王永輝，汪新月，郭衛(wèi)蕓，高雪麗，李光輝*，孫思勝，黃繼紅

（1.許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院 河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標識快檢技術(shù)重點實驗室，河南 許昌 461000）

在食品加工中，姜黃素被廣泛作為調(diào)味劑、防腐劑和著色劑等使用[1-2]。姜黃素具有酚羥基和甲氧基的結(jié)構(gòu)特征，具備與活性氧和氮反應(yīng)的能力[3-4]，其對正常細胞毒性低，但是可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞系死亡[5-8]。姜黃素還具有作為營養(yǎng)補充劑治療關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病的作用[9-10]，以及具有抗菌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化和抗纖維化等多重作用[2-3]。姜黃是一種極具功能食品開發(fā)價值的藥食同源物質(zhì)，其主要有效活性成分為姜黃素，但是姜黃素難溶于水，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，受外界環(huán)境影響也比較大，而且在腸道中代謝快，生物利用率低[11]。研究表明，pH值、鹽離子、溫度以及溶液極性等改變后可以誘導(dǎo)分子間發(fā)生組裝，形成納米級、具有一定幾何外形的膠體顆粒[12]。通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與姜黃素的非共價絡(luò)合作用，兩者共組裝形成的納米級膠體顆粒能夠極大地改善姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性。當前報道的誘導(dǎo)方法主要有pH驅(qū)動法、噴霧干燥法、液體反溶劑沉淀法、凝聚法等[13]。

反溶劑誘導(dǎo)法通過向溶液中加入非溶劑而引起溶質(zhì)過飽和，從而為溶質(zhì)的沉淀提供驅(qū)動力，同時為了維持納米顆粒的穩(wěn)定性，溶液中通常還要有表面活性劑的存在[14]。pH驅(qū)動法通過轉(zhuǎn)變?nèi)芤旱膒H值誘導(dǎo)生物大分子發(fā)生“解離－重構(gòu)”及“去質(zhì)子化-質(zhì)子化”[15]，實現(xiàn)將游離態(tài)姜黃素包埋于大分子內(nèi)部。Dai等[16]利用大豆卵磷脂和玉米醇溶蛋白，通過反溶劑共沉淀制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒，明顯提高了姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性。Chen等[17]通過反溶劑誘導(dǎo)法制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒溶液，使姜黃素的穩(wěn)定性和生物可利用率得到明顯提高。Pan等[18]通過pH驅(qū)動法獲得了具有良好復(fù)溶性的姜黃素復(fù)合納米顆粒。Xu等[19]通過pH驅(qū)動法制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒，姜黃素在酸性環(huán)境下的分散性及穩(wěn)定性均得到提高。這兩種制備方法均能夠有效提高姜黃素的溶解性以及穩(wěn)定性，但由于不同研究間存在試驗原料以及含量的差異，無法對這兩種制備方法進行對比分析，因此這兩種制備方法的優(yōu)劣尚缺乏具體研究。

單純蛋白質(zhì)構(gòu)建的姜黃素納米復(fù)合物在弱酸性食品體系中的穩(wěn)定性較差。研究表明，通過構(gòu)建蛋白/多糖/姜黃素三元復(fù)合物可以解決姜黃素復(fù)合物納米顆粒在弱酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性問題[20]?？扇苄源蠖苟嗵牵╯oluble soybean polysaccharides，SSPS）屬于水溶性膳食纖維，是一種良好的乳化穩(wěn)定劑，其在酸性環(huán)境下具有獨特的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的能力。研究表明，將SSPS作為穩(wěn)定劑可明顯提高蛋白質(zhì)/姜黃素復(fù)合納米顆粒在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性[21]。本研究以酪蛋白酸鈉為載體，通過反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動法分別制備姜黃素復(fù)合物，對比分析兩種制備方法對姜黃素增溶能力的影響，并考察姜黃素復(fù)合物在不同溫度及不同貯藏時間下的穩(wěn)定性，本研究還進一步分析酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，NaCas）復(fù)配SSPS后兩種制備方法對姜黃素增溶能力及其酸性環(huán)境穩(wěn)定性的影響。本研究旨在對比分析反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動法對姜黃素的增溶能力及穩(wěn)定性的影響，為姜黃素在功能食品的應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（純度≥92%）、NaCas（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SSPS（純度≥98%）：河南萬邦實業(yè)有限公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA 2014 B）：上海越平科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-7504）：上海新茂儀器有限公司；磁力攪拌器（ZNCL-DL）：愛博特科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：常州普天儀器制造有限公司；酸度計（PB-10）：德國 Sartorius公司；高速冷凍離心機（JW-2019HR）：安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 反溶劑誘導(dǎo)法制備姜黃素復(fù)合物

