張 華，張 普，張予涵，劉興麗，張艷艷

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450000）

我國冷凍食品行業(yè)蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)值居食品工業(yè)的首位[1]。雖然冷凍保藏可以很好保持食品的新鮮度，但凍結(jié)過程對面制品品質(zhì)的損傷是公認(rèn)的，其中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是引起面團品質(zhì)劣變的主要原因。凍結(jié)過程中，冰晶生長以及冰晶大小不均會引起面筋蛋白二硫鍵斷裂并與淀粉顆粒發(fā)生分離，導(dǎo)致面筋蛋白流變學(xué)性質(zhì)下降，進而導(dǎo)致面團強度下降[2]；此外，凍結(jié)過程中水分遷移、冰晶的重結(jié)晶以及自由水含量的增加會改變面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)并破壞面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)性能變差，從而使面制品后續(xù)加工性能變差[3]。因此，控制凍結(jié)過程中冰晶生長對面團中面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的損傷是提升冷凍食品加工與貯藏性能及其食用品質(zhì)的關(guān)鍵所在，也是冷凍產(chǎn)品加工業(yè)面臨的重大科學(xué)技術(shù)難題。

面團形成過程是指面粉與水在攪拌混合過程中，面團內(nèi)部的面筋蛋白與水分發(fā)生水合作用和剪切作用并伴隨著能量的輸入，從而形成包含完整面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并具有一定彈性和延展性的面團[4]。大量研究表明，面團形成過程中，面團加水量對面制品結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)及感官品質(zhì)有很大影響[5-6]，但有關(guān)加水量對冷凍面團產(chǎn)品品質(zhì)的影響研究較少[7]。因此，研究冷凍過程中不同水分含量面團面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律對揭示水分含量和水分分布對冷凍面團最終品質(zhì)的影響機制有重要意義。

現(xiàn)有的關(guān)于冷凍對面團中冰晶和蛋白分子結(jié)構(gòu)影響的研究主要采用了冷凍干燥、蛋白質(zhì)分離提取等樣品處理方法[8-9]。由于樣品離開了冷凍環(huán)境或采取了分離提取手段，所以測量的蛋白結(jié)構(gòu)信息不能準(zhǔn)確反映樣品的真實變化[10]。因此，對冷凍樣品采用原位表征并實時監(jiān)測面筋蛋白的結(jié)構(gòu)變化，有助于更加真實、準(zhǔn)確地揭示冷凍對面筋蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響。

本研究采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀和低場核磁共振成像分析儀對凍結(jié)過程中面團面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)、水分分布和核磁共振成像的實時變化進行原位監(jiān)測，從微觀尺度和分子水平揭示面團凍結(jié)過程中面筋蛋白結(jié)構(gòu)和水分分布的變化規(guī)律并研究加水量對其的影響，以闡明面團凍結(jié)過程中品質(zhì)劣變的機理，為控制凍結(jié)過程中面團品質(zhì)劣變提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金苑精制粉（蛋白質(zhì)含量11.1%，脂肪含量2%，含水量11.5%） 河南金苑糧油有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HA-3480AS和面機 克萊美斯機電科技（深圳）有限公司；DZM-140電動壓片機 浙江省永康市海鷗電器有限公司；inVia激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 英國Renishaw公司；NMI20低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面團的制備

準(zhǔn)確稱取300 g面粉4 份，分別加入面粉質(zhì)量40%、45%、50%及55%的蒸餾水，置于和面機中，60 r/min攪拌10 min使其形成質(zhì)地均勻的面團。使用電動壓片機反復(fù)壓延面團5 次，形成大小為30 cm×7 cm×0.8 cm、加水量分別為40%、45%、50%及55%的面團，醒發(fā)60 min后用于后續(xù)實驗。

1.3.2 面團凍結(jié)過程中拉曼光譜的原位采集

分別取大小為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的面團樣品置于冷凍平臺，將平臺固定于顯微鏡載物臺上。用激光光源進行激光聚焦，使用冷凍平臺控制系統(tǒng)以10 ℃/min的速率進行梯度降溫，分別在25（室溫）、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃（凍結(jié)終點）進行拉曼光譜采集。拉曼光譜采集參數(shù)：激發(fā)波長785 nm；激光功率250 mW，使用100%的能量進行激發(fā)；掃描范圍300～4000 cm-1；數(shù)據(jù)采集時間10 s；分辨率2 cm-1。

