許 瀅，馮 濤，王化田，宋詩清，姚凌云，孫 敏，柳 倩，于 闖

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香精香料化妝品學(xué)院，上海 201400）

佛手柑（Citrus medicaL.var.sarcodactylis Swingle）又稱佛手、佛手香櫞、蜜筩柑、蜜羅柑、福壽柑、五指柑等，是柑橘屬香櫞種植物[1]，主要種植在我國的浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地。佛手柑果實形狀呈卵形或長圓形，果實前端分裂如拳狀，或張開似指尖[2]。佛手柑具有一定的藥理價值，對腸道、脾胃和心血管疾病等有一定的治療作用，兼具一定的抗炎、抗病毒作用[3-7]。

佛手柑因其特殊的香氣和藥理作用被廣泛研究。Song 等[8]通過頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microe-xtraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對金華佛手柑果肉和果皮的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，并通過最小偏二乘法進(jìn)行分析，確定金華佛手的主要香氣物質(zhì)是檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、辛酸乙酯、芳樟醇、檸檬醛、葉醇和香茅醇等。目前對于佛手柑的研究主要涉及對單一產(chǎn)地或品種佛手柑香氣成分的分析與鑒定，及其抗菌等藥理特性研究[3,9-10]，而對佛手柑不同產(chǎn)地不同品種不同香氣質(zhì)量評價的研究鮮有報道。因此，研究不同產(chǎn)地佛手柑的特征香氣，對今后佛手柑的育種栽植和產(chǎn)品開發(fā)具有一定的理論支持。

目前，物質(zhì)香氣提取的方法有很多，常見的有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[11]、溶劑輔助蒸發(fā)萃?。╯olvent-assisted flavor evaporation，SAFE）[12]、頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）[13]等。其中LLE 可以較全面地提取香氣成分，但存在樣品用量大、耗時長等缺點；SAFE 是一種在真空低溫條件下的提取方法，能對低揮發(fā)性成分進(jìn)行高效提取，可以真實反映原有的風(fēng)味組分，但是存在操作繁瑣、耗時長等問題。而HS-SPME 技術(shù)是佛手柑香氣物質(zhì)提取的常用技術(shù)，具有操作簡便快捷、香氣成分損失較少、靈敏度高等優(yōu)點[13-15]，再通過相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）公式，可以快速篩選檢測物質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分。郝旭東等[16]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GC-MS）、ROAV 分析確定大紅袍花椒的主體風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明烴類、醇類和酯類對四種花椒主體香氣貢獻(xiàn)最大，芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香葉酯、月桂烯對大紅袍花椒整體香氣貢獻(xiàn)度最大。因此，本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，同時結(jié)合ROAV 分析方法確定佛手柑的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。

本試驗首先通過HS-SPME-GC-MS 檢測鑒定佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)成分，隨后查閱相關(guān)物質(zhì)的閾值和香氣特征，通過ROAV 計算，快速篩選出佛手柑中的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，通過主成分分析討論不同地區(qū)佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，為不同產(chǎn)地佛手柑篩選提供理論依據(jù)，同時為各地佛手柑產(chǎn)品開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料全部由金華農(nóng)業(yè)科學(xué)院finger citron 研究所提供，是在成熟期采摘的新鮮佛手柑。試驗的佛手柑品種有三種，分別是浙江金華佛手柑（金佛手，JFC）、廣東佛手柑（廣佛手，GFC）、云南佛手柑（滇佛手，DFC）。

C8～C30系列烷烴，分析純，美國Sigma Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7000D 三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國色譜科公司；30/50 CAR/DVB/PDMS 萃取頭，美國色譜科公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HS-SPME

為保證萃取頭的可靠性，先將萃取頭在250 ℃下老化30 min。將新鮮的佛手柑切碎，每個品種稱取一定量樣品于20mL頂空瓶中，約占瓶身1/3 處，隨后密封置于60℃恒溫水浴鍋中，用萃取頭吸附30 min。最后將萃取頭插入GC-MS 進(jìn)樣口解析5 min。

