朱茂茂, 黃焰群， 盧平平, 黃道戰(zhàn),2*

(1.廣西民族大學 化學化工學院，林產化學與工程國家民委重點實驗室，廣西 南寧 530008； 2.廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西林產化學與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530008；3.廣西民族大學 材料與環(huán)境學院，廣西 南寧 530105)

除草劑在現(xiàn)代農業(yè)中發(fā)揮著重要的作用，不僅可以有效防控雜草危害，增加農作物產量，改善農產品品質，而且可以減輕勞動強度，提高生產效率。隨著人們對飲食安全和生態(tài)環(huán)境保護意識的增強，研究開發(fā)高效低毒的除草劑及其綠色環(huán)境友好劑型已成為當前國家政策要求、行業(yè)發(fā)展共識[1-3]。單萜類化合物是許多植物的次生代謝產物，通常表現(xiàn)良好的生物活性[4-6]，例如對孟烷-3,8-二醇是一種含有兩個羥基的單萜類化合物，也可歸屬為單萜二醇[7-8]，天然存在于檸檬桉樹枝葉精油[9-10]，也能夠以一些植物精油成分香茅醛、巴豆醛、薄荷醇等為原料通過化學或生物轉化制備[11-13]，具有良好的驅蚊、除草等生物活性[9,14]，目前已作為高效低毒的驅蚊劑進行商品化開發(fā)應用。然而，對孟烷-3,8-二醇因天然來源不足，香茅醛、巴豆醛、薄荷醇等合成原料又價格昂貴，其推廣應用受到了限制。蒈烷-3,4-二醇也是一種單萜二醇，在自然界含量少，但容易合成，其可以以在松節(jié)油天然單萜烯類化合物中資源儲量豐富、產量僅次于α-蒎烯和β-蒎烯的3-蒈烯[15]為原料，經環(huán)氧化、環(huán)氧開環(huán)水解反應合成[16]。蒈烷-3,4-二醇分子結構含有1 個親油性蒈烷結構和2個親水性羥基官能團，具有蚊蠅驅避活性[17-18]，對人畜健康、生態(tài)環(huán)境友好，且價格明顯低于對孟烷-3,8-二醇，極有可能在農藥綠色化方面發(fā)揮更大作用。但有關蒈烷-3,4-二醇的除草活性及應用研究，國內外鮮有報道。為此，近年來，本課題組采用雜多酸季銨鹽/雙氧水相轉移綠色催化技術改進優(yōu)化了3,4-環(huán)氧蒈烯的制備工藝[19]，在此基礎上，開展蒈烷-3,4-二醇及其衍生物的合成、除草活性及應用研究，研究蒈烷-3,4-二醇在水溶液中對黑麥草、油菜的根與莖伸長的抑制作用，以期探討其作為水基植物源除草劑的應用性能。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.)和油菜(Brassicacampestris)種子，分別購自百綠(天津)國際草業(yè)有限公司和廣西萬和種業(yè)有限公司；3,4-環(huán)氧蒈烷，GC純度98%，參照文獻[19]方法由實驗室自制；對孟烷-3,8-二醇，GC純度96%，購自廣西中樂大健康產業(yè)有限責任公司；草甘膦，純度97%，由廣西田園生化有限責任公司提供；其余試劑均為市售分析純。

FYX-100型種子發(fā)芽箱和LRH-250-GSI型人工氣候箱，廣東韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；GC-2014C型氣相色譜儀，島津儀器(蘇州)有限公司；MAT95型高分辨率氣相色譜質譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；Magna IR-550型傅里葉變換紅外吸收光譜儀，美國Nicolet公司；Avance II 600MHz核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司；HH-501型超級恒溫水浴，常州普天儀器制造有限公司；X-5型顯微熔點測定儀，北京世紀科信科學儀器有限公司。

1.2 蒈烷-3,4-二醇的合成

取5 mL蒸餾水，用質量分數(shù)20%的稀硫酸調節(jié)pH值為2～3左右，加入到裝有3,4-環(huán)氧蒈烷12 mmol(1.82 g)的50 mL圓底燒瓶中，在室溫(30 ℃)下攪拌，水解反應2 h。反應結束，經減壓過濾收集不溶性沉淀物得白色固體粗產物。將粗產物以正己烷為溶劑重結晶一次，得無色針狀晶體，產率85.6%，經氣相色譜分析，GC純度95%。