1.3.3 低場核磁共振測定冷凍面團水分分布

參考范金磊[11]的方法并略作改動。將25、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃的冷凍面團樣品制成高2 cm、半徑0.25 cm的圓柱體置于核磁管中，采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測定樣品的橫向弛豫時間（T2）。采集參數(shù)：回波個數(shù)1200；采樣點數(shù)166446；重復(fù)掃描16 次；半回波時間0.208 ms。

1.3.4 冷凍面團核磁共振成像分析

選用MSE（Multi Spin-Echo-Sequence）脈沖對冷凍面團進行2D質(zhì)子密度成像掃描。將25、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃的冷凍面團樣品制成高2 cm、半徑0.25 cm的圓柱體置于核磁管中，放置于磁場射頻線圈的中心，進行核磁共振成像成像，參數(shù)為：選層層厚4 mm；層間隙3 mm；重復(fù)時間300 ms；回波時間20 ms；采集次數(shù)20。使用Osiris軟件處理圖像，并以標(biāo)準(zhǔn)BMP格式保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 面團凍結(jié)過程中面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的原位分析

拉曼光譜在識別分子結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)的定性與定量分析方面具有很強的技術(shù)優(yōu)勢[12]。如圖1a所示，拉曼光譜中，500～550 cm-1處屬于二硫鍵（S—S），在此特征譜帶區(qū)間二硫鍵主要存在3 種構(gòu)型：gauche-gauche-gauche（g-g-g）構(gòu)型、gauchegauche-trans（g-g-t）構(gòu)型和trans-gauche-trans（t-g-t）構(gòu)型[13]，3 種構(gòu)型峰面積的變化可以表征二硫鍵的變化，其特征頻率分別出現(xiàn)在500～510、515～525 cm-1和535～545 cm-1。拉曼光譜也可以檢測氨基酸側(cè)鏈的微環(huán)境，如圖1b所示，酪氨酸雙鏈的峰強度比值（830 cm-1和850 cm-1處，I850/830）被稱為費米共振，可以提供酚羥基氫鍵的信息[14]。1004 cm-1處的苯丙氨酸因吸收穩(wěn)定可以作為歸一化因子，740 cm-1處色氨酸殘基吸收峰強度與1004 cm-1處吸收峰強度比值（I740/1004）的變化可以用來表征色氨酸殘基微環(huán)境的變化[15]。如圖1c所示，1600～1700 cm-1區(qū)間為酰胺I帶的特征峰，酰胺I帶特征峰面積的變化可以用來表征蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。使用Peakfit 4.12軟件對拉曼圖譜進行去高斯卷積，然后進行二階導(dǎo)數(shù)處理，最后進行峰的歸屬。其中，α-螺旋在1645～1660 cm-1子峰，無規(guī)卷曲在1660～1670 cm-1子峰，β-折疊在1670～1680 cm-1子峰，β-轉(zhuǎn)角在1680～1690 cm-1子峰[16]。

圖1 面團拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectrum of dough

2.2 面團凍結(jié)過程中面筋蛋白二硫鍵構(gòu)型的原位分析

隨著吸收頻率的升高，二硫鍵結(jié)構(gòu)逐漸不穩(wěn)定，g-g-g構(gòu)型是穩(wěn)定的二硫鍵構(gòu)型，g-g-t和t-g-t構(gòu)型是較不穩(wěn)定的二硫鍵構(gòu)型[17]。

由圖2a可知，凍結(jié)終點時，隨著加水量的增加，冷凍面團面筋蛋白二硫鍵g-g-g構(gòu)型的相對含量呈先上升后下降趨勢，并在加水量45%時達(dá)到了最高，為46.97%，這代表面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在加水量45%時最為穩(wěn)定。凍結(jié)過程中由于冰晶生長破壞了面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進而使維持面筋蛋白三級結(jié)構(gòu)的二硫鍵被破壞，面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的持水力隨即下降，會形成更多更大的冰晶從而加劇對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞；而過高的加水量使冰晶對面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞更加劇烈，加劇了這種現(xiàn)象[18]。由圖2b可知，45%加水量的面團凍結(jié)過程中，二硫鍵g-g-g構(gòu)型的相對含量在25～-15 ℃溫度區(qū)間無顯著變化，在-15～-18 ℃溫度區(qū)間顯著降低了4.33%。隨著溫度的下降，二硫鍵g-g-g構(gòu)型向g-g-t和t-g-t不穩(wěn)定構(gòu)型轉(zhuǎn)變，二硫鍵的穩(wěn)定性發(fā)生下降，影響了面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使面團品質(zhì)下降。這可能是因為凍結(jié)過程中，自由水轉(zhuǎn)化為冰晶，冰晶的生長破壞了面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使分子間作用力下降，給面團的品質(zhì)造成了不可逆的影響[19]。

