劉楊， 劉曉波， 李強， 趙雅娟， 陳永進

1.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院急診與綜合臨床科，陜西 西安（710032）； 2. 廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院口腔科，廣東 廣州（510800）

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorders，TMD）是口頜系統(tǒng)最常見的疾病之一，典型癥狀包括口腔頜面部、顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)持續(xù)的疼痛和下頜功能障礙，嚴重影響患者的正常生活［1-2］。臨床研究顯示，與健康人群相比，慢性TMD 患者的心理失調(diào)情況如焦慮和抑郁情緒的發(fā)病率更高［3-4］；同時患有TMD 和心理疾病的患者，在聯(lián)合給予心理干預(yù)和藥物治療時，顳下頜關(guān)節(jié)疼痛和下頜運動受限的癥狀有所改善［5］。由此可見，心理應(yīng)激是影響TMD 發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的重要因素。

長期的慢性應(yīng)激可導(dǎo)致實驗動物明顯的焦慮抑郁樣行為，并且顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著的損傷與破壞［6］。在去除應(yīng)激因素后，經(jīng)過一段時長的恢復(fù)，髁突軟骨受損的表面超微結(jié)構(gòu)能夠得到較好的自我修復(fù)［7］。炎性因子白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）的局部高表達很可能在慢性應(yīng)激導(dǎo)致的髁突軟骨損傷中發(fā)揮重要作用，造成其出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎樣病變［6,8-9］。IL-1 的高表達可進一步激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的漸進性降解，并對髁突軟骨組織產(chǎn)生破壞［10-11］。

慢性不可預(yù)見性應(yīng)激是一種用于誘導(dǎo)嚙齒類動物焦慮及抑郁樣行為的經(jīng)典動物模型。因其給予的刺激因素多樣且不可預(yù)知，動物較難產(chǎn)生條件性適應(yīng)，從而產(chǎn)生焦慮抑郁樣行為。因此，本研究擬通過對動物施加慢性不可預(yù)見性應(yīng)激后，觀察顳下頜關(guān)節(jié)超微結(jié)構(gòu)與組織學(xué)的變化，進一步明確慢性不可預(yù)見性應(yīng)激導(dǎo)致髁突軟骨損傷的自然恢復(fù)狀況；并觀察軟骨中炎性因子與MMPs 表達水平的變化趨勢。旨在更深入地探究慢性不可預(yù)見性應(yīng)激導(dǎo)致的髁突軟骨損傷的自然轉(zhuǎn)歸特征以及自我修復(fù)的內(nèi)在機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

雄性SD 大鼠（空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，SCXK（陜）2019-001，中國）；自制束縛器；Bw-dfs201型強迫游泳實驗系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司，中國）；大鼠皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、ELISA 試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司，中國）；1∶200 兔抗IL-1α、1∶200 兔抗MMP-3（Abcam Bio 公司，USA），全波段酶標儀（Infinite M200 Pro NanoQuant，TECAN 公司，瑞士）；場發(fā)射掃描電鏡（JSM-6000型，JEOL公司，日本）；低溫離心機（GTR16-2 型，北京時代北利離心機有限公司，中國）；光學(xué)顯微鏡（DM1000，Leica 公司，德國）；氧化物酶/二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）（sigma公司，美國）；Pierce BCA 蛋白檢測試劑盒（Rockford，IL，美國）。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

60 只雄性SD 大鼠（SPF 級，8 周），飼養(yǎng)條件：溫度（24 ± 1）°C，濕度40% ～60%，12 h 光/暗循環(huán)，背景噪聲＜60 dB。所有動物實驗經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會批準（批準號：2020 倫審字081 號）。

1.3 實驗分組

大鼠隨機分為5 組：空白對照組（Control）、應(yīng)激組（Stress）、應(yīng)激去除2 周組（2 week post stress，2w ps）、應(yīng)激去除4 周組（4w ps）、應(yīng)激去除8 周組（8w ps），每組12 只。

1.4 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型建立

對照組大鼠正常狀態(tài)下飼養(yǎng)，不受應(yīng)激刺激。其他4 組的大鼠接受慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable moderate stress，CUMS）［12-13］。

