楊韻儀，曹沐曦，陳文榮，萬芝力,*，方素瓊,*，楊曉泉

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食物蛋白與膠體研究中心，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510641；2.仙樂健康科技股份有限公司，廣東 汕頭 515041）

提取自海洋藻類的藻油中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量高、安全可持續(xù)，然而藻油不溶于水，且DHA極易氧化變質(zhì)產(chǎn)生酸、醛、酮等氧化物，影響風(fēng)味、口感的同時(shí)也帶來健康風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。目前，食品工業(yè)常將其密封于軟膠囊中以隔絕外界的氧化因子，但是存在食用不便、應(yīng)用形式單一等缺陷，無法滿足人們對多樣化藻油產(chǎn)品日益增長的需求。研究團(tuán)隊(duì)已成功利用小分子甜菊糖（stevioside，STE）改善大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的乳化特性，構(gòu)建出高穩(wěn)態(tài)的納米乳液體系[3-5]。此外，SPI-STE復(fù)合體系已被證明能作為優(yōu)良載體用于包埋多種天然活性成分[3,5-6]，可用于開發(fā)藻油納米乳液，滿足嬰幼兒、老人等特殊人群的日常補(bǔ)充需求的同時(shí)，對拓展藻油在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)、特醫(yī)食品等新興領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要意義。

然而，O/W納米乳液含有豐富的水相以及比表面積極大的油水界面，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)快速氧化，這將嚴(yán)重限制該技術(shù)在藻油開發(fā)中的應(yīng)用[7-8]。傳統(tǒng)的抗氧化劑技術(shù)無法穩(wěn)定高度不穩(wěn)定的脂質(zhì)（胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等），目前正在開發(fā)新技術(shù)以改變?nèi)橐旱奈锢硇再|(zhì)，從而抑制脂質(zhì)氧化反應(yīng)，如填充型水凝膠和油相結(jié)構(gòu)化乳液[9-11]。其中，油相結(jié)構(gòu)化策略通過將脂質(zhì)捕獲在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，從而降低其與水相氧化因子的接觸，有效提高乳液的抗氧化性[7-9]。蜂蠟是一種常用的天然蠟，具有安全無毒、凝膠性優(yōu)異、可塑性強(qiáng)、穩(wěn)定性高等優(yōu)良特性，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局的食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)允許使用，且沒有進(jìn)行添加量的限制[12]。近年來，蜂蠟作為脂質(zhì)結(jié)構(gòu)化助劑已被成功用于制備各種尺度的乳液[13-14]，在脂質(zhì)抗氧化方面的研究仍停留在微米尺度。Wei Feilong等[15]比較了蜂蠟和單甘脂作為油相結(jié)構(gòu)劑對乳液氧化的影響，結(jié)果表明蜂蠟?zāi)苄纬筛旅艿挠湍z網(wǎng)絡(luò)，從而賦予乳液更好的氧化穩(wěn)定性，延緩氧化效果并隨蜂蠟添加量的增加而增強(qiáng)，然而蜂蠟結(jié)構(gòu)化策略能否在納米乳液中展現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化效果還有待考究。

為探究蜂蠟結(jié)構(gòu)化對藻油納米乳液穩(wěn)定性的影響，本研究首先研究蜂蠟對藻油的結(jié)構(gòu)化行為，然后以SPI-STE復(fù)合體系作為乳化劑制備藻油納米乳液，評估蜂蠟結(jié)構(gòu)化對藻油納米乳液形成及物化穩(wěn)定性的影響，并嘗試通過調(diào)控油相結(jié)構(gòu)化構(gòu)建高穩(wěn)定性的藻油納米乳液體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藻油（DHA含量≥40%） 內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司；蜂蠟（酸值17.5 mg/g，皂化值89.1 mg/g，碘值9.3 mg/g，均以KOH計(jì)算） 北京麗康偉業(yè)科技有限公司；低溫脫脂豆粕 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；STE（純度＞90%） 山東海根生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Million-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Axioskop 40 Pol偏振光顯微鏡 德國Zeiss公司；U-HGLGPS多功能光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；RS600HAKKE流變儀 美國賽默飛世爾科技公司；TGA/DSC1差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 瑞士梅特勒-托利多公司；T25 digital ULTRA TURRAX高速剪切機(jī) 德國IKA公司；M-110-EH-30高壓微射流納米均質(zhì)機(jī) 美國MFIC公司；DELTA冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Multimode SPMBX51原子力顯微鏡 美國維易科精密儀器有限公司；Nano-ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；7890B氣相色譜儀 美國安捷倫科技公司；NanoPhotometer C40 Touch紫外分光光度計(jì)德國Implen公司；EC-TL01B紫外燈 廣東省佛山益辰電子科技有限公司；TANKPE060純水機(jī) 法國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 藻油凝膠的制備

