張環(huán)宇 朱連勤 陳 甫 王倩文 朱風華 馬向東 李艷召

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109；3.青島蔚藍生物集團有限公司，青島 266102；4.熱景(廊坊)生物科技有限公司，廊坊 065000)

鏈格孢菌廣泛分布和存在于各種環(huán)境中，是污染食物和飼料的真菌之一，鏈格孢霉毒素由鏈格孢菌產(chǎn)生，是一類有毒的真菌次生代謝產(chǎn)物[1-2]。目前已經(jīng)分離出數(shù)十種鏈格孢霉毒素，其中有4類鏈格孢霉毒素——交鏈孢酚(alternariol，AOH)、交鏈胞酚單甲醚(alternariol monomethyl ether，AME)、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)及騰毒素(tentoxin，TEN)，由于毒性較強，污染廣泛，具有基因毒性等多種原因而被深入研究。AOH和AME具有基因毒性，可以導致DNA的損傷，AOH具有胚胎毒性，能影響胚胎的發(fā)育[3-5]。TeA對家禽的生長有抑制作用，對雞胚具有致死性[6-7]。在我國，小麥、小麥粉等都有鏈格孢霉毒素檢出的報道[8-10]，但玉米中鏈格孢霉毒素檢出的報道較少。山東省作為畜牧大省，玉米是主要的飼料原料之一，在畜禽養(yǎng)殖的日常中有重要的地位。鏈格孢霉毒素未經(jīng)降解和處理，對家禽具有潛在的風險，鏈格孢霉毒素通過食物鏈的積累甚至可能對人類有潛在的危害。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)法常被應用于分析水果和谷物基質(zhì)中AOH、AME、TeA和TEN的污染情況[11-12]。QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)是一種最早被應用于水果與蔬菜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留回收的前處理方法，之后該方法很快應用在多種基質(zhì)中，用于提取不同物質(zhì)[13]。與傳統(tǒng)的固相萃取(SPE)法相比較，QuEChERS法有著簡單、快速、低價和高效等多種優(yōu)點，因此被廣泛的應用。國內(nèi)配合飼料及其原料中缺乏鏈格孢霉毒素的檢測方法、毒素污染的背景值及鏈格孢霉毒素對畜禽健康影響的相關研究。因此，本試驗旨在建立一種對玉米中4種鏈格孢霉毒素AOH、AME、TeA和TEN同時檢測的QuEChERS-UHPLC-MS/MS法，使用檢出限(LOD)和定量限(LOQ)試驗、準確度和精密度試驗及基質(zhì)效應(matrix effects，ME)試驗驗證該方法，并檢測山東省30份飼用玉米中4種鏈格孢霉毒素污染的背景值，以期為我國飼料鏈格孢霉毒素的風險評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：AR224CN電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司)、1290/6460三重4級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent公司)、N-EVAP 11203030138型氮吹儀(Organomation公司)、SPH-211β型控溫搖床(上海世平試驗設備有限公司)、3K15型高速離心機(Sigma公司)、渦旋儀(北京大龍公司)、超純水儀(MilliQ公司)。

主要試劑：TEN(純度值>99%，CAS編號28540-82-1，生產(chǎn)批號20210403)、AOH(純度值>99%，CAS編號641-38-3，生產(chǎn)批號20210403)、AME(純度值>99%，CAS編號26894-49-5，生產(chǎn)批號20210205)、TeA(純度值>99%，CAS編號610-88-8，批號20210709)，青島普瑞邦生物工程有限公司；甲酸(色譜純，生產(chǎn)批號20210710)和乙腈(色譜純，生產(chǎn)批號20210806)，天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉(分析純，生產(chǎn)批號20210909)，國藥集團；津隆?0.22 μm有機相濾膜，天津市科億隆實驗設備有限公司。

1.2 樣品采集

按照《飼料采樣》(GB/T 14699.1—2005)中方法，2021年5月至2022年5月期間收集山東省不同地區(qū)飼料廠和養(yǎng)殖場的飼用玉米樣品30份。首先將玉米充分粉碎，然后過40目篩，自封袋密封，-20 ℃凍存。

1.3 樣品前處理

稱取約5 g(精確至1 mg)充分粉碎的飼用玉米樣品，置于50 mL聚丙烯無菌離心管中，添加10 mL超純水后搖勻，添加10 mL 0.1%甲酸-乙腈混合溶液，水平搖床300 r/min提取1 h，添加1 g氯化鈉，渦旋3 min，8 000 r/min離心10 min，提出上清液，過有機相濾膜，待測。

1.4 標準溶液的準備

標準儲備液：分別準確稱取AOH、AME、TeA、TEN 1.000 mg，用乙腈配成20 mg/L單標貯備液，-20 ℃保存。使用時，各吸取2 mL儲備液，混合配成4種鏈格孢霉毒素濃度均為5 mg/L的混標溶液。

標準工作液：將4種鏈格孢霉毒素濃度均為5 mg/L的混標溶液用2%甲酸-乙腈溶液配制成濃度分別為1、5、10、50、100 μg/L的標準工作液。

基質(zhì)標準溶液：飼用玉米樣品經(jīng)1.3步驟前處理后，提取液使用氮吹儀吹干，用標準工作液重新溶解，獲得1、5、10、50、100 μg/L基質(zhì)標準溶液。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