CUMS 主要包括7 種刺激因素：24 h 潮濕墊料、12 h傾斜飼養(yǎng)（飼養(yǎng)籠傾斜30 度角）、4 h 噪音（白噪音80 分貝）、晝夜顛倒、5 min 強迫浸水（水面高度8 cm，大鼠的頭部可位于水面上）、10 min 夾尾（距尾端3 cm）、1 h 的束縛應(yīng)激（大鼠置于彈性鋼絲網(wǎng)制成的束縛器中，在束縛過程中，大鼠的四肢不受限制，但不能自由移動）。每天只施加1 種應(yīng)激方法，1 周為1 個循環(huán)。給予各組大鼠8 周的CUMS，其中應(yīng)激去除8 周組、應(yīng)激去除4 周組、應(yīng)激去除2 周組在第8、12、14 周去除刺激因素恢復(fù)正常飼養(yǎng)，60只大鼠在16周結(jié)束后開始統(tǒng)一進行檢測與取材。各組詳細應(yīng)激過程和取材時間如圖1 所示。

Figure 1 Representative schematic diagrams of detailed procedure of CUMS and sampling time of each group圖1 動物慢性不可預(yù)見性應(yīng)激實驗流程圖

1.5 行為學(xué)測試

各組大鼠在實驗結(jié)束之后的第一天進行行為學(xué)測試。①糖水偏好實驗（sucrose preference test，SPT）[14]：大鼠自由飲用1%的糖水溶液或純水以適應(yīng)1 周。在實驗測試之前，大鼠禁食禁水10 h，然后將其單獨飼養(yǎng)，并在24 h 內(nèi)自由飲用1%的糖水溶液或純水。記錄大鼠消耗糖水和飲用水量，并計算出糖水所占比率。②強迫游泳實驗（forced swim test，F(xiàn)ST）[14]：將大鼠放入一個含有自來水的玻璃圓筒（直徑30 cm，深40 cm）中6 min，強迫其游泳，觀察大鼠的“行為絕望狀態(tài)”。前2 min 為適應(yīng)階段，后4 min 用攝像機記錄大鼠活動狀況，并記錄其“不動”時間。

1.6 血清學(xué)檢測

各組大鼠在實驗結(jié)束之后的第二天取血及取材。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉，心臟采血1.5 mL，冰浴靜置30 min。在4 ℃，3 000 rpm下離心30 min 后分離血清。ELISA 方法檢測血清促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）水平。

1.7 超微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)觀察

各組大鼠在實驗結(jié)束之后的第三天進行超微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)觀察。各組取6 只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 進行麻醉，用頸椎脫位法處死，取出雙側(cè)髁突。一側(cè)髁突軟骨用于超微結(jié)構(gòu)觀察：用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.3）沖洗髁突，然后置于4 ℃的3%戊二醛中固定48 h，在1%的鋨酸中固定1 h，乙醇梯度脫水和噴金，在掃描電鏡下進行觀察；另一側(cè)用于蘇木精和伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色：將髁突軟骨置于4%聚甲醛中浸泡48 h，在15%EDTA 中脫鈣6 周，石蠟包埋，取矢狀面切片（厚5 μm）進行HE 染色，光鏡下進行組織學(xué)觀察。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測

各組取6 只大鼠按照HE 染色方法收集單側(cè)髁突軟骨組織并進行包埋切片，0.01 mol/L PBS 沖洗，0.3% H2O2處理10 min，羊血清37 ℃孵育5 min。加入兔抗IL-1α 和MMP-3，4 ℃過夜；PBS 漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育1 h，使用DAB 顯色5 min，蘇木精復(fù)染1 min。封片后用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，觀察髁突軟骨后1/3 和中1/3 處的正方形區(qū)域并拍照。