1.3 結構鑒定及理化性質測定

1.3.1高分辨率質譜分析 取少量樣品，以無水乙醇溶解，將溶液在高分辨率氣相色譜質譜聯(lián)用儀上直接進樣分析。氣相色譜條件：DB-5型彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，N2為載氣，F(xiàn)ID檢測器；初溫60 ℃，保持0.5 min，先以5 ℃/min升至80 ℃，保持0.5 min，再以20 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，最后以4 ℃/min升至280 ℃，保持0.5 min；進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度280 ℃。質譜條件：電離源，電子轟擊；質量范圍<3 500 u；分辨率<60 000；最高加熱溫度360 ℃。

1.3.2紅外光譜分析 取少量樣品，采用溴化鉀壓片法對樣品進行分析，獲取紅外吸收光譜，波長掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.3.3核磁共振波譜分析 稱取少量樣品，以氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷為內標，測定1H和13C核磁共振圖譜。

1.3.4溶解度測定 取適量樣品溶解，置于超級恒溫水浴中在25 ℃下恒溫平衡2 h，配成飽和溶液。用移液管定量移取5 mL飽和溶液放入預先干燥質量恒定的圓底燒瓶中，蒸發(fā)除去溶劑，干燥至質量恒定后稱量、計算溶解度，溶解度(g/L)=(圓底燒瓶中剩余物質量)×103/5。同法，以不同溶劑進行試驗，比較溶劑對溶解度的影響。

1.3.5親水親油性 采用計算機軟件ChemBiodraw 14.0求算脂水分配系數(shù)(cLogP)，討論化合物的分子結構與溶解性、親水親油性的關系。

1.4 除草活性測試

1.4.1溶液配制 樣品母液：稱取2 mmol供試化合物用0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，轉入100 mL的容量瓶，加入5 mL 1%的吐溫-80乳化劑，以無菌蒸餾水稀釋定容，充分混合配成濃度為20 mmol/L的樣品母液。供試樣品溶液：先取5 mL N,N-二甲基甲酰胺和50 mL 1%的吐溫-80置于1 L的容量瓶中，以無菌蒸餾水定容，混合均勻配成空白溶液，然后，按二倍稀釋法將供試樣品母液稀釋配制成濃度為10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 mmol/L的供試樣品溶液。

1.4.2除草活性評價 除草活性采用平皿培養(yǎng)法，考察蒈烷-3,4-二醇對單子葉植物一年生黑麥草和雙子葉植物油菜根、莖伸長的抑制作用，并與對孟烷-3,8-二醇和商業(yè)除草劑草甘膦相比較，討論其除草活性。實驗操作如下：先將種子浸泡在2%次氯酸鈉溶液中消毒5 min，以無菌水沖洗3次，置于無菌水中浸泡處理15 h，然后，置于底部放有兩張圓形濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，加入適量無菌水，置于培養(yǎng)箱中在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，使種子萌發(fā)露白。挑選10粒已萌發(fā)露白的種子放入直徑9 cm、底部放有兩張圓形濾紙培養(yǎng)皿中，均勻分布，將10 mL樣品溶液倒入培養(yǎng)皿中，每種濃度的樣品溶液和空白液做3組重復實驗；將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)72 h后，測量胚根和莖的長度，按以下公式計算根和莖伸長的抑制率，若根長或莖長小于1 mm時，不予統(tǒng)計、計算。

抑制率=(空白對照組根(莖)長-處理組根(莖)長)/空白對照組根(莖)長×100%

1.4.3數(shù)據分析 參照文獻[20]方法，采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據進行線性回歸分析處理，求算半數(shù)抑制濃度(IC50)和毒力回歸方程，討論蒈烷-3,4-二醇和對孟烷-3,8-二醇的除草活性。

