張海峰， 李春英， 陳麗新 ， 王立偉△

（1西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，陜西 西安 710061；2麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000；3暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510632）

細(xì)胞體積過(guò)度變化會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)完整和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而影響其生存；細(xì)胞容積調(diào)節(jié)廣泛參與各種細(xì)胞功能，是細(xì)胞基本的生命活動(dòng)之一［1-2］。突起形成是細(xì)胞局部體積可控性增大的過(guò)程，在多種膜成分（包括離子通道）參與下，以微絲或微管骨架蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的細(xì)胞變形過(guò)程，在細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、細(xì)胞通訊以及吞噬作用等中起著關(guān)鍵作用［3-4］。

容積調(diào)控性陰離子通道（volume-regulated anion channel， VRAC）是一類具有種屬、組織細(xì)胞差異性的復(fù)雜功能蛋白。電壓門控氯通道3（voltage-gated chloride channel 3， ClC-3）被認(rèn)為是VRAC候選蛋白之一，在多種腫瘤組織中異常表達(dá)和（或）功能上調(diào)，與其他相關(guān)蛋白共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等［5-8］。

細(xì)胞膜邊緣形成突起是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞移動(dòng)的關(guān)鍵步驟，課題組前期研究成果顯示：ClC-3不依賴其VRAC通道特性能促進(jìn)遷移細(xì)胞的片狀偽足前緣褶皺形成，可誘導(dǎo)角蛋白18磷酸化從而介導(dǎo)β1-整合素向片狀偽足前緣褶皺處轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于肝癌細(xì)胞遷移；阻斷ClC-3通道功能，不能抑制片狀偽足前緣褶皺形成，但可抑制肝癌細(xì)胞遷移［8-9］。這些結(jié)果提示，分布于遷移細(xì)胞片狀偽足亞區(qū)域的ClC-3借助其VRAC和非VRAC特性發(fā)揮著不同作用。

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)伸出突起，對(duì)于黏附培養(yǎng)基質(zhì)維持其生長(zhǎng)至關(guān)重要。ClC-3能影響細(xì)胞遷移時(shí)片狀偽足的形成，而在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)伸出突起中的作用尚不清楚。因此，本研究擬以高分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1為研究對(duì)象，探討ClC-3對(duì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)伸出突起的影響，有助于深入理解局部細(xì)胞容積調(diào)節(jié)機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

ClC-3抗體購(gòu)自Abcam；β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、細(xì)胞核染料DAPI、氯離子熒光探針MQAE、細(xì)胞膜染料DiI、RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher。

小干擾 RNA（small interfering RNA， siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。經(jīng)高效液相色譜法分離后再行電泳檢測(cè)，siRNA的5'端攜帶FAM熒光標(biāo)記物。陰性對(duì)照（negative control， NC）siRNA的序列為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，ClC-3特異性siRNA的序列為5'-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3'。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 CNE-1細(xì)胞購(gòu)自湖南湘雅典型培養(yǎng)物保藏中心［10］，用含新生牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)在5%CO2、100%濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞懸液種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞融合率達(dá)到30%～50%，按照以下簡(jiǎn)要步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞：不含血清和抗生素的培養(yǎng) 液 分別 稀 釋 LipofectamineTM2000（1∶40）和 20 μmol/L siRNA（1∶20）；室溫孵育5 min后，將上述懸液混合，再孵育20 min；將siRNA和LipofectamineTM2000混合溶液逐滴緩慢滴加到各組實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)，各組siRNA終濃度為100 nmol/L；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后換正常培養(yǎng)液，待轉(zhuǎn)染48 h行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫熒光 CNE-1細(xì)胞懸液種于內(nèi)貼無(wú)菌圓形蓋玻片（直徑6 mm；面積28.26 mm2）的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)或貼壁后，4%低聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min；PBS洗滌細(xì)胞6次后，0.5%Triton X-100孵育細(xì)胞5 min；PBS洗滌細(xì)胞6次后，采用10%血清室溫下封閉細(xì)胞45 min；用1%血清洗滌細(xì)胞一次，4 ℃過(guò)夜孵育ClC-3稀釋抗體；1%血清洗滌細(xì)胞6次后，室溫下孵育稀釋Ⅱ抗1 h；PBS洗滌細(xì)胞6次后，DAPI染細(xì)胞核5 min；最后PBS洗滌細(xì)胞3次后，50%甘油碳酸鹽緩沖液封片，指甲油封邊。在Nikon C1-Si激光共聚焦顯微鏡下，觀察熒光標(biāo)記并拍照。