1.9 Western blot 檢測

取出另一側(cè)髁突軟骨，12 000 rpm 離心10 min后勻漿，取上清液，在100 ℃下加熱5 min 并冷卻。然后用BCA 蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量。將樣品加入10%SDS-PAGE 凝膠上電泳，轉(zhuǎn)膜（100 mA，40 min）。將轉(zhuǎn)膜結(jié)束的PVDF 膜置于封閉液中1 h，加入一抗：兔抗IL-1α 和MMP-3，4 ℃孵育過夜，以及鼠抗β-actin（1∶5 000）。次日取出PVDF 膜漂洗后，加入二抗室溫孵育2 h。清洗后進行ECL 發(fā)光，并采用Image Lab 軟件分析蛋白印跡的光密度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 19.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，并采用Bonferroni檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢測

應(yīng)激組大鼠血清中CORT 和ACTH 水平與對照組相比明顯升高（P＜0.000 1）；在應(yīng)激去除2 周組中，CORT 和ACTH 水平有下降趨勢，但仍高于對照組（P= 0.030 7，P= 0.000 3）；應(yīng)激去除4 周和8 周后，血清CORT 和ACTH 水平恢復(fù)正常，與應(yīng)激組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）（圖2）。

2.2 行為學(xué)變化

Figure 2 Serological detection before and after removal of chronic unpredictability stress in rats圖2 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后血清學(xué)檢測

與對照組相比，應(yīng)激組大鼠糖水偏好率降低（P=0.000 1），強迫游泳的靜止時間增加（P＜0.000 1）；應(yīng)激去除2 周和4 周，大鼠糖水偏好率有升高的趨勢，但仍低于對照組（P=0.002 5，P=0.047 5），強迫游泳的靜止時間呈減少趨勢，但仍高于對照組（P=0.006 7，P=0.041 0）；應(yīng)激去除8 周后，糖水偏好率和強迫游泳靜止時間接近對照組，與應(yīng)激組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.006 3，P＜0.000 1）（圖3）。

Figure 3 Behavioral detection before and after removal of chronic unpredictability stress in rats圖3 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后行為學(xué)檢測

2.3 超微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)觀察

髁突軟骨表面的掃描電鏡結(jié)果如圖4 所示。在對照組中，髁突表面的纖維排列整齊，并覆蓋了一層波浪狀的凝膠狀物質(zhì)（圖4a）；應(yīng)激組髁突表面凝膠樣物質(zhì)消失，下層的膠原纖維暴露，呈排列紊亂狀態(tài)（圖4b）；應(yīng)激去除2 周后，仍可看到松解的膠原纖維（圖4c）；應(yīng)激去除4 周后，僅觀察到少量的膠原纖維，髁突表面明顯變平（圖4d）；應(yīng)激去除8 周后，髁突表面凝膠樣物質(zhì)增加，再次呈現(xiàn)波紋狀（圖4e）。

大鼠髁突軟骨橫切面的HE 染色見圖5。對照組觀察到有4 層，包括纖維層、增殖層、成熟軟骨細胞層和肥厚層（圖5a）；應(yīng)激組纖維層表面可見纖維碎片和游離細胞，增殖層結(jié)構(gòu)紊亂（圖5b）；應(yīng)激去除2 周后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)仍可見纖維碎片，而增殖層內(nèi)可見一些無細胞區(qū)（圖5c）；應(yīng)激去除4 周和8 周后，纖維層表面光滑、增厚，增殖層仍見無細胞區(qū)（圖5d、5e）。

2.4 IL-1α 和MMP-3 的表達

各組髁突軟骨中IL-1α 表達的免疫組織化學(xué)染色和Western blot 結(jié)果見圖6。在軟骨細胞、細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中IL-1α 均有表達（圖6a ～6e 虛線標出部分），應(yīng)激組髁突軟骨中IL-1α 表達升高（P＜0.000 1）；在應(yīng)激去除2 周后，IL-1α 的表達呈下降趨勢，但仍高于對照組（P= 0.000 2）；在應(yīng)激去除4 周和8 周后，IL-1α 的表達繼續(xù)下降，與應(yīng)激組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1，P＜0.000 1），與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