取不同質(zhì)量的蜂蠟至藻油中，于80 ℃水浴鍋中攪拌加熱 3 min后蜂蠟完全溶解，自然冷卻至室溫，放置24 h，得到含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、2%、3%、4%、6%、8%）蜂蠟的藻油凝膠。

1.3.2 藻油納米乳液及油粉的制備

以SPI-STE復(fù)合體系為乳化劑制備藻油納米乳液[5]。參考萬芝力[3]的堿溶酸沉方法制備SPI，經(jīng)杜馬斯燃燒定氮法測得SPI凍干粉蛋白含量為（97.18±0.56）%。將SPI分散于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），攪拌2 h后置于4 ℃水化過夜。取一定量的STE粉末至10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，攪拌至澄清。使用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)SPI和STE溶液至pH 7.0，隨后將兩者混合并攪拌30 min，獲得SPI-STE復(fù)合體系。

將藻油凝膠80 ℃水浴加熱3 min，按油相與水相質(zhì)量比1∶9加入處于相同溫度（80 ℃）的SPI-STE復(fù)合體系中，攪拌獲得油水混合液。將混合液先進(jìn)行高速剪切機(jī)預(yù)均質(zhì)（5000 r/min，2 min），隨后立即進(jìn)行高壓均質(zhì)處理（50 MPa，2 次），制得納米乳液。乳液制備過程中樣品溫度始終保持在80 ℃。最終乳液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的油相、1% SPI和0.5% STE。向乳液中加入0.04%疊氮鈉防止染菌。

油粉由新鮮乳液冷凍干燥得到。

1.3.3 藻油凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

利用放大倍數(shù)為1000 倍的明場和偏光顯微鏡觀察藻油凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。將樣品80 ℃水浴加熱3 min，趁熱將5 μL融化樣品滴在預(yù)熱的載玻片上，并用預(yù)熱的蓋玻片輕輕覆蓋，室溫下靜置24 h后觀察樣品。

1.3.4 藻油凝膠熱力學(xué)性質(zhì)測定

采用DSC測量藻油凝膠融化和結(jié)晶的相變行為。取適量樣品放入坩堝，以空坩堝作為對照。加熱樣品，2 ℃/min速率從20 ℃加熱到85 ℃，保溫10 min，以相同速率冷卻至初始溫度。

1.3.5 藻油凝膠流變學(xué)性質(zhì)測定[16]

振蕩測試：分別在應(yīng)力0.1～1000 Pa、頻率1 Hz和頻率0.1～50 Hz、應(yīng)力1 Pa條件下進(jìn)行應(yīng)力掃描和頻率掃描，測定藻油凝膠樣品的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G’’）。

流動(dòng)測試：在剪切速率0.01～100 s-1條件下記錄樣品表觀黏度的變化。選用直徑35 mm平板，間隙1 mm，測試溫度25 ℃。

1.3.6 藻油包封率測定[17]

取0.5 mL乳液至離心管中，稱量乳液（m1）與離心管質(zhì)量（m2）。加入1 mL己烷，5000 r/min離心10 min分離乳液與己烷。用針管將下層乳液全部吸出，加入離心管，用己烷潤洗針管，加入離心管。將離心管敞口放置在通風(fēng)櫥內(nèi)使己烷完全揮發(fā)，稱量離心管終質(zhì)量（m3）。按下式計(jì)算藻油包封率：

1.3.7 乳液粒度和Zeta電位測定

將乳液用pH 7.010 mmol/L磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，用Nano-ZS納米粒度及Zeta電位分析儀測定乳液的平均粒徑、多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）和Zeta電位。參數(shù)設(shè)置：分散相（藻油）折射率1.503，吸收率0.002；連續(xù)相折射率1.333；測試溫度25 ℃。