2.3 Western blot siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞48 h后，RIPA裂解液（含終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF）冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃離心（9 720×g）裂解液后收集上清液；BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)準(zhǔn)化為相同濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。12% SDS-PAGE分離蛋白，每個(gè)泳道上樣量不少于40 μg；半干法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；室溫下，5%脫脂奶粉溶液封閉膜2 h后，4 ℃過(guò)夜孵育Ⅰ抗，TBS洗脫未結(jié)合或非特異結(jié)合的Ⅰ抗；室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗2 h后，TBS洗脫未結(jié)合或非特異結(jié)合的Ⅱ抗；采用化學(xué)發(fā)光法顯示硝酸纖維素膜上目的蛋白，Alliance 4.7凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行灰度分析。

2.4 氯離子熒光探針檢測(cè) MQAE熒光染料最大激發(fā)波長(zhǎng)約為355 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為460 nm，其熒光強(qiáng)度隨著氯離子濃度的增加而成比例減?。?1］。因未配備波長(zhǎng)355 nm左右激光模塊，擬采用408 nm激光激發(fā)MQAE，分析其發(fā)射光譜特性后用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氯離子。

常規(guī)胰酶消化CNE-1細(xì)胞后種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后更換含5 mmol/L MQAE的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h ；采用408 nm激光激發(fā)MQAE，采集415～570 nm區(qū)間發(fā)射光光譜數(shù)據(jù)，觀察不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度特征，并進(jìn)行擬合計(jì)算其最大發(fā)射光波長(zhǎng)。408 nm激光激發(fā)含不同濃度 Cl-溶液（0、1.25、2.5、5、10、20、40、60、80、120和140 mmol/L），采集各組最大發(fā)射光熒光強(qiáng)度，繪制濃度-熒光強(qiáng)度曲線，與前期研究結(jié)果比較。

CNE-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)12 h待其伸出突起，更換含5 mmol/L MQAE的細(xì)胞培養(yǎng)液后繼續(xù)孵育1 h；接著，膜熒光DiI染料室溫染色10 min，洗脫干凈后放入培養(yǎng)箱平衡30 min；而后在激光共聚焦顯微鏡下，用408 nm激光和515/30濾片組觀察MQAE熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

2.5 單通道膜片鉗 CNE-1細(xì)胞懸液滴在無(wú)菌圓形蓋玻片（直徑22 mm；面積379.94 mm2）上過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)出突起后，將蓋玻片放置灌流槽內(nèi)，持續(xù)灌流等滲液（70 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L HEPES 和 140 mmol/L D-甘露醇）。采用EPC-7型膜片鉗放大器（Heka）和CED1401型數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Cambridge Electronic Design）鉗制膜電位并記錄電流，其步驟如下：含有等滲灌流液的玻璃微電極入水并調(diào)節(jié)液接電位；三維操縱儀操控微電極使其尖端輕壓細(xì)胞，在吸管內(nèi)施加負(fù)壓，使吸管尖端與記錄膜片表面形成GΩ級(jí)封接（giga-seal）并補(bǔ)償電容；等滲液持續(xù)灌流，按預(yù)先設(shè)置的指令電壓±20、±40、±60、±80、±120和0 mV循環(huán)鉗制膜電位，記錄電流；分析電流特性并計(jì)算電流密度，計(jì)算公式為：電流密度（pA/pF）=細(xì)胞電流值（pA）/細(xì)胞電容（pF）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 12.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）形式表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ClC-3在CNE-1細(xì)胞突起局部分布明顯

