李玉姣， 王瑋， 潘雅婷， 陳力元， 范曉敏， 田宇

軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西 西安（710032）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，其發(fā)病率在不斷升高［1］。最近多項(xiàng)研究報(bào)道了2 型糖尿病與多種口腔疾病易感性之間的密切聯(lián)系，當(dāng)患者的血糖控制不佳時(shí)，多種口腔疾病的發(fā)生率也可能增加［2-3］。齲病是由于口腔內(nèi)產(chǎn)酸菌利用碳水化合物產(chǎn)生酸性副產(chǎn)物，從而對牙齒組織造成破壞［4］。目前，2 型糖尿病和齲病之間的關(guān)系仍存在爭議，關(guān)于齲病和2 型糖尿病聯(lián)系的流行病學(xué)研究有限，且對2 型糖尿病患者齲齒患病率的調(diào)查研究也呈現(xiàn)出矛盾的結(jié)果［5］。有研究表明，2 型糖尿病患者相對于健康人群表現(xiàn)出更高的齲齒患病率和更大的齲病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［6-7］，然而也有研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病和齲齒之間無顯著的關(guān)聯(lián)［8-9］，甚至有研究報(bào)告2型糖尿病患者的齲齒患病率相比正常人降低［10］。

近年來與齲病相關(guān)的微生物學(xué)研究表明，部分產(chǎn)酸耐酸菌（變異鏈球菌、乳酸桿菌）是齲病發(fā)生發(fā)展的主要病原體［11］。此外，白色念珠菌及黏性放線菌也被認(rèn)為是導(dǎo)致根面齲進(jìn)展的致病細(xì)菌之一［12］。變異鏈球菌能感染和定植于牙齒，并在蔗糖存在的情況下促進(jìn)致齲性生物膜的發(fā)展，而其他細(xì)菌包括黏性放線菌、乳酸桿菌、白色念珠菌等能通過加強(qiáng)生物膜環(huán)境的酸化而促進(jìn)齲齒的進(jìn)展［13］。Kampoo 等［14］研究表明2 型糖尿病患者患齲率的升高與產(chǎn)酸耐酸菌屬鏈球菌和乳桿菌的數(shù)量呈正相關(guān)。然而，在另外一項(xiàng)棋盤式DNA-DNA 雜交實(shí)驗(yàn)研究中，糖尿病患者和非糖尿病患者唾液中變異鏈球菌和乳桿菌的數(shù)量無顯著差異［15］。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)以往對2 型糖尿病患者口腔致齲菌變化的研究并不多，且僅局限于菌群變化，未能從功能基因代謝方面進(jìn)行闡述，對2 型糖尿病患者口腔致齲菌變化的了解還不夠完整。宏基因組學(xué)測序技術(shù)具有更高的分辨率，不僅可以發(fā)現(xiàn)一些低豐度的細(xì)菌類群，而且能夠檢測微生物的功能基因，可以更深入地揭示口腔微生物群落的多樣性和復(fù)雜性。

研究發(fā)現(xiàn)，相比唾液微生物，齦上菌斑樣本微生物可能更適合齲病微生物的研究［16-17］，因此本研究選取了未罹患口腔疾病的2 型糖尿病患者的齦上菌斑樣本，利用宏基因組學(xué)測序技術(shù)對2 型糖尿病患者口腔微生物中致齲菌群落分布與功能基因進(jìn)行探究，進(jìn)一步評估2 型糖尿病患者的患齲風(fēng)險(xiǎn)，提高對2 型糖尿病與齲病關(guān)系的認(rèn)識。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)（審批號：KY20212053-F-2），所有研究對象均簽署知情同意書。試驗(yàn)組選取空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科口腔健康的2型糖尿病患者10 例，平均年齡（44.70 ± 11.67）歲，男7 例，女3 例。正常對照組選取社區(qū)人群中口腔健康且不患2 型糖尿病受試者10 例，平均年齡（42.20 ±11.27）歲，男5 例，女5例。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②同意參與本實(shí)驗(yàn)并自愿簽署知情同意書；③全口無齲病、牙周病、口腔膿腫、癌前病變、真菌感染和智齒冠周炎等口腔疾??；④所有受試者的余留牙數(shù)均大于等于28，齲失補(bǔ)指數(shù)（decayed，missing and filled teeth，DMFT）均為0。研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)：①近6 個(gè)月內(nèi)全身使用抗生素或免疫抑制劑等；②患有腫瘤、心腦血管疾病等；③患有艾滋病、乙肝、梅毒等傳染性疾?。虎茉衅诩安溉槠诘膵D女；⑤近6 個(gè)月內(nèi)曾有過任何口腔藥物及手術(shù)治療史。