1.3.8 乳液貯存穩(wěn)定性測定

將乳液于25 ℃貯存30 d后，按1.3.7節(jié)步驟測定乳液的粒度變化。

1.3.9 脂質(zhì)氧化穩(wěn)定性測定

熱促氧化條件：將新鮮乳液放入40 ℃恒溫箱中貯存30 d；光促氧化條件：用紫外燈照射新鮮乳液8 h，紫外線波長為254 nm，光輻照度為6.9 mW/cm2。根據(jù)杜振亞[18]的方法分別在熱促氧化和光促氧化條件下測定乳液脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量。

1.3.9.1 一級氧化產(chǎn)物脂質(zhì)氫過氧化物含量測定

取200 μL乳液，加入1.5 mL異辛烷-異丙醇溶液（3∶1，V/V），渦旋振蕩3 次，每次持續(xù)10 s，5000 r/min離心5 min。取200 μL上清液，加入2.8 mL甲醇-正丁醇溶液（2∶1，V/V），依次加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液和15 μL二價(jià)鐵離子溶液（等體積混合0.132 mol/L氯化鋇和0.144 mol/L硫酸亞鐵），混勻，密封靜置20 min后于510 nm波長處測定吸光度。使用30%過氧化氫溶液制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（50、100、200、300、400、500 μmol/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9.2 二級氧化產(chǎn)物含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定二級氧化產(chǎn)物丙二醛的含量。取200 μL乳液，加入1.8 mL去離子水，混勻，加入4 mL硫代巴比妥酸試劑，漩渦振蕩3 次，每次持續(xù)10 s，隨后沸水浴15 min。冷卻至室溫后6000 r/min離心20 min，取上清液，于535 nm波長處測定吸光度。使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（2、5、10、20、30、40 μmol/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用動(dòng)態(tài)頂空法檢測揮發(fā)性二級氧化物己醛的含量。取10 mL新鮮乳液于頂空瓶中，40 ℃避光靜置30 d后使用氣相色譜儀測定己醛含量。色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：以4 ℃/min從40 ℃上升到50 ℃，隨后立即以5 ℃/min上升到100 ℃，再以8 ℃/min上升到230 ℃；進(jìn)樣口和火焰離子化檢測器溫度均為250 ℃。載氣為氮?dú)?，流?.0 mL/min，分流比1∶1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多組樣品間差異顯著性分析，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻油凝膠的理化性質(zhì)研究

2.1.1 藻油凝膠的外觀及微觀結(jié)構(gòu)

油凝膠的臨界凝膠濃度與其凝膠能力相關(guān)[19-22]。圖1A中樣品外觀顯示，將藻油凝膠倒置后，含2%蜂蠟的藻油凝膠在宏觀上不能凝固，含3%蜂蠟的藻油凝膠呈半凝固狀態(tài)，而含4%～8%蜂蠟的藻油凝膠能形成穩(wěn)定的凝膠。進(jìn)一步通過顯微鏡觀察其晶體微觀形貌（圖1B、C），純蜂蠟的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，晶體較為細(xì)膩且分布均勻。從含2%和3%蜂蠟的藻油凝膠中可觀察到晶體呈團(tuán)簇花瓣?duì)罹鶆虻胤稚⒂谀z體系中，晶體形貌、結(jié)構(gòu)清晰可見，直徑約為15 μm，與Ashok等[19]觀察到的蜂蠟?zāi)z簇群結(jié)構(gòu)相似。此外，視野中含3%蜂蠟的藻油凝膠的晶體數(shù)量比2%更多，但是單個(gè)晶體的堆積不能使含3%蜂蠟的藻油凝膠維持穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)。當(dāng)蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)，蜂蠟晶體較多從而發(fā)生聚集并進(jìn)一步互連，形成3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，單個(gè)晶體微粒幾乎不可見，與純蜂蠟的微觀結(jié)構(gòu)相似，表明藻油已完全凝膠化[22]。隨著蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加（6%～8%），晶體網(wǎng)絡(luò)更致密，與Winkler-Moser等[23]的報(bào)道一致。

圖1 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蜂蠟的藻油凝膠及純蜂蠟的倒置外觀圖（A）、明場顯微鏡圖（B）和偏振光顯微鏡圖（C）Fig.1 Visual appearance (A),bright (B) and polarized light microscopic (C) images of algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