圖2 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團面筋蛋白二硫鍵構(gòu)型的影響Fig.2 Effects of water addition (a) and temperatures (b) on disulfide bond configuration of gluten in frozen dough

2.3 面團凍結(jié)過程中面筋蛋白氨基酸側(cè)鏈的原位分析

如表1所示，I740/1004在加水量達(dá)到45%之后趨于穩(wěn)定，說明凍結(jié)終點時色氨酸殘基的微環(huán)境達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，不會隨著加水量的增加而變化。這可能是因為凍結(jié)終點時，大量的水由液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)，形成的冰晶破壞了維持面筋蛋白三級結(jié)構(gòu)的作用力，改變了面筋蛋白三級結(jié)構(gòu)，所以加水量的增加不會影響凍結(jié)終點時氨基酸側(cè)鏈的微環(huán)境。

表1 加水量對凍結(jié)終點時冷凍面團面筋蛋白氨基酸側(cè)鏈的影響Table 1 Effect of water addition on amino acid side chains of gluten proteins in frozen dough at the end of freeze

由圖3可知，加水量45%的面團凍結(jié)過程中，隨著溫度的下降，面筋蛋白氨基酸側(cè)鏈的I740/1004值緩慢下降，表明埋藏的色氨酸在凍結(jié)過程中逐漸“暴露”，疏水基團不斷外露[20]。這是因為凍結(jié)過程中冰晶逐漸長大，破壞了蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增大了對氫鍵的破壞，面筋蛋白三級結(jié)構(gòu)隨之改變，這會使面筋蛋白的表面疏水性增大、持水性降低，從而影響面團的品質(zhì)。此外，由圖1b可知，冷凍面團I850/830值遠(yuǎn)大于普通面團中的正常值（0～1.45），推測可能是被870 cm-1處的強吸收峰掩蓋，導(dǎo)致結(jié)果異常[21]。

圖3 溫度對45%加水量冷凍面團面筋蛋白氨基酸側(cè)鏈的影響Fig.3 Effect of temperature on amino acid side chains of gluten proteins in frozen dough with 45% water added

2.4 面團凍結(jié)過程中面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的原位分析

如圖4所示，在凍結(jié)終點，不同加水量冷凍面團的α-螺旋相對含量無明顯差異。45%加水量面團凍結(jié)過程中，面筋蛋白α-螺旋相對含量逐漸下降，β-折疊相對含量無顯著變化（除-9 ℃），β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量整體呈波動上升趨勢。

圖4 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of water addition (a) and temperature (b) on the secondary structure of gluten in frozen dough

α-螺旋是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中較為穩(wěn)定有序的結(jié)構(gòu)，其含量越多，說明蛋白越穩(wěn)定[22]。本實驗凍結(jié)過程中α-螺旋相對含量隨著溫度下降逐漸下降了3.63%，說明冷凍會使面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)變得無序。這是因為隨著溫度的下降，冰晶逐漸生長，破壞了面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使氫鍵的相互作用逐漸下降。由此可知，α-螺旋逐漸轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲等穩(wěn)定性較低的結(jié)構(gòu)，面筋蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)舒展，這會使蛋白中的疏水基團暴露，從而導(dǎo)致面筋蛋白的表面疏水性增大、持水性降低[23]。

2.5 面團凍結(jié)過程中水分分布的變化

共振圖譜（圖5）中出現(xiàn)了3 個峰并記為T21、T22和T23，當(dāng)0.18 ms＜T2＜4.00 ms時，這部分水為與面筋蛋白中氨基、羧基、羥基等以氫鍵作用結(jié)合的水，流動性差，被稱為強結(jié)合水；當(dāng)4.00 ms＜T2＜37.00 ms時，這部分水的流動性較結(jié)合水更弱但比自由水強，被稱為弱結(jié)合水；當(dāng)T2＞37.00 ms時，這部分水為自由水[24]。此外，出峰面積代表了不同流動性水分的含量[25]。