1.2 主要試劑和儀器

-80 ℃冰箱（MDF-382E（N），三洋公司，日本）；刮匙器（平宇醫(yī)療器械，中國）；DNA 試劑盒（New England Biolabs，美國）；Qubit dsDNA BR 分析試劑盒（Invitrogen，美國）；熒光光度計(jì)（Qubit Fluorometer，美國）；超聲波破碎儀（Covaris，美國）；測序平臺（MGISEQ-2000，中國）。

1.3 樣本采集

所有受試者采樣前一天晚飯后刷牙，然后禁飲食、禁止刷牙，直至第二天早上進(jìn)行齦上菌斑樣本的采集。齦上菌斑樣本：使用無菌刮匙刮取受試者上下頜前牙、前磨牙、磨牙頰舌側(cè)牙頸部菌斑，并置于含有PBS 緩沖液的1.5 mL 無菌EP 管中。對所有采集到的樣本進(jìn)行分組編號（2 型糖尿病組命名為T2DM，正常對照組命名為HC，共20 個(gè)樣本）后置于液氮里冷凍，并在2 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4 樣本DNA 提取

通過NEBNext 微生物組DNA 富集試劑盒提取唾液及齦上菌斑樣本微生物群落DNA。使用Qubit dsDNA BR 分析試劑盒和熒光光度計(jì)對微生物群落DNA 進(jìn)行定量，并在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行質(zhì)量檢查。

1.5 宏基因組學(xué)測序

DNA 提取和純化使用Qubit dsDNA BR 分析試劑盒，按照說明進(jìn)行。用超聲波破碎儀將1 μg 基因組DNA 碎裂，使用磁珠選擇其樣本條帶平均大小為200 ～400 bp 的片段。對篩選出的片段進(jìn)行末端修復(fù)、3’-腺苷酸化、接頭連接和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物用磁珠純化。雙鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)熱變性得到單鏈環(huán)狀產(chǎn)物。去除未環(huán)化的線狀DNA 分子后，得到最終文庫，并通過質(zhì)量控制進(jìn)行鑒定。在MGISEQ-2000 平臺（華大基因-深圳）上對合格文庫進(jìn)行測序。

1.6 宏基因組數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有原始數(shù)據(jù)用SOAPnuke（v.1.5.2）進(jìn)行合并和修剪，使用SOAP（v.2.0）軟件將修剪后的讀數(shù)映射到宿主基因組，以識別和移除源自宿主的讀數(shù)。用MetaGeneMark（v 2.1.0）軟件對以上重疊群基因進(jìn)行預(yù)測。利用R 語言包（v.4.0.5）在物種、功能基因和KO 水平上進(jìn)行分析，根據(jù)reporter score評分值確定差異富集的KEGG 通路，以評分絕對值≥1.65 作為顯著性檢測閾值。使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較不同組間致齲菌分布的特征，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

由表1 可知2 型糖尿病患者組與正常對照組在樣本量、性別比和年齡之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 T2DM 組和HC 組之間臨床特征Table 1 The clinical characteristics of the T2DM and HC groups

2.2 稀疏曲線分析

為了檢驗(yàn)樣本量是否足夠，對2 型糖尿病組和正常對照組齦上菌斑樣本的測序物種數(shù)目進(jìn)行稀疏曲線分析，如圖1結(jié)果所示：稀疏曲線末端隨著樣本量的增加逐漸平緩，說明本實(shí)驗(yàn)樣本量足夠。

2.3 4 種致齲菌變化

評估2 型糖尿病組和正常對照組齦上菌斑中變異鏈球菌、乳酸桿菌、黏性放線菌和白色念珠菌等致齲菌豐度數(shù)值之間的關(guān)系（圖2）。數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（上下四分位數(shù)）描述，并進(jìn)行Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2 型糖尿病組的變異鏈球菌（P=0.257）、黏性放線菌（P= 0.257）、乳酸桿菌（P=0.496）、白色念珠菌（P= 0.879）豐度均略低于正常對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 T2DM 組和HC 組四種致齲菌具體豐度數(shù)值對比Table 2 Numerical comparison of the specific abundance of four cariogenic bacteria between the T2DM and HC groups ［M（P25,P75）］