參考Wang等[21]的方法制備姜黃素復(fù)合物，并略作修改。用去離子水配制5mg/mLNaCas儲備液，于4℃冰箱放置4 h。將0.4 g姜黃素加入40 mL無水乙醇，充分攪拌后在4℃離心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，將獲得的姜黃素乙醇溶液（10 mg/mL）置于4℃冰箱避光保留備用。取NaCas儲備液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，20℃室溫下，通過磁力攪拌器在1 000 r/min的攪拌速度下，逐滴加入0.5 mL姜黃素乙醇溶液，并持續(xù)攪拌10 min。隨后，將上述混合物在4℃離心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，上清液即為姜黃素復(fù)合物溶液。用去離子水將上清液稀釋40倍，并在425 nm下測初始吸光度。對照組用去離子水替代NaCas溶液，制備過程同上。

1.3.2 pH驅(qū)動法制備姜黃素復(fù)合物

參考Pan等[18]的方法制備姜黃素復(fù)合物，并略有修改。用去離子水配制5 mg/mL NaCas儲備液，于4℃冰箱放置4 h。取NaCas儲備液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，加入5 mg姜黃素粉末，用4 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)整為12.0。在室溫（20℃）下，通過磁力攪拌器在1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌10 min后，用4 mol/L HCl溶液將溶液的pH值調(diào)整為7.0。將該溶液在4℃、8 000 r/min條件下離心8 min除去沉淀，上清液即為姜黃素復(fù)合物溶液。用去離子水將上清液稀釋40倍，并在425 nm下測初始吸光度。對照組用去離子水替代NaCas溶液，制備過程同上。

1.3.3 不同貯藏溫度下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測定

將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別在4、20、50℃ 下放置 30 min，4℃、8 000 r/min離心 3 min后除去沉淀。將上清液用去離子水稀釋40倍后，在425nm下測吸光度，計算保留率。保留率為不同溫度放置后測定的吸光度與初始吸光度的百分比。

1.3.4 不同貯藏時間下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測定

將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別置于4℃避光放置，每隔12 h取2 mL，4℃、8 000 r/min離心3 min，除去沉淀，將上清液用去離子水稀釋40倍后，在425 nm下測吸光度，計算溶液中姜黃素的保留率。保留率為不同放置時間測定的吸光度與初始吸光度的百分比。

1.3.5 不同酸性環(huán)境下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測定

用去離子水將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別稀釋10倍后，將其均分為6份，用0.5 mol/L的鹽酸將上述溶液的 pH 值分別調(diào)整為 7、6、5、4、3、2。將不同pH值的姜黃素復(fù)合物溶液分別在4℃離心（8 000 r/min、3 min），上清液用去離子水稀釋40倍后，在425 nm下測吸光度，計算保留率。保留率為不同pH值下測定的吸光度同pH值為7時吸光度的百分比。

1.3.6 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物溶解能力的測定

在NaCas儲備液中加入0.5%的SSPS，經(jīng)磁力攪拌充分溶解后，分別采用1.3.1中的反溶劑誘導(dǎo)法和1.3.2中的pH驅(qū)動法制備姜黃素復(fù)合物。用去離子水將復(fù)合物溶液稀釋40倍，并在425 nm下測吸光度。

1.3.7 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的測定

將加入SSPS后經(jīng)兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液均稀釋40倍，然后均分為6份，用4 mol/L的HCl溶液分別調(diào) pH 值為 7、6、5、4、3、2。在 4 ℃離心（8 000 r/min、3 min），測定上清液在425 nm的吸光度，并計算保留率。保留率的計算方法同1.3.5。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每項試驗均進行3次獨立測定，結(jié)果以平均值±標準差表示。利用SPSS 19.0進行單因素方差分析（p＜0.05），用 Origin 8進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法對姜黃素增溶作用的比較