2 結果與討論

2.1 化合物的結構分析

對1.2節(jié)制備的化合物進行分析，其結果如下：高分辨率質譜分析結果顯示，化合物具有分子離子峰[M]+，質荷比值為170.130 5，與理論計算值170.130 7基本相符。紅外吸收光譜主要特征吸收峰及歸屬為：3 381和3 217 cm-1，羥基O—H伸縮振動吸收峰；2 997和2 983 cm-1，甲基、亞甲基C—H不對稱伸縮振動吸收峰； 2 866 cm-1，甲基、亞甲基C—H對稱伸縮振動吸收峰；1 447和1 381 cm-1，分別為甲基、亞甲基C—H的不對稱性和對稱性面外彎曲振動吸收峰；1 116和1 063 cm-1，C—O伸縮振動吸收峰。

1H核磁共振圖譜(600 MHz, CDCl3)質子的化學位移值(δ)及歸屬如下：3.298～3.328(dd，J=1.8, 2.4 Hz,1H，H- 4)，2.830(s，2H，OH)，2.039～2.076(m，1H，H-5)，1.916～1.956(m，1H，H-2)，1.597～1.651(m，1H，H-5)，1.182～1.176(dd，1H，J=3.6 Hz, H-2)，1.174(s，3H，H-9)，0.958(s，3H，H-10)，0.941(s，3H，H-8)，0.690(ddd，2H，H-1，6)。數(shù)據顯示，化合物有18個質子，其中與C4相連的質子吸收峰δ在3.298～3.328，呈雙二重峰；兩個羥基質子δ均為2.830，呈單峰；C8、C9和C10相連的甲基δ分別為1.194、 0.958和0.941，均呈單峰。

13C核磁共振圖譜(150 MHz,CDCl3)碳核的化學位移值(δ)及歸屬如下: 74.20(C4)，73.14(C3)，33.51(C2)，28.45(C5)，27.63(C10)，20.78(C6)，19.75(C9)，18.74(C8)，17.41(C1)，15.56(C7)。這表明，化合物有10個碳原子，其中受羥基吸電子效應的影響，C4和C3的吸收峰在低場，δ分別為74.20和73.14。

上述結構分析結果與文獻[16]相符，證明化合物的分子結構為蒈烷-3,4-二醇(分子式C10H18O2)。

2.2 蒈烷-3,4-二醇的理化性質

蒈烷-3,4-二醇的分子結構(下圖)含有兩個親水性羥基官能團，常溫常壓條件下也是一種結晶性固體。單晶X-衍射分析顯示，蒈烷-3,4-二醇通常以結晶水合物[21]的形式存在，其分子晶體除了存在蒈烷-3,4-二醇分子內氫鍵外，還存在蒈烷-3,4-二醇與水分子之間豐富復雜的分子間氫鍵。對孟烷-3,8-二醇雖然結構與蒈烷-3,4-二醇的相似，但其晶體不含結晶水[22]，其分子晶體僅存在自身分子內氫鍵和分子間氫鍵。因此，蒈烷-3,4-二醇和對孟烷-3,8-二醇在熔點、溶解性和親水親油性等理化性質有明顯的差別。

蒈烷-3,4-二醇的理化性質如表1所示。由表1可見，蒈烷-3,4-二醇、對孟烷-3,8-二醇及草甘膦均微溶于水，在水中的溶解度(為便于比較，蒈烷-3,4-二醇的溶解度測定值仍按不含結晶水計)由小到大的順序為：對孟烷-3,8-二醇<蒈烷-3,4-二醇<草甘膦。然而，蒈烷-3,4-二醇和對孟烷-3,8-二醇易溶于無水乙醇、乙酸乙酯、二甲亞砜和二甲基甲酰胺等親水性溶劑。草甘膦在所考察有機溶劑中的溶解度最低，對孟烷-3,8-二醇在正己烷中的溶解度最大。因此，可以參照水基農藥制劑的制備方法，先將蒈烷-3,4-二醇和對孟烷-3,8-二醇以親水性溶劑溶解配制成較高濃度的水基化劑型，在使用時可直接以水稀釋。

表1 蒈烷-3,4-二醇的理化性質1)

2.3 蒈烷-3,4-二醇的除草活性評價

2.3.1對黑麥草根、莖伸長的抑制作用 對孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇和草甘膦在不同濃度下對黑麥草的根、莖伸長的抑制率、毒力回歸方程以及半數(shù)抑制濃度(IC50)分別列于表2和表3。

表2 蒈烷-3,4-二醇在不同濃度下對黑麥草根和莖伸長的抑制率1)