2.1.2 藻油凝膠的DSC分析

由圖2可知，純蜂蠟在加熱過程中，于66.5 ℃處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)吸熱峰，即熔融溫度[23-25]；在冷卻過程中，存在兩個(gè)放熱峰（峰1為50.2 ℃，峰2為55.6 ℃），即蜂蠟在峰2時(shí)開始結(jié)晶，在峰1處發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變（β型變?yōu)棣列停23,25-26]。而藻油在20～85 ℃的溫度變化范圍內(nèi)無明顯的結(jié)晶峰和熔融峰。藻油凝膠在加熱過程中，蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的藻油凝膠在45.7 ℃出現(xiàn)吸熱峰，但峰面積較小；隨著蜂蠟含量逐漸增大，藻油凝膠的吸熱峰逐漸后移且峰面積增大，呈現(xiàn)向純蜂蠟樣品靠攏的趨勢；當(dāng)蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至8%時(shí)，吸熱峰為54.1 ℃，輪廓明顯。而在冷卻時(shí)，含2%蜂蠟的藻油凝膠在34.5 ℃處出現(xiàn)結(jié)晶峰（峰2），晶型轉(zhuǎn)變峰（峰1）不明顯；隨著蜂蠟含量逐漸增大，峰1逐漸可觀測到，兩個(gè)放熱峰呈現(xiàn)位置后移、面積增大的趨勢；蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的藻油凝膠中，放熱峰出現(xiàn)在35.2 ℃和46.7 ℃處。上述結(jié)果表明，藻油凝膠的熔融溫度低于60 ℃，結(jié)晶溫度高于30 ℃，可適應(yīng)大多數(shù)食品的加工和貯存條件，符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求[27]。

圖2 蜂蠟、藻油及含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蜂蠟的藻油凝膠的加熱（A）和冷卻（B）曲線Fig.2 Comparative heating (A) and cooling (B) curves of pure beeswax,algae oil and algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

2.1.3 藻油凝膠的流變學(xué)特性

藻油凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與其機(jī)械性質(zhì)密切相關(guān)，通過測定樣品的流變學(xué)特性進(jìn)一步了解藻油凝膠的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。由圖3A可知，在線性黏彈區(qū)內(nèi)，所有樣品的G’均顯著高于G”，說明所有樣品均表現(xiàn)出類彈性固體性質(zhì)[18,28]。隨著蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，藻油凝膠的G’和G”、屈服應(yīng)力值及線性黏彈區(qū)均增大，說明油凝膠具有更強(qiáng)的機(jī)械性能和抵抗外力破壞的能力[16,19,28-29]。如圖3B所示，2%蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藻油凝膠在0.1～50 Hz范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的頻率依賴性，這是因?yàn)榇藭r(shí)樣品的黏彈性較弱，容易受到頻率的擾動(dòng)而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)被破壞；3%～8%蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藻油凝膠表現(xiàn)出較低的頻率依賴性，表明樣品的振蕩性質(zhì)受所施加應(yīng)力的影響較小，顯示出較好的黏彈性[28-29]。

圖3 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蜂蠟的藻油凝膠的應(yīng)力掃描（A）、頻率掃描（B）及黏度曲線（C）Fig.3 G’ and G” versus stress (A),G’ and G” versus frequency (B)and viscosity versus shear rate curves (C) of algal oil-based oleogels with different amounts of beeswax added

藻油凝膠黏度反映樣品的流動(dòng)特性[27-28]。由圖3C可知，所有藻油凝膠均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的剪切變稀行為，且樣品的表觀黏度隨著蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，表明形成了強(qiáng)度更大的凝膠結(jié)構(gòu)[28-29]，與黏彈性測試結(jié)果一致。