各組髁突軟骨中MMP-3 表達的免疫組織化學(xué)染色和Western blot 結(jié)果見圖7。在軟骨細胞的細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)MMP-3的表達（圖7a ～7e虛線標出部分）。應(yīng)激8 周后，MMP-3 的表達明顯高于對照組（P＜0.000 1）；應(yīng)激去除后2 周和4 周，MMP-3 的表達逐漸下降，但仍高于對照組（P＜0.000 1，P＜0.000 1）；應(yīng)激去除8 周后，MMP-3 表達趨于正常，與應(yīng)激組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

Figure 4 Scanning electron microscopy images of the ultrastructure of the condylar cartilage before and after removal of chronic unpredictable moderate stress in rats（1 000×）圖4 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后髁突軟骨掃描電鏡結(jié)果（1 000×）

Figure 5 HE staining of condylar cartilage before and after removal of chronic unpredictable moderate stress in rats（200×）圖5 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后髁突軟骨HE 染色(200×)

Figure 6 Immunohistochemical staining（200×）and Western blotting results of IL-1α expression in condylar cartilage before and after removal of chronic unpredictable moderate stress in rats圖6 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后髁突中IL-1α 表達的免疫組織化學(xué)染色（200×）和Western blot 結(jié)果

3 討 論

Figure 7 Immunohistochemical staining(200×)and Western blot results of MMP-3 expression in condylar cartilage beforeand after removal of chronic unpredictable moderate stress in rats圖7 大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激去除前后髁突中MMP-3 表達的免疫組織化學(xué)染色（200×）和Western blot 結(jié)果

大量研究證實，心理因素在TMD 的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中起著重要作用。國際TMD 診斷標準聯(lián)盟已明確提出：心理-社會因素的軸Ⅱ診斷是評估TMD 發(fā)生與持續(xù)可能性的重要指標[2,15]。本課題組前期研究中采用CUMS 來模擬人類日常生活中受到的慢性應(yīng)激[16-17]，連續(xù)給予8 周后，動物可出現(xiàn)顯著的抑郁樣情緒[13]。本研究結(jié)果也顯示，CUMS 應(yīng)激8 周后，大鼠血清中CORT 和ACTH 水平顯著增高，行為學(xué)表現(xiàn)為攝糖減少、FST 實驗中“不動”時間延長，說明出現(xiàn)了明顯的快感缺失、抑郁、絕望情緒，證明CUMS 模型建立成功。一般認為，應(yīng)激可導(dǎo)致機體下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸被激活，誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素水平發(fā)生變化，進一步調(diào)控下丘腦神經(jīng)元表達促腎上腺皮質(zhì)激素，對神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的損傷、修復(fù)和神經(jīng)遞質(zhì)的興奮、抑制都發(fā)揮著重要作用，從而影響著機體社會行為學(xué)的變化[18]。而應(yīng)激去除4 周后，血清學(xué)變化恢復(fù)到正常水平，應(yīng)激去除8 周后，行為學(xué)變化也恢復(fù)到正常水平，可能是應(yīng)激去除后，HPA 軸活動逐漸恢復(fù)正常，異常分泌的CORT 和ACTH 也降低至正常狀態(tài)，啟動神經(jīng)內(nèi)在保護機制，經(jīng)過恢復(fù)時間的延長，大鼠異常行為學(xué)也得到恢復(fù)。因此，筆者認為CUMS 激發(fā)的這種神經(jīng)內(nèi)分泌和行為學(xué)反應(yīng)可以恢復(fù)。

髁突軟骨組織由于其特殊的組織結(jié)構(gòu)［19］，是顳下頜關(guān)節(jié)相對較為脆弱的部分。在髁突軟骨的各層中，軟骨細胞是軟骨的核心成分，并表現(xiàn)出不同的形態(tài)和生物學(xué)功能。本研究通過對髁突軟骨的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CUMS 應(yīng)激8 周后，髁突軟骨表現(xiàn)出明顯的退行性改變，軟骨表面膠原纖維排列紊亂，蛋白多糖合成減少。其中的原因可能如下：①心理應(yīng)激導(dǎo)致下頜骨肌肉過度活動，導(dǎo)致髁突軟骨受到過度壓力［14］，軟骨細胞出現(xiàn)代謝異常［20］，最終導(dǎo)致軟骨損傷；②心理應(yīng)激引起的內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)促進髁突軟骨分泌炎癥因子和蛋白酶，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)發(fā)生降解［6］。