制備方法對姜黃素復(fù)合物吸光度的影響見圖1。

圖1 制備方法對姜黃素復(fù)合物吸光度的影響Fig.1 Effects of preparation methods on curcumin complexes

由圖1可知，在利用NaCas同姜黃素非共價結(jié)合制備姜黃素復(fù)合物的過程中，反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動法對于姜黃素的增溶效果差異顯著（p＜0.05）。相對于pH驅(qū)動法，在相同NaCas濃度下反溶劑誘導(dǎo)法對姜黃素的增溶能力可提高近4倍。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能在于pH驅(qū)動法在實施過程中產(chǎn)生較多的鹽離子，鹽離子的存在降低了姜黃素復(fù)合顆粒的表面電荷，從而使顆粒失去穩(wěn)定性，進而導(dǎo)致姜黃素溶解性的降低。研究表明，高鹽離子對姜黃素復(fù)合顆粒的膠體穩(wěn)定性非常不利[20]。另外，在沒有NaCas存在的去離子水中，兩種制備方法對姜黃素的增溶效果差異不顯著（p＞0.05），姜黃素的溶解能力均非常低。這一現(xiàn)象同Chen等[17]、Pan等[18]以及Wang等[21]的研究結(jié)果較為一致。

2.2 不同環(huán)境條件對姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.2.1 貯藏溫度對姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

姜黃素復(fù)合納米顆粒膠體溶液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系，溫度對其穩(wěn)定性的影響較大[20]。貯藏溫度對不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見圖2。

圖2 溫度對不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.2 Effects of temperature on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖2可知，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液隨著貯藏溫度的提升，姜黃素的保留率均出現(xiàn)下降的趨勢。這說明溫度的升高導(dǎo)致姜黃素復(fù)合納米顆粒的膠體穩(wěn)定性下降，部分顆粒出現(xiàn)了聚集沉淀，導(dǎo)致溶液中的姜黃素含量降低。另外，溫度較高時會導(dǎo)致部分姜黃素發(fā)生降解，從而使姜黃素的保留率進一步降低。有研究指出，貯藏溫度越高，姜黃素越不穩(wěn)定，當溫度高于40℃時，姜黃素會發(fā)生明顯的分解[22]。當溫度為4℃時，兩種方式制備的姜黃素復(fù)合物均具有較高的保留率，兩者之間差異不顯著（p＞0.05）。在室溫（20℃）時，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性要優(yōu)于pH驅(qū)動法。當處理溫度為50℃時，雖然姜黃素的保留率均出現(xiàn)大幅下降，但pH驅(qū)動法制備的姜黃素復(fù)合物較反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物的穩(wěn)定性更佳。

2.2.2 貯藏時間對姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

貯藏時間對不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見圖3。

圖3 貯藏時間對不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.3 Effects of storage time on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，兩種方法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率均呈明顯下降的趨勢。但在相同的貯藏時間下，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物的保留率差異顯著（p＜0.05）。pH驅(qū)動法制備的姜黃素復(fù)合物溶液貯藏12 h后，姜黃素的保留率不足70%。而反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率仍高達95%。貯藏時間為48 h時，反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率仍在80%左右，而pH驅(qū)動法中姜黃素的保留率僅有約50%。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因同樣應(yīng)歸因于pH驅(qū)動法中有大量鹽離子的引入，造成溶液的離子強度較高，從而降低了姜黃素納米顆粒的貯藏穩(wěn)定性。因此，在相同的貯藏時間下，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物溶液具有更高的穩(wěn)定性。

2.2.3 溶液pH值對姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

當溶液的pH值靠近蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解性迅速下降，造成蛋白質(zhì)諸多功能性質(zhì)（乳化性、凝膠性及起泡性）喪失[23]。pH值對不同方式制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見圖4。