由圖5a可知，冷凍終點時，不同加水量冷凍面團之間水分狀態(tài)無明顯差別，這可能是因為凍結(jié)過程中，淀粉被破壞，淀粉的吸水率增加，減弱了加水量對于冷凍面團水分分布的影響[26]。由圖6可知，面團中強結(jié)合水相對含量隨溫度的下降發(fā)生劇烈下降并在-6 ℃時未能檢出，弱結(jié)合水相對含量隨著溫度的下降出現(xiàn)先急劇升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢，自由水相對含量也在凍結(jié)過程中整體有所升高。此過程中，強結(jié)合水相對含量逐漸下降，表示凍結(jié)過程中面團的持水性逐漸減弱。推測凍結(jié)過程中，隨著冰晶的生長，非極性基團周圍的水分聚集，破壞了面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面團的品質(zhì)發(fā)生劣變[27]。

圖5 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團水分分布的影響Fig.5 Effects of water addition (a) and temperature (b) on water distribution in frozen dough

圖6 面團凍結(jié)過程中強結(jié)合水（a）、弱結(jié)合水（b）和自由水（c）的相對含量變化Fig.6 Changes in relative contents of strongly bound water (a),weakly bound water (b) and free water (c) during dough freezing

2.6 面團凍結(jié)過程中核磁共振成像的變化

核磁共振成像技術(shù)能夠直觀地表現(xiàn)出面團在凍結(jié)過程中水分分布的變化及遷移[28]。不同加水量的面團在凍結(jié)過程中的偽彩圖如圖7所示，紅色部分越多（即氫質(zhì)子信號越強）表示此部分水分含量較高，反之，藍(lán)色部分越多表示水分含量較少[29]。

圖7 面團凍結(jié)過程中加水量40%（a）、45%（b）、50%（c）、55%（d）的核磁共振成像分析Fig.7 Nuclear magnetic resonance imaging analysis of doughs with different water contents during freezing

由圖7可知，凍結(jié)過程中，水分逐漸向面團表面遷移，隨著加水量的增加，這種現(xiàn)象越明顯。加水量40%的面團在-15 ℃時出現(xiàn)明顯遷移，而加水量55%的面團在-6 ℃出現(xiàn)此現(xiàn)象。水分發(fā)生明顯遷移前，凍結(jié)過程中面團核磁共振成像出現(xiàn)部分區(qū)域氫質(zhì)子信號明顯升高的現(xiàn)象：加水量40%的面團在-9 ℃時出現(xiàn)、加水量45%的面團、加水量50%及55%加水量面團在-3 ℃時出現(xiàn)。推測此時為強結(jié)合水轉(zhuǎn)化為弱結(jié)合水和自由水階段，此過程促進了冰晶的生長，冰晶生長過程中產(chǎn)生的熱量使水分向外遷移，從而出現(xiàn)氫質(zhì)子信號在面團中由內(nèi)向外逐漸增強的現(xiàn)象[30]。

3 結(jié)論

采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀和低場核磁共振成像儀對凍結(jié)過程中面團面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)、水分分布和核磁共振成像的實時變化進行原位監(jiān)測，從微觀尺度和分子水平揭示面團凍結(jié)過程中面筋蛋白結(jié)構(gòu)和水分分布的變化規(guī)律并研究加水量對其的影響。結(jié)果表明：面團加水量45%時，面團體系最為穩(wěn)定，此時面筋蛋白二硫鍵中g(shù)-g-g構(gòu)型相對含量最高，且I740/1004達(dá)到最大值0.13，氨基酸側(cè)鏈微環(huán)境最為穩(wěn)定，而不同加水量之間二級結(jié)構(gòu)無明顯差異。隨著溫度的下降，面團體系穩(wěn)定性降低，品質(zhì)持續(xù)劣變，具體表現(xiàn)為二硫鍵構(gòu)型中較穩(wěn)定的g-g-g構(gòu)型逐漸轉(zhuǎn)化為較不穩(wěn)定的g-g-t和t-g-t構(gòu)型，I740/1004從0 ℃開始持續(xù)下降，氨基酸側(cè)鏈逐漸“暴露”于極性環(huán)境中，二級結(jié)構(gòu)中較有序的α-螺旋也逐漸向無規(guī)卷曲等較無序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。水分分布的結(jié)果也印證了這一結(jié)論，凍結(jié)過程進行的同時，強結(jié)合水相對含量持續(xù)下降，冰晶的生長迫使水分逐漸向面團表面遷移。冷凍面團品質(zhì)劣變主要由冰晶生長導(dǎo)致的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞而引起，因此控制面團中加水量及水分分布是改善面團品質(zhì)劣變的重要舉措。