1.3.2 GC-MS

采用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速保持在1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲5 min。升溫過程：初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至100 ℃，最后以5℃/min 升溫至230℃，保持20min。

質(zhì)譜條件：采用電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍20～3 350m/z。

1.4 香氣成分的定性和定量分析

1.4.1 定性分析

原始數(shù)據(jù)在Nist11 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行匹配定性，選擇匹配度大于90%的揮發(fā)性物質(zhì)[17]。計算化合物的保留指數(shù)值，與查詢的保留指數(shù)記錄進(jìn)行對比定性。保留指數(shù)計算如公式（1）所示。

式中，ta為色譜峰a的保留時間；tn、tn＋1為正構(gòu)烷烴Cn和Cn＋1的保留時間。

1.4.2 定量分析

根據(jù)峰面積歸一化法計算佛手柑中各揮發(fā)性化合物的相對含量[18]。計算公式見式（2）。

式中，M為單個組分香氣物質(zhì)的峰面積；N為總體峰面積。

1.5 ROAV 法確定佛手柑主體風(fēng)味物質(zhì)

參照ROAV 法對佛手柑中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行評價，進(jìn)而確定主體風(fēng)味物質(zhì)[19]。定義對佛手柑樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分：ROAVmax＝100，其他的組分a。計算公式見式（3）。

式中，Ca為揮發(fā)性組分的相對含量，%；Ta為揮發(fā)性組分的感覺閾值，μg/kg；Cmax為對樣品總體香氣貢獻(xiàn)度最大揮發(fā)性組分的相對含量，%；Tmax為對樣品總體香氣貢獻(xiàn)度最大揮發(fā)性組分的風(fēng)味閾值，μg/kg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

氣相色譜分析采用Nist11 數(shù)據(jù)庫，采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用TBtools 進(jìn)行熱圖繪制，采用Origin 2022 繪制PCA 圖和雷達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手柑揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME 提取佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)，并用GC-MS 分析，結(jié)果表明3 個地區(qū)的佛手柑品種共檢出77 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見表1，將這些數(shù)據(jù)篩選處理，繪制成分含量熱圖（圖1），以便直觀地進(jìn)行比較分析。

圖1 佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.1 Heat map of volatile substance content of finger citron

由表1 可知，烴類物質(zhì)在佛手柑中含量占比較大，共檢測出49 種烴類物質(zhì)，其次是醛類和醇類，分別檢測出10 種和8 種。這與Wang 等[20]對佛手柑的檢測基本一致。金佛手中檢測出48 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯的含量最高（35.55%）；廣佛手中檢測出31 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯（11.06%）和雙戊烯（11.59%）含量最高；滇佛手中檢測出47 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯（23.84%）和雙戊烯（24.87%）含量最高。廣佛手的揮發(fā)性物質(zhì)種類顯著少于另外兩種佛手柑。

表1 佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 1 Relative content of volatile substances in finger citron

續(xù)表

續(xù)表

14 種揮發(fā)性物質(zhì)在三個產(chǎn)地的佛手柑中均被檢測出，分別是α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、雙戊烯、香樹烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、石竹烯、金合歡烯、δ-杜松烯、壬醛、橙花醛、十一醛、香葉醇、異亞丙基丙酮。16 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在金佛手中檢測出，其中羅勒烯（1.773%）、左旋-α-蒎烯（4.196%）含量相對較高，高于1%；11 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在廣佛手中檢測出，物質(zhì)百分含量普遍較低，全部低于1%；17 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在滇佛手中檢測出，其中，3-蒈烯（5.799%）、1,5-二甲基-1,5-環(huán)辛二烯（5.063%）含量相對較高。

2.2 佛手柑關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

2.2.1 ROAV 分析

前期在佛手柑中檢測出了多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中一部分關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)對佛手柑的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，其余揮發(fā)性物質(zhì)對佛手柑整體風(fēng)味的呈現(xiàn)只起到修飾和協(xié)同作用。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對佛手柑風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)大小主要由其相對含量和香氣閾值決定。所以，查詢了77 種揮發(fā)性成分的風(fēng)味閾值，共找到37 個化合物的閾值，對查詢到閾值的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了ROAV 計算（見下頁表2）。ROAV≥1 的物質(zhì)對樣品香氣貢獻(xiàn)較大，為關(guān)鍵性香氣化合物，并且ROAV 值越大的物質(zhì)對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)也越大[16]。