圖4 pH值對不同方式制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.4 Effects of pH values on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖4可知，隨著溶液pH值的降低，姜黃素在溶液中的保留率呈先明顯降低后趨于平穩(wěn)的趨勢。當溶液的pH值為6時，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物保留率顯著高于pH驅(qū)動法（p＜0.05）。但隨著溶液pH值的進一步下降，兩種方法制備的復(fù)合物中姜黃素的保留率差異不顯著（p＞0.05）。當溶液的pH值為4時，姜黃素在上清液的保留率均僅有10%左右。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因在于當溶液的pH值降低到酪蛋白酸鈉的等電點時，蛋白溶解能力下降，發(fā)生聚集沉淀造成姜黃素發(fā)生共沉淀。另外，研究結(jié)果還表明，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物在低pH值環(huán)境下穩(wěn)定性均較差，具有相同的趨勢。

2.3 添加SSPS后不同制備方法對姜黃素的增溶作用

添加SSPS后不同制備方法對姜黃素復(fù)合物吸光度的影響見圖5。

圖5 添加SSPS后不同制備方法對姜黃素復(fù)合物吸光度的影響Fig.5 Effects of SSPS on the light absorption value of curcumin complexes prepared by different methods

由圖5可知，無論是反溶劑誘導(dǎo)法還是pH驅(qū)動法，NaCas中復(fù)配SSPS后的吸光度均顯著高于單純的NaCas（p＜0.05）。原因可能為 SSPS是一種糖蛋白，其含有的蛋白能夠同姜黃素發(fā)生結(jié)合，從而形成更多的姜黃素復(fù)合物。另外，對于NaCas/SSPS復(fù)合體系，同單純的NaCas體系類似，反溶劑誘導(dǎo)法對姜黃素的增溶能力仍然明顯高于pH驅(qū)動法，前者仍約是后者的4倍。說明相對于NaCas，SSPS對姜黃素的增溶能力非常有限。

2.4 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性

SSPS是一種酸性陰離子多糖，其在食品加工中可作為一種重要的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。SSPS能夠在蛋白顆粒周圍形成一層保護層，當溶液的pH值在蛋白的等電點附近時，蛋白顆粒仍能均勻地分散在溶液中，保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。相關(guān)研究表明，SSPS可以明顯提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定的姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性[19-21]。復(fù)配SSPS對姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的影響見圖6。

圖6 復(fù)配SSPS對姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of compound SSPS on the stability of curcumin complexes in the acidic environment

由圖6可知，溶液pH值的改變對復(fù)合物中姜黃素保留率存在較大影響。隨著溶液pH值的降低，兩種方法制備的復(fù)合物中姜黃素保留率均出現(xiàn)明顯下降的趨勢，但兩者下降的幅度存在明顯的區(qū)別。pH值小于7時，反溶劑誘導(dǎo)法制備復(fù)合物的姜黃素保留率顯著高于pH驅(qū)動法對應(yīng)的保留率（p＜0.05）。對于反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液，隨著pH值的降低，姜黃素保留率下降趨勢較為平緩，基本保持在80%以上。但是pH驅(qū)動法制備的復(fù)合物姜黃素保留率隨pH值的下降呈現(xiàn)出近直線下降的趨勢，pH值為2時僅有10%。因此，通過pH驅(qū)動法制備蛋白質(zhì)姜黃素復(fù)合物時，引入SSPS并不能改善復(fù)合物在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。但是，通過蛋白復(fù)配SSPS，并利用反溶劑誘導(dǎo)法制備則可以改善其在酸性環(huán)境的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

利用食品組分的相互作用，通過制備膠體復(fù)合物可有效改善姜黃素的溶解性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明，反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動法兩種方式均可制備姜黃素復(fù)合物，并能夠顯著提高姜黃素的溶解能力與穩(wěn)定性。相對于pH驅(qū)動法，反溶劑誘導(dǎo)法在相同濃度條件下能更好地增加姜黃素的水溶性，其增溶效果約是前者的4倍。NaCas溶液中添加SSPS后再通過反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物能夠更好的提高姜黃素水溶性及其在酸性環(huán)境的穩(wěn)定性。因此，反溶劑誘導(dǎo)法能夠?qū)S素起到更好的增溶與穩(wěn)定效果，本研究可以為姜黃素在功能食品的應(yīng)用中提供參考。