體外培養(yǎng)的永生化鼻咽上皮細(xì)胞和低分化鼻咽癌細(xì)胞分別呈長(zhǎng)梭形或多角形，而CNE-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)會(huì)向多個(gè)方向伸出明顯的突起。為探討ClC-3在細(xì)胞膜伸出突起中的作用，我們首先分析了ClC-3蛋白在CNE-1細(xì)胞中的分布情況。如圖1所示，貼壁生長(zhǎng)的CNE-1細(xì)胞朝不同方向伸出片狀偽足，其上有數(shù)量不等的絲狀偽足；Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記抗體識(shí)別ClC-3蛋白呈綠色，ClC-3主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，少量分布在細(xì)胞核，且在細(xì)胞膜分布有明顯聚集特性，即細(xì)胞膜突起形成部位較多。

2 氯離子熒光探針檢測(cè)CNE-1細(xì)胞氯通道活動(dòng)

為觀察CNE-1細(xì)胞膜突起處ClC-3通道活動(dòng)，利用MQAE熒光染料檢測(cè)該部位氯離子濃度，以探討氯通道活動(dòng)。如圖2A、B所示，CNE-1細(xì)胞孵育MQAE染料后，利用408 nm激光激發(fā)后收集MQAE發(fā)射光光譜數(shù)據(jù)，各細(xì)胞最大熒光強(qiáng)度的發(fā)射光波長(zhǎng)均在520 nm左右；對(duì)19個(gè)發(fā)射光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合計(jì)算，得到最大發(fā)射光波長(zhǎng)的理論值為521 nm（圖2C）。接著，利用408 nm波長(zhǎng)激光和515/30 nm濾片組測(cè)定不同濃度氯離子（1.25～140 mmol/L）的MQAE熒光強(qiáng)度，濃度-熒光強(qiáng)度曲線顯示：熒光強(qiáng)度隨著氯離子濃度的增加而減?。▓D2D）。

CNE-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)伸出突起后，MQAE和DiI熒光染料分別孵育細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞突起處MQAE熒光。如圖2E～G所示，408 nm激光激發(fā)MQAE后呈綠色熒光，胞體熒光強(qiáng)度不均一；DiI標(biāo)記胞膜脂質(zhì)呈紅色熒光，可見(jiàn)片狀偽足及絲狀偽足的MQAE熒光弱，而胞膜伸出片狀偽足起始處的MQAE熒光強(qiáng)（片狀偽足根部）。

3 吸附式單通道膜片鉗記錄CNE-1細(xì)胞突起部位氯通道活動(dòng)

Figure 1. Identification of ClC-3 in well-differentiated nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells （scale bar=10 μm）. The CIC-3 protein in CNE-1 cells was labeled with Alexa Fluor 488 （green）， and cellular nuclei were stained with DAPI. The white arrows showed ClC-3 clustering in the protrusion of the cell membrane.圖1 免疫熒光標(biāo)記高分化鼻咽癌細(xì)胞ClC-3氯通道

如圖3所示，在倒置顯微鏡下，記錄微電極吸附突起根部胞膜并形成GΩ級(jí)封接；去極化電位能誘使單通道開(kāi)放頻率增加，在-120 mV鉗制電壓下，該通道電導(dǎo)約為78.4 pS；依據(jù)電流-電壓關(guān)系，計(jì)算出該電流的翻轉(zhuǎn)電位為4.06 mV，其值遠(yuǎn)離鈉離子和鉀離子平衡電位，接近氯離子平衡電位。

4 下調(diào)ClC-3表達(dá)抑制CNE-1細(xì)胞突起形成

為探討細(xì)胞突起形成中ClC-3蛋白的作用，觀察下調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)對(duì)CNE-1細(xì)胞突起形成之影響。FAM標(biāo)記的NC siRNA和ClC-3siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞24 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到幾乎所有細(xì)胞都帶有綠色熒光（圖4A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NC siRNA和ClC-3siRNA組轉(zhuǎn)染率均大于90%（圖4B）。ClC-3siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示ClC-3蛋白表達(dá)量顯著降低（圖4C）。