Figure 1 Analysis diagram of the species rarefaction curve圖1 物種稀疏曲線分析圖

2.4 功能基因代謝途徑分析

為了進(jìn)一步探索2 型糖尿病組和正常對照組齦上菌斑微生物的具體功能基因代謝通路差異，進(jìn)行KEGG pathway 功能基因富集差異通路分析，得到兩組間共有47 個(gè)差異代謝通路（reporter score絕對值＞1.65），作功能代謝通路差異分布圖（圖3）。結(jié)果顯示2 型糖尿病患者齦上菌斑微生物中代謝通路增強(qiáng)的有：鞭毛組件（flagellar assembly）、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝（D-arginine and D-ornithine metabolism）、生物膜形成-大腸桿菌（biofilm formation-escherichia coli）、雙組件系統(tǒng)（two-component system）、己內(nèi)酰胺降解（caprolactam degradation）、精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）、生物被膜形成-銅綠假單胞菌（biofilm formation）、Ⅱ型聚酮主鏈的生物合成（biosynthesis of type ⅡpolyketideⅡ）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）等。而硫胺素代謝（thiamine metabolism）、硒化合物代謝（selenocompound metabolism）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、同源重組（homologous recombination）等代謝通路途徑在2 型糖尿病組是降低的。

3 討論

2 型糖尿病是一種胰島素分泌和作用缺陷引起的以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。這種長期的慢性高血糖會導(dǎo)致碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的缺陷，最終會導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生，如心血管疾病、腎病、周圍神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、中風(fēng)、牙周病等［18］。已有研究表明牙周病與2 型糖尿病有密切聯(lián)系，牙周病已被列為糖尿病的第六大常見并發(fā)癥［19］。但目前對2 型糖尿病和齲病的研究并不多，兩者之間的關(guān)系仍然存在爭議。為了進(jìn)一步了解2 型糖尿病患者與齲病之間的關(guān)系，本研究對未罹患口腔疾病的2 型糖尿病患者的齦上菌斑微生物中的致齲菌進(jìn)行分析，評估2 型糖尿病患者的患齲風(fēng)險(xiǎn)，提高臨床上對2 型糖尿病與齲病關(guān)系的認(rèn)識。

Figure 2 Numerical comparison of the abundance of four cariogenic bacteria between the T2DM and HC groups圖2 T2DM 組和HC 組之間四種致齲菌豐度數(shù)值對比圖

Figure 3 KEGG metabolic pathway enrichment maps comparing the T2DM and HC groups圖3 T2DM 組和HC組KEGG 代謝通路富集圖比較

眾所周知，在牙齒表面定植和存活、分解糖和產(chǎn)生酸性代謝物及耐酸的能力被認(rèn)為是致齲菌引起齲損的基本特征。致齲微生物區(qū)系的特點(diǎn)是產(chǎn)酸和耐酸的種類不成比例地增加，包括變異鏈球菌、乳桿菌、黏性放線菌、白色念珠菌等［20］。變異鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲微生物之一，具有形成生物膜、產(chǎn)生有機(jī)酸和抵抗各種環(huán)境應(yīng)激（如酸性環(huán)境、氧化應(yīng)激）的能力。近年來也發(fā)現(xiàn)了乳桿菌的產(chǎn)酸能力，以及其對弱酸和低pH 環(huán)境的耐受能力［21］。與變異鏈球菌相比，乳桿菌能夠在pH 4.0的條件下生長［22］。黏性放線菌是一種早期在根面定植的微生物，也是根面齲病的重要致病菌［12］，其致齲因素包括很強(qiáng)的細(xì)胞黏附能力和代謝碳水化合物的能力，導(dǎo)致大量酸的產(chǎn)生和牙體硬組織的快速脫礦［23］。白色念珠菌是口腔、呼吸道、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)常見的共生真菌［12］。根面病損中白色念珠菌的分離檢出率約為40%［24］。白色念珠菌具有高產(chǎn)酸、黏附和溶解羥基磷灰石的能力，可穿透牙本質(zhì)小管并與膠原蛋白結(jié)合，在酸性條件下分泌水解酶降解膠原蛋白，促進(jìn)齲齒過程［25］。

