiàn)狀DOR患者AFC減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，IVF治療中常出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)、卵泡生長(zhǎng)不齊、未獲卵及無(wú)可利用胚胎等情況，導(dǎo)致妊娠率低下[4]。研究顯示DOR患者較其他患者IVF-ET活產(chǎn)率降低40%～50%[7]。女性在35歲之后流產(chǎn)率明顯升高，從35歲時(shí)的約10%升高到44歲時(shí)的峰值65%；活產(chǎn)率明顯降低，＜35歲女性的每起始周期活產(chǎn)率為40.1%，＞42歲女性為4.5%[8]。隨著年齡增加，胚胎非整倍體率增加，胚胎-子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步增多，妊娠率降低，反復(fù)種植失敗增多。卵母細(xì)胞采集時(shí)的年齡是FET周期生化妊娠的決定因素之一，分娩率也受到母體年齡的影響[9]。DOR婦女因胚胎染色體異常導(dǎo)致IVF流產(chǎn)率升高的風(fēng)險(xiǎn)可提早到32歲[10]。

3.2 DOR患者促排卵方案高齡DOR患者的最佳促排卵方案尚未明確。與傳統(tǒng)激動(dòng)劑方案相比，微刺激、拮抗劑和PPOS方案操作簡(jiǎn)單，周期較短，常用于DOR患者。微刺激方案采用枸櫞酸氯米芬競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合下丘腦垂體雌激素受體，阻斷內(nèi)源性雌激素對(duì)下丘腦垂體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致GnRH的分泌增多，增加垂體Gn的釋放。拮抗劑方案在促排卵過程中內(nèi)源性LH峰出現(xiàn)前直接給予GnRHA，其與GnRH受體結(jié)合快速抑制LH產(chǎn)生，避免早發(fā)LH峰導(dǎo)致的卵泡逃逸和黃素化[11]。PPOS方案由我國(guó)學(xué)者匡延平團(tuán)隊(duì)建立，通過早卵泡期外源性添加孕激素抑制垂體分泌的LH峰，達(dá)到控制性促排卵的目的[12]。本研究發(fā)現(xiàn)與微刺激方案相比，PPOS方案和拮抗劑方案臨床結(jié)局顯著改善，而兩者之間臨床結(jié)局相似。

3.3 3種促排卵方案優(yōu)劣 Gn用量多并不一定能改善IVF-ET的臨床結(jié)局。微刺激方案對(duì)卵巢刺激小，有助于獲得質(zhì)量最佳的可利用卵母細(xì)胞及胚胎。同時(shí)卵巢過度刺激綜合征和靜脈血栓栓塞發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，安全性提高。但微刺激方案沒有垂體降調(diào)節(jié)過程，容易引起早發(fā)LH峰，導(dǎo)致卵泡逃逸、獲卵數(shù)降低，因未獲卵、無(wú)可利用胚胎所致的周期取消率增加，因此微刺激方案常需反復(fù)刺激卵巢，患者接受度下降[13]。與微刺激方案相比，拮抗劑方案可增加獲卵數(shù)、胚胎數(shù)和新鮮胚胎種植率，同時(shí)降低周期取消率[14]。而在受精率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率方面，常規(guī)方案（長(zhǎng)方案、短方案、拮抗劑方案）與微刺激方案之間并無(wú)顯著差異[15]。與PPOS方案比較，DOR患者應(yīng)用微刺激方案的獲卵數(shù)和可移植胚胎數(shù)減少，周期取消率增加，Gn時(shí)間和Gn用量較少[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與微刺激方案相比，PPOS方案和拮抗劑方案Gn時(shí)間延長(zhǎng)，Gn用量增加，獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)增加，周期取消率降低。與微刺激方案相比，PPOS方案和拮抗劑方案有更多的冷凍胚胎用于后期FET，F(xiàn)ET周期率明顯升高。拮抗劑方案可選擇新鮮胚胎移植或FET助孕，而PPOS方案只能通過FET助孕，因此PPOS方案FET周期率高達(dá)93.44%。從胚胎的利用效能來(lái)看，不管是新鮮胚胎移植還是FET，終極目的是胚胎移植后獲得臨床妊娠和活產(chǎn)。與微刺激方案相比，拮抗劑方案和PPOS方案均可獲得較高的累積妊娠率和累積活產(chǎn)率，二者的胚胎利用效能相似。

3.4 PPOS方案和拮抗劑方案臨床結(jié)局相似與拮抗劑方案相比，PPOS方案不能行新鮮胚胎移植，必須先行全胚冷凍。因此有研究建議，對(duì)于高齡DOR患者，可利用拮抗劑方案新鮮胚胎移植的優(yōu)勢(shì)，縮短達(dá)到妊娠的時(shí)間[17]。但也有研究認(rèn)為PPOS方案能更好地控制早發(fā)LH峰，在成熟卵母細(xì)胞率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率方面表現(xiàn)更佳[18]，同時(shí)現(xiàn)在成熟的胚胎冷凍、解凍技術(shù)，PPOS方案結(jié)合FET也是卵巢反應(yīng)低下人群較好的選擇。本研究顯示，PPOS方案的獲卵數(shù)、2PN受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、周期取消率與拮抗劑方案相似。PPOS方案雖不能行新鮮胚胎移植，但通過FET周期最終可達(dá)到與拮抗劑方案相似的累積妊娠率和累積活產(chǎn)率。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PPOS方案和拮抗劑方案均可使高齡DOR患者IVF/ICSI-ET治療獲得較好的妊娠結(jié)局，可以在DOR患者中酌情使用。本研究是回顧性分析且樣本量偏小，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心、隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步探討各促排卵方案的優(yōu)劣。