由表2 可以看出，三個產(chǎn)地佛手柑共有的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、雙戊烯、石竹烯、壬醛、橙花醛、十一醛和香葉醇。α-蒎烯和β-蒎烯主要表現(xiàn)為木香和草香，d-檸檬烯、雙戊烯和橙花醛表現(xiàn)為柑橘檸檬類香氣，石竹烯和香葉醇主要為佛手柑主體香氣提供花香和蜜甜香，十一醛和壬醛則具有一定油脂氣息。此外，金佛手特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；廣佛手特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；滇佛手中沒有找到特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。金佛手中，d-檸檬烯的ROAV 值最高，為100，其次是香葉醇、芳樟醇和月桂烯，主要香氣特征表現(xiàn)為柑橘果香，輔助香氣為花香、木青香和辛香；廣佛手中，香葉醇的ROAV 是主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物，其次是d-檸檬烯，ROAV值為38.178，主要香氣特征表現(xiàn)為濃郁的柑橘果香，輔以花香修飾；滇佛手中，香葉醇是最大的風(fēng)味貢獻(xiàn)化合物，同時芳樟醇的ROAV 值也高達(dá)76.950，提供木香和草香的青氣。

表2 佛手柑中揮發(fā)性物質(zhì)及其ROAV 值Table 2 Volatile substances and their ROAV values in finger citron

2.2.2 PCA 和風(fēng)味雷達(dá)圖

為進(jìn)一步研究關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對佛手柑風(fēng)味的影響，對佛手柑中ROAV≥1 的16 種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖2（見第41 頁）所示。PC1（60.5%）和PC2（39.5%）的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，月桂烯（F6）和萜品烯（F7）是PC1 中正向載荷值最高的，香葉醇（F27）是PC1 中負(fù)載荷值最高的，α-蒎烯（F3）是PC2 中正向載荷值最高的，萜品油烯（F11）是PC2 中負(fù)載荷值最高的，說明這些化合物對佛手柑的主體香氣貢獻(xiàn)最大。對這16 種關(guān)鍵香氣物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)味雷達(dá)圖構(gòu)建（見第41 頁圖3），金佛手的主體香氣是柑橘香，修飾香氣是花香、木青香和香脂氣息；廣佛手的主體香氣是花香，修飾香氣是柑橘香；滇佛手主體香氣是花香和木青香，修飾香氣是柑橘香。

圖2 佛手柑關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)主成分載荷圖Fig.2 Principal component loadings for key volatiles in finger citron

圖3 不同產(chǎn)地佛手柑的香氣雷達(dá)圖Fig.3 Aroma radar map of finger citron from different regions

3 結(jié)論

本文采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對三個不同產(chǎn)地佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，旨在篩選佛手柑的關(guān)鍵香氣揮發(fā)物。研究共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)77 種，發(fā)現(xiàn)佛手柑中烴類化合物占比最大，其次是醛類和醇類，其中有14 種共有成分。通過查找閾值對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行ROAV 計算，篩選出ROAV 值≥1 的關(guān)鍵香氣成分，共找到22 種關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，其中佛手柑中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯等。佛手柑的主體香氣主要是柑橘果香、蜜甜香、花香和青香。金佛手特有的關(guān)鍵香氣有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；廣佛手特有的關(guān)鍵香氣有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；而滇佛手中沒有找到特有的關(guān)鍵香氣，這些特征香氣物質(zhì)可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地佛手柑的參考依據(jù)。最后對16 個關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)月桂烯、萜品烯、香葉醇、α-蒎烯和萜品油烯對佛手柑的主體香氣貢獻(xiàn)最大。通過香氣雷達(dá)圖確定金佛手的主體香氣是柑橘香，廣佛手的主體香氣是花香，而滇佛手主體香氣是花香和木青香。本研究為三個產(chǎn)地佛手柑的篩選區(qū)分以及后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。