本研究結(jié)果顯示，2 型糖尿病患者齦上菌斑微生物中變異鏈球菌、乳酸桿菌、黏性放線菌、白色念珠菌等常見的齲病致病菌與正常對照組均無明顯差異。Hintao 等［15］通過棋盤DNA-DNA 雜交法對2 型糖尿病組和正常對照組的齦上菌斑進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)常見的可疑致齲菌如變異鏈球菌、乳酸桿菌和酵母菌在兩組受試者之間并沒有顯著差異。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者相比于健康人群表現(xiàn)出更豐富的致齲菌或者更高的齲齒患病率［6-7］，可能是因?yàn)檠芯繉ο蟮倪x擇、采樣方式或微生物測序方式的不同。以往研究使用的方法是單純細(xì)菌培養(yǎng)或16S rDNA 測序技術(shù)，并且選擇的并非是口腔健康狀況良好的研究對象。通過本研究結(jié)果，初步推測口腔健康的2 型糖尿病患者的患齲病風(fēng)險(xiǎn)與正常人群可能并無明顯差別，可能和2 型糖尿病患者的生活飲食習(xí)慣有關(guān)［26］，糖尿病飲食中限制精制碳水化合物的攝入，更不容易誘發(fā)齲齒。但是，由于本實(shí)驗(yàn)所選研究對象均無齲病，且樣本量有限，后續(xù)還需要進(jìn)行更全面、樣本量更大的縱向研究，以便更深入探究2 型糖尿病與齲病之間的關(guān)系。

以往研究只能對2 型糖尿病患者口腔致齲菌的物種分布特征進(jìn)行分析，缺乏功能基因水平的研究。本研究通過宏基因組學(xué)測序技術(shù)在功能基因代謝水平上對相關(guān)齲病微生物群進(jìn)行了更深入的研究，觀察到致齲微生物菌群組成結(jié)構(gòu)變化和功能基因代謝通路富集之間存在相關(guān)性。2 型糖尿病患者口腔微生物中變異鏈球菌、乳酸桿菌、黏性放線菌、白色念珠菌等常見的齲病致病菌與正常對照組無明顯差異；在功能基因水平上，有關(guān)代謝途徑精氨酸代謝通路等也在2 型糖尿病患者顯著富集，有利于維持口腔微生態(tài)環(huán)境的酸堿平衡，這有助于解釋2 型糖尿病患者為何致齲菌并未發(fā)生明顯變化。精氨酸的代謝是齦上菌斑生物膜中堿性環(huán)境的主要來源之一［27］。越來越多證據(jù)表明，堿的產(chǎn)生，特別是通過精氨酸代謝產(chǎn)生氨的過程，在pH 穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用［28］。精氨酸主要由精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（arginine deiminase system，ADS）分解，釋放鳥氨酸、氨和二氧化碳，有助于提高環(huán)境pH 值，保護(hù)細(xì)胞免受致死性酸化，且可能影響變異鏈球菌、乳桿菌等產(chǎn)酸耐酸菌的生長及致齲潛能［29］。因此，口腔微生物的代謝活動受口腔微生態(tài)環(huán)境的影響，全身系統(tǒng)性及口腔局部環(huán)境的改變都可能增強(qiáng)或者減弱細(xì)菌的致病性，從而誘導(dǎo)微生態(tài)環(huán)境選擇適合的優(yōu)勢微生物群。口腔疾病的發(fā)生也許不能只觀察某種獨(dú)特的口腔病原體，還應(yīng)考慮到整個(gè)口腔微生物群落及其功能代謝活動。

總之，通過對口腔健康的2 型糖尿病患者口腔微生物的宏基因組學(xué)測序結(jié)果表明，2 型糖尿病組的致齲微生物含量與正常對照組并無明顯差異，功能基因差異代謝途徑中精氨酸代謝通路增加，能夠提高酸性環(huán)境pH 值，有助于維持口腔微生態(tài)壞境的酸堿平衡，初步推測口腔健康的2 型糖尿病患者的患齲風(fēng)險(xiǎn)與正常人群可能并無明顯差別。對2 型糖尿病患者口腔致齲微生物群落的結(jié)構(gòu)特征和功能基因進(jìn)行分析，可為2 型糖尿病患者齲病甚至全身疾病的預(yù)防和治療帶來全新的思路和方法。本研究采用的宏基因組學(xué)測序技術(shù)對2 型糖尿病口腔微生物代謝活動的描述尚不夠全面，且樣本量有限，后續(xù)仍需進(jìn)一步采用代謝組學(xué)的方法繼續(xù)深入探究2 型糖尿病患者口腔微生物的具體代謝通路。

【Author contributions】 Li YJ collected, analyzed the data and wrote the article. Wang W analyzed the data. Pan YT, Chen LY and Fan XM collected and measured the data. Tian Y designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.