2.2 藻油納米乳液的性質(zhì)分析

如表1 所示，油相中不含蜂蠟時(shí)，藻油納米乳液的平均粒徑為178.40 nm，PDI值為0.15，Zeta電位為-29.25 mV，與課題組前期研究結(jié)果[5-6]一致。以蜂蠟結(jié)構(gòu)化的藻油凝膠為油相，得到的藻油納米乳液平均粒徑為184.18～204.03 nm，PDI值均小于0.30，Zeta電位處于-29～-27 mV間，表明蜂蠟的添加對藻油納米乳液（約200 nm）的形成無明顯影響。相較于對照樣品，蜂蠟的添加增大了乳液的平均粒徑；當(dāng)蜂蠟添加量為2%～4%時(shí)，乳液的平均粒徑隨蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大；當(dāng)蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加時(shí)（6%～8%），乳液的平均粒徑變化不顯著，但值得注意的是，蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的樣品PDI值達(dá)到0.27，說明該乳液中存在不均一的聚集體[3]。這可能是由于此時(shí)較高的蜂蠟添加量構(gòu)筑出剛性較強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，乳液自然冷卻過程中，晶體的生長速率過快以及局部不平衡性（一旦膠凝劑在特定位置形成晶核便會(huì)繼續(xù)生長）導(dǎo)致界面被刺破，從而引起乳液液滴局部失穩(wěn)并黏結(jié)[9,15]。藻油包封率結(jié)果顯示，蜂蠟的添加對藻油包封率有輕微改善作用，但改善幅度較小（2.23%～4.22%）。

表1 藻油納米乳液的平均粒徑、PDI值、Zeta電位及藻油包封率Table 1 Mean particle diameter,PDI,zeta-potential and encapsulation efficiency of algal oil-based nanoemulsions

2.3 藻油納米乳液及油粉的貯存穩(wěn)定性

如圖4A所示，藻油納米乳液在25 ℃貯存30 d，所有樣品仍呈現(xiàn)正常的乳白色，質(zhì)地均勻，無明顯的乳析或相分離現(xiàn)象，樣品間無明顯的外觀差異。如圖4B所示，貯存期內(nèi)所有樣品的粒徑變化均小于60 nm，表明乳液均具有良好的長期穩(wěn)定性[7,19]。其中，對照樣品和8%樣品的平均粒徑變化最大（分別增大52 nm和51 nm），表明適量的蜂蠟添加量（2%～6%）利于乳液的長期穩(wěn)定。

如圖4C所示，未油相結(jié)構(gòu)化（0%）和含2%蜂蠟的油粉均呈淡黃色，有輕微的油析現(xiàn)象，這可能是因?yàn)榭焖俚娜軇┱舭l(fā)對界面膜的強(qiáng)擾動(dòng)破壞[30-31]；貯存30 d后，黃色加深，表明油析程度加重。含3%～6%蜂蠟的樣品呈乳白色，無明顯的油析現(xiàn)象；貯存30 d后，顏色、狀態(tài)均無明顯變化，說明藻油凝膠機(jī)械強(qiáng)度的增強(qiáng)賦予了乳液更穩(wěn)定的熱力學(xué)性質(zhì)，即使經(jīng)歷了相對苛刻的凍干過程，其界面結(jié)構(gòu)仍保持相對完整[31-32]。而含8%蜂蠟的樣品呈乳白色，貯存30 d后變?yōu)樯铧S色，出現(xiàn)嚴(yán)重的油析現(xiàn)象，表明該樣品貯存穩(wěn)定性較差，可能是此時(shí)結(jié)構(gòu)化的油相剛性較強(qiáng)，影響了界面層的穩(wěn)定性，與粒徑測定結(jié)果一致。由于藻油被凝膠網(wǎng)絡(luò)捕獲，新鮮狀態(tài)下油脂沒有明顯的溢漏，但隨著時(shí)間的推移，未被完全包封的油脂快速氧化，導(dǎo)致粉末變色、凝結(jié)。這些結(jié)果表明添加3%～6%蜂蠟?zāi)苊黠@增強(qiáng)藻油納米乳液和油粉的物理穩(wěn)定性。

圖4 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藻油納米乳液外觀（A）、平均粒徑（B）及其油粉外觀（C）Fig.4 Appearance (A),mean particle diameter (B) of algae oil-based nanoemulsions containing different amounts of beeswax,and appearance of powders prepared from each of them (C)