由表2可知，與草甘膦一樣，蒈烷-3,4-二醇和對孟烷-3,8-二醇都能抑制黑麥草根、莖的伸長，其抑制作用隨著濃度的升高而增強；當對孟烷-3,8-二醇和草甘膦的濃度為0.625 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇的濃度為0.563 mmol/L時，其對根伸長的抑制率分別達到2.8% 、 65.5%和15.1%，而對莖伸長的抑制率分別為-11.9%、 69.1% 和13.0%；當對孟烷-3,8-二醇和草甘膦的濃度從0.625 mmol/L升高至5.00 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇的濃度升高至4.50 mmol/L時，對根伸長的抑制率分別達到92.9%、 100%和100%，而對莖伸長的抑制率分別為72.7%、 100%和85.6%。

表3 蒈烷-3,4-二醇對黑麥草根和莖伸長的毒力回歸方程及半數(shù)抑制濃度

表3顯示，蒈烷-3,4-二醇、對孟烷-3,8-二醇和草甘膦對黑麥草的根長和莖長的毒力回歸方程的相關系數(shù)(R2)均大于0.8，表明抑制率與濃度密切相關；蒈烷-3,4-二醇、對孟烷-3,8-二醇和草甘膦對根長的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.12、 1.78和0.51 mmol/L，而對莖長的IC50分別為1.73、 2.55和0.37 mmol/L，表明蒈烷-3,4-二醇對黑麥草的除草活性高于對孟烷-3,8-二醇，低于草甘膦。

2.3.2對油菜根、莖伸長的抑制作用 對孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇和草甘膦在不同濃度下對油菜根長、莖長的抑制率、毒力回歸方程以及IC50分別列于表4和表5。由表4可以看出，與草甘膦相似，對孟烷-3,8-二醇、蒈烷-3,4-二醇也都能抑制油菜根、莖的伸長，其抑制率隨著濃度升高而明顯增強，當對孟烷-3,8-二醇和草甘膦濃度為0.625 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇濃度為0.562 5 mmol/L時，對根伸長的抑制率分別達到-9.10%、 64.2%和15.7%，而對莖伸長的抑制率分別為-18.7%、 42.1%和5.90%。當對孟烷-3,8-二醇和草甘膦濃度為5.00 mmol/L，蒈烷-3,4-二醇濃度為4.50 mmol/L，對根伸長的抑制率分別為82.5%、 97.3%和97.2%，而對莖伸長的抑制率分別為61.7%、 83.2%和80.0%。

表4 蒈烷-3,4-二醇在不同濃度下對油菜根和莖伸長的抑制率

表5 蒈烷-3,4-二醇對油菜根長和莖長的毒力回歸方程及半數(shù)抑制濃度

由表5可知，蒈烷-3,4-二醇、對孟烷-3,8-二醇和草甘膦對油菜根長和莖長的毒力回歸方程的R2也均大于0.8，表明抑制率也與濃度密切相關；蒈烷-3,4-二醇、對孟烷-3,8-二醇和草甘膦對根長的IC50分別為1.23、 3.10和0.43 mmol/L，而對莖長的IC50分別為2.12、 2.99和1.14 mmol/L。以上數(shù)據表明，蒈烷-3,4-二醇對油菜的除草活性也高于對孟烷-3,8-二醇，低于草甘膦。

3 結 論

以黑麥草和油菜分別作為單子葉、雙子葉供試植物，考察蒈烷-3,4-二醇的除草活性。結果表明：蒈烷-3,4-二醇能夠抑制黑麥草和油菜根、莖伸長，表現(xiàn)與濃度相關的除草活性；其對黑麥草根、莖伸長的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.12和1.73 mmol/L, 而其對油菜根、莖長的IC50分別為1.23和2.12 mmol/L。蒈烷-3,4-二醇對黑麥草和油菜的除草活性高于與其結構相似的對孟烷-3,8-二醇而低于商業(yè)除草劑草甘膦，并且其在水中的溶解度為4.0 g/L，脂水分配系數(shù)為1.604，但其分子結構中含有兩個在化學反應活性、空間位阻方面有較大差異的羥基官能團，有望通過選擇性衍生化或采用復配技術，協(xié)同或增強其除草活性，可應用于植物源水基除草劑的研究開發(fā)。