CNE-1細(xì)胞懸液種植于細(xì)胞培養(yǎng)板，待其貼壁后行siRNA轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染6 h時(shí)，對(duì)照組、NC siRNA組以及ClC-3siRNA組細(xì)胞向多方向伸出明顯突起，包括片狀偽足和絲狀偽足；轉(zhuǎn)染30 h時(shí)，胰酶消化細(xì)胞至突起消失時(shí)即刻終止消化，細(xì)胞變圓無(wú)偽足；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48 h，對(duì)照組和NC siRNA組細(xì)胞伸出明顯的片狀偽足，ClC-3siRNA組細(xì)胞無(wú)片狀偽足伸出，而3組細(xì)胞均有數(shù)量不等的絲狀偽足形成（圖5）。

討 論

細(xì)胞膜突起形成是典型的局部細(xì)胞容積調(diào)節(jié)。機(jī)體發(fā)育、免疫應(yīng)答、傷口愈合、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中，細(xì)胞膜邊緣突起并形成片狀偽足是驅(qū)使細(xì)胞移動(dòng)的關(guān)鍵步驟；在神經(jīng)突起生長(zhǎng)過(guò)程中，神經(jīng)元胞體在特定部位伸出軸突和樹(shù)突的第一步亦是胞膜形成突起；細(xì)胞在體內(nèi)、外生長(zhǎng)時(shí)，伸出突起是細(xì)胞粘附基質(zhì)或探測(cè)外界信號(hào)，從而維持其生長(zhǎng)的策略［12-14］。

VRAC分布廣泛，參與多種生理和（或）病理生理過(guò)程，然而其分子本質(zhì)卻一直存在爭(zhēng)議。由先天性丙種球蛋白缺乏癥患者分離出的含富亮氨酸重復(fù)蛋白8A （leucine-rich repeat-containing 8A， LRRC8A）［15］，被認(rèn)為是VRAC的主要組分［16-17］。但并非所有組織細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)皆由LRRC8A介導(dǎo)，例如：bestrophin 1蛋白在小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞缺乏表達(dá)，而人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞卻依賴其進(jìn)行容積調(diào)節(jié)［18］；囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子CFTR參與小腸上皮、呼吸道上皮的細(xì)胞容積調(diào)節(jié)，以及anoctamin 1通道蛋白是外分泌腺、脈絡(luò)叢等處細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的主要參與者［19］；人表皮樣癌KCP-4細(xì)胞缺乏VRAC氯電流并不取決于LRRC8A的低表達(dá)；TTYH1和（或）TTYH2介導(dǎo)胃癌SNU-601細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞VRAC氯電流，不依賴LRRC8A表達(dá)［20］。可見(jiàn)，VRAC分子本質(zhì)具有多樣性。

本課題組前期已證實(shí)ClC-3是介導(dǎo)鼻咽上皮細(xì)胞及鼻咽癌細(xì)胞VRAC電流的主要成分，參與細(xì)胞增殖、凋亡等［5-6，21］。ClC-3促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞G1-S期過(guò)渡，與其影響cyclin D1、CDK4/6及CDK抑制因子p21/p27表達(dá)有關(guān)［22］，且 cyclin D1/CDK4或6可通過(guò)磷酸化調(diào)控ClC-3通道功能［5］。鼻咽癌細(xì)胞凋亡早期，ClC-3蛋白表達(dá)短暫上調(diào)［6，23］；紫杉醇誘導(dǎo)的聚合微管蛋白可持續(xù)激活ClC-3通道開(kāi)放，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性容積減?。?］。

遷移細(xì)胞前緣伸出片狀偽足，是局部體積可控性增大的過(guò)程。阻斷ClC-3蛋白表達(dá)或功能，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、表皮干細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的遷移［24-28］。ClC-3參與遷移細(xì)胞片狀偽足前緣褶皺的形成，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移［8-9］。這些提示ClC-3在細(xì)胞膜伸出突起形成片狀偽足過(guò)程中具有一定作用。本研究下調(diào)CNE-1細(xì)胞ClC-3蛋白后，觀察到細(xì)胞無(wú)片狀偽足伸出，而有數(shù)量不等的絲狀偽足形成，說(shuō)明ClC-3參與貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)片狀偽足的形成，而對(duì)絲狀偽足的形成影響可能較小。