2.4 藻油納米乳液的氧化穩(wěn)定性

2.4.1 熱促氧化

油脂氧化為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，初級反應(yīng)產(chǎn)物氫過氧化物可用于評估乳液氧化的起始速率[3,31]。如圖5A所示，熱促氧化過程中，貯存第18天時(shí)，所有藻油納米乳液的脂質(zhì)氫過氧化物含量均達(dá)到峰值，對照組的氫過氧化物含量（44.63 mmol/（L·kg））遠(yuǎn)高于其他樣品。隨著蜂蠟添加量的增大（2%～6%），樣品的氫過氧化物含量逐漸降低至22.23 mmol/（L·kg）；當(dāng)蜂蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，樣品的氫過氧化物含量略微增大（23.41 mmol/（L·kg））。氧化穩(wěn)定性的提升可能是因?yàn)榉湎瀸τ拖嗟墓袒?，抑制促氧化金屬離子以及自由基對多不飽和脂肪酸不飽和鍵的攻擊[2,9]。因此，隨著蜂蠟含量的增加，油相凝膠網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)，物理屏蔽作用的提高有效提升乳液的氧化穩(wěn)定性；但是蜂蠟含量過高時(shí)，乳液中存在部分絮凝體影響了乳液的氧化穩(wěn)定性。圖5B為乳液經(jīng)30 d貯存后產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的頂空分析結(jié)果，其中己醛是藻油中主要的次級氧化產(chǎn)物之一[3,31,33]。結(jié)果顯示，對照樣品的己醛峰面積最大，其次為含2%、3%、4%、8%、6%蜂蠟樣品，與初級氧化物的變化趨勢一致。熱促氧化的綜合數(shù)據(jù)表明，藻油中添加6%蜂蠟對乳液的氧化穩(wěn)定性改善效果最顯著。

圖5 藻油納米乳液在熱促氧化下脂質(zhì)氫過氧化物的含量變化（A）和己醛含量分析（B）Fig.5 Changes in lipid hydroperoxides (A) and hexanal (B) contents of algal oil-based nanoemulsions under thermal treatment

2.4.2 光促氧化

如圖6A所示，對照樣品和含2%蜂蠟藻油納米乳液的初始氧化速率較快，在2 h左右氫過氧化物含量已達(dá)到峰值；含3%、4%和8%蜂蠟藻油納米乳液在4 h左右出現(xiàn)峰值；含6%蜂蠟藻油納米乳液的初級氧化速率最慢，在6 h左右出現(xiàn)峰值。由圖6B可知，曝光8 h后，含0%、2%、3%、4%、8%、6%蜂蠟的樣品中的次級氧化物丙二醛含量依次減小，與對照樣品相比氧化值分別降低了17.67%、28.74%、36.13%、37.23%、77.48%，表明油相中添加蜂蠟?zāi)茱@著延緩乳液的光促氧化進(jìn)程[3,31,33]，其中6%蜂蠟添加量效果最佳。光促氧化的研究結(jié)果與熱促氧化相符。

圖6 藻油納米乳液在光促氧化下脂質(zhì)氫過氧化物的含量變化（A）和丙二醛含量分析（B）Fig.6 Changes in lipid hydroperoxides (A) and malondialdehyde (B)contents of algal oil-based nanoemulsion upon light exposure

3 結(jié)論

以蜂蠟為天然油相凝膠劑、SPI-STE復(fù)合體系為天然乳化劑，構(gòu)建出具有高貯存穩(wěn)定性與氧化穩(wěn)定性的藻油納米乳液載體，實(shí)現(xiàn)對藻油的保護(hù)，拓展其在食品加工中的應(yīng)用。結(jié)果表明，蜂蠟添加量達(dá)到4%時(shí)，大量晶體聯(lián)結(jié)成穩(wěn)固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)筑出穩(wěn)定的油凝膠。蜂蠟對藻油的結(jié)構(gòu)化對納米乳液（約200 nm）的形成沒有明顯影響，所有樣品的平均粒徑、Zeta電位及藻油包封率相近。乳液穩(wěn)定性結(jié)果表明，蜂蠟的固化作用使乳液具有更好的貯存穩(wěn)定性，但是凝膠強(qiáng)度過大（8%蜂蠟添加量）會(huì)影響界面穩(wěn)定性，導(dǎo)致乳液物理穩(wěn)定性變差。乳液的熱促氧化和光促氧化研究表明，油相中添加蜂蠟的樣品均表現(xiàn)出明顯提升的氧化穩(wěn)定性；其中，蜂蠟添加量為6%時(shí)延緩藻油乳液氧化的效果最明顯。本研究結(jié)果表明，經(jīng)蜂蠟油相結(jié)構(gòu)化的大豆蛋白基納米乳液體系可作為藻油的高穩(wěn)態(tài)載體應(yīng)用于食品工業(yè)。