本研究通過對軟骨組織學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)，CUMS引起的髁突軟骨損傷在8 周后均局限于軟骨表面和中間層，并未發(fā)生嚴重的軟骨下骨的損傷，未發(fā)生不可逆損害。因此，去除應(yīng)激因子后，軟骨損傷能逐漸出現(xiàn)自我修復(fù)過程，增殖層細胞呈代償性增殖，出現(xiàn)無細胞區(qū)。這與以往關(guān)于軟骨損傷恢復(fù)過程的研究結(jié)果相似［21］。通過掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)髁突表面的膠原纖維排列紊亂呈下降趨勢。因此，筆者認為CUMS 應(yīng)激8 周后引起的TMJ 髁突軟骨損傷在一定程度上是可逆的。這也與之前的研究結(jié)果一致，即CUMS 導(dǎo)致的髁突損傷僅有細胞的蛋白多糖合成減少、纖維結(jié)構(gòu)保持完整，而此種類別的關(guān)節(jié)損傷可以自然修復(fù)［22］。

以往研究證實，炎性因子在顳下頜關(guān)節(jié)退行性變的進展中起著重要作用。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎往往伴隨著髁突軟骨中炎性因子IL-1 的分泌增多，進一步加重了局部的組織炎癥反應(yīng)［23］。并且，IL-1 可介導(dǎo)軟骨細胞產(chǎn)生多種對軟骨具有破壞性作用的膠原酶和蛋白聚糖酶，如MMP-3［24］，對軟骨基質(zhì)的合成有抑制作用。MMP-3 是最重要的軟骨降解酶之一，與Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的降解密切相關(guān)。有研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨中出現(xiàn)了MMP-3 的高表達［25］。本研究結(jié)果顯示，在正常的髁突軟骨中，只有少量的IL-1α 和MMP-3表達，其中大部分在軟骨肥厚層表達；應(yīng)激8 周后，髁突中的IL-1α 和MMP-3 在各層軟骨的胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)中均有表達，且表達水平顯著升高。這表明CUMS 引起的組織IL-1α 和MMP-3 的局部高表達與髁突軟骨損傷密切相關(guān)，可能是誘發(fā)髁突軟骨基質(zhì)逐漸降解，最終促使細胞崩解的直接原因之一［26］，從而導(dǎo)致髁突軟骨的組織學(xué)損傷。而在去除應(yīng)激因素后，IL-1α 和MMP-3 的表達水平出現(xiàn)明顯的下降趨勢，其中IL-1α 水平在去除應(yīng)激4 周后與對照組達到一致，而MMP-3 的表達恢復(fù)稍慢，在去除應(yīng)激因素8 周后恢復(fù)到正常水平?？赡苡捎贛MP-3 的產(chǎn)生部分是由IL-1α 介導(dǎo)，因此MMP-3 的表達變化存在滯后效應(yīng)。IL-1α 和MMP-3 的表達水平在恢復(fù)期的顯著下降，也提示應(yīng)激引起的軟骨局部炎癥反應(yīng)和基質(zhì)破壞在應(yīng)激去除后逐漸減輕，影響組織修復(fù)的不利因素明顯減弱，可能也是破壞的軟骨組織得到了較好的修復(fù)的因素之一［27］。

綜上所述，本研究表明CUMS 造成的髁突軟骨組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)損傷在去除應(yīng)激因素后8 周可得到較好的修復(fù)；軟骨組織中IL-1α 和MMP-3 的表達水平在去除應(yīng)激因素后明顯降低，可能是調(diào)控髁突軟骨自我修復(fù)過程的內(nèi)在機制之一。研究者在認識TMD 的病因、發(fā)生機制時不能忽視心理因素的重要作用，及時去除應(yīng)激對機體的影響可以逆轉(zhuǎn)或者預(yù)防TMD 患者顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)生的不可逆性改變。

【Author Contributions】 Liu Y and Liu XB performed the experiments and wrote the article. Li Q revised the article. Zhao YJ and Chen YJ designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.