Figure 2. Activities of chloride channels detected by chloride sensitive fluorescent probe MQAE in CNE-1 cells. A： images of fluorescent emission spectrum of MQAE excited by the 408 nm laser； B： curves of intensity and wavelength for the MQAE fluorescent emission spectrum of the 4 representative CNE-1 cells； C： the calculated curve of intensity and wavelength for the MQAE fluorescent emission excited by the 408 nm laser （19 cells）； D： the curve of Cl- concentration （1.25～140 mmol/L）and fluorescence intensity of 515/30 nm emission excited by the 408 nm laser （n=4 to 6）； E： fluorescent image （scale bar=10 μm） of Cl- detected by MQAE （green） in CNE-1 cells； F： merged image （scale bar=10 μm） of Cl- fluorescence and cell membrane fluorescence stained by DiI（red）； G： pseudo-color image （scale bar=10 μm） of MQAE fluorescent emission corrected using the Nikon NIS-Elements AR software.圖2 氯離子熒光探針檢測(cè)CNE-1細(xì)胞氯通道活動(dòng)

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)伸出突起與遷移細(xì)胞突起形成的生物學(xué)意義不盡相同，但二者形態(tài)變化相似，均是局部體積可控性增大的過(guò)程。ClC-3和水通道3（aquaporin-3， AQP-3）可形成蛋白復(fù)合體，協(xié)同調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減小過(guò)程；此外，在CNE-1細(xì)胞突觸處，我們觀察到大量ClC-3位于AQP-3后方［29-30］。鑒于二者在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中相互作用，其在突觸處的典型分布對(duì)突起形成有何意義，尚待進(jìn)一步闡述。

本研究結(jié)果顯示細(xì)胞突起延伸部位MQAE熒光弱，Cl-濃度高，而突起根部MQAE熒光強(qiáng)，Cl-濃度低；活躍的ClC-3通道蛋白在突起根部大量聚集，可能是導(dǎo)致該部位Cl-濃度低的主要原因之一；從細(xì)胞突起一側(cè)至突起根部，存在著Cl-濃度梯度差。ClC-3在突起膜分布較少，Cl-可從高濃度的突起側(cè)擴(kuò)散至低濃度突起根部，ClC-3通道開(kāi)放致Cl-外流，并帶動(dòng)由突起前緣進(jìn)入的水分子外流，從而調(diào)控細(xì)胞膜局部延伸形成突起或偽足。

Figure 3. Activities of chloride channels recorded by single-channel patch-clamp of the cell-attached model in the protrusions of CNE-1 cells. A： the protrusion root of the CNE-1 cell was attached and sealed by the recording pipette filled with the isotonic solution （×200）； B： the typical traces of Cl- currents of a single channel at the clamped voltage of 120， 80， 40， 0， -40， -80 and -120 mV； C： the current-voltage relationship of a single chloride channel （n=7）.圖3 吸附式單通道膜片鉗記錄CNE-1細(xì)胞突起部位氯通道活動(dòng)

Figure 4. Down-regulation of ClC-3 protein expression by small interfering RNA（siRNA） in CNE-1 cells. A： CNE-1 cells were observed under laser confocal microscope （scale bar=50 μm）； B： the transfection efficiency of NC siRNA and ClC-3 siRNA in CNE-1 cells detected by flow cytometry； C： the protein expression of ClC-3 in CNE-1 cells down-regulated by siRNA was assayed by Western blot. Mean±SEM. n=4. **P＜0.01 vs NC siRNA group.圖4 小干擾RNA下調(diào)CNE-1細(xì)胞ClC-3蛋白表達(dá)

Figure 5. Down-regulation of ClC-3 inhibited the formation of CNE-1 cell protrusions （scale bar=20 μm）. The columns from the left to the right showed the images of CNE-1 cells transfected with siRNA for 6， 30 and 48 h， respectively. The cells were digested by trypsin in the 30 h column.圖5 下調(diào)ClC-3蛋白抑制CNE-1細(xì)胞突起形成

綜上所述，ClC-3通過(guò)參與細(xì)胞突起部位Cl-濃度梯度差的維持，從而調(diào)控細(xì)胞片狀偽足的形成，是其調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的可能途徑之一。然而，在細(xì)胞膜突起延伸形成片狀偽足的過(guò)程中，ClC-3和AQP-3協(xié)同機(jī)制亟待進(jìn)一步探討。