試驗色譜柱選用安捷倫EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；設置試驗柱溫為30 ℃；設置進樣體積為20 μL；設置流速為0.2 mL/min；流動相A與B分別選用乙腈與超純水；設置梯度洗脫程序，時間與流動相0～0.5 min 90% A，0.5～3 min 60% A，3～5 min 5% A，5～7 min 90% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；電壓(IS)：35 00 V；將監(jiān)測模式設置為多反應監(jiān)測模式檢測(MRM)，TeA、AOH、AME和TEN的電離模式均采用ESI-，母離子/子離子對設為單位分辨，4種鏈格孢霉毒素的保留時間均為2 min，高純氮氣為碰撞氣。TeA、AOH、AME和TEN的質(zhì)譜測定參數(shù)見表1。

表1 TeA、AOH、AME和TEN的質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of TeA,AOH,AME and TEN

1.6 UHPLC-MS/MS檢測AOH、AME、TeA和TEN的標準曲線

用UHPLC-MS/MS檢測AOH、AME、TeA、TEN不同濃度梯度標準溶液，讀取峰面積值，以4種鏈格孢霉毒素的濃度(X，μg/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得出4種鏈格孢霉毒素的回歸方程，確定線性范圍和相關系數(shù)(R2)。

1.7 基質(zhì)效應

在鏈格孢霉毒素檢測的過程中，由于檢測的基質(zhì)不同，導致在實際檢測的過程中，4種鏈格孢霉毒素的實際測量值會出現(xiàn)偏大和偏小2種不同的情況，這2種變化異常的情況都是由基質(zhì)效應造成的。當實際的測量值偏大時，定義為基質(zhì)增強效應，當實際的測量值偏小時，定義為基質(zhì)抑制效應。基質(zhì)效應定義為基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率：當基質(zhì)效應值<0.8時，基質(zhì)抑制效應對試驗過程造成影響，實際的測量值偏小；當基質(zhì)效應值>1.2時，基質(zhì)增強效應對試驗過程會造成影響，實際的測量值偏大；當0.8<基質(zhì)效應值<1.2時，試驗中基質(zhì)效應形成的影響不大，可以省略不計[14]。當存在基質(zhì)增強和抑制效應影響時，測量值會出現(xiàn)偏大和偏小的情況，此時應對基質(zhì)效應值進行判斷，如果基質(zhì)效應對試驗造成了影響，則應使用基質(zhì)標準曲線作為回歸方程，對測量值進行校準，通過校準后的曲線計算來消除基質(zhì)效應的影響，使得實際測量結(jié)果準確。

1.8 檢出限與定量限

檢出限和定量限的計算公式如下：

LOD=3N/K；LOQ=10N/K。

式中：LOD為檢出限；LOQ為定量限；N為儀器噪聲水平；K為標準曲線的斜率。

1.9 準確度試驗

準確稱量5 g粉碎后的飼用玉米樣品15個，隨機分成3組，每組5個樣品。分別加入含4種鏈格孢霉毒素的混標溶液，制備出5、10和50 μg/kg 3種濃度的玉米添加樣品。樣品經(jīng)1.3步驟前處理后上機檢測樣品中AOH、AME、TeA、TEN含量，以空白樣為對照。最后通過公式推算出4種鏈格孢霉毒素的準確度(加標回收率)。

P(%)=[(X1-X0)/m]×100。

式中：P為準確度；m為加入4種鏈格孢霉毒素的標準物質(zhì)的量；X1為加標后飼用玉米試樣中的測量值；X0為未加標試樣的測量值。

1.10 精密度試驗

準確稱取粉碎后的空白樣飼用玉米5 g，加入含4種鏈格孢霉毒素的混標溶液至樣品終濃度為10 μg/kg，制備10個平行樣。樣品經(jīng)1.3步驟前處理后上機檢測樣品中AOH、AME、TeA、TEN含量，計算精密度[相對標準偏差(RSD)]。

1.11 山東省30份飼用玉米樣品中AOH、AME、TeA和TEN的UHPLC-MS/MS檢測

完成上述1.5～1.10步驟后，建立玉米中4種鏈格孢霉毒素的QuEChERS-UHPLC-MS/MS檢測方法。對1.2中采集的30份飼用玉米樣品，使用1.3中的前處理方法處理，試驗中每個飼用玉米樣品設置3個平行樣，然后上機檢測，得到飼用玉米中AOH、AME、TeA和TEN的檢出率、含量范圍、平均值和中位數(shù)。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS-UHPLC-MS/MS法檢測AOH、AME、TeA、TEN的檢出限、定量限及玉米基質(zhì)效應

由表2可知，4種鏈格孢霉毒素的基質(zhì)效應值<0.8，4種鏈格孢霉毒素在玉米基質(zhì)中均存在基質(zhì)抑制作用。通過對基質(zhì)效應值進行判斷，本試驗需要使用基質(zhì)標準曲線作為回歸方程進行校準，以抵消基質(zhì)抑制作用帶來的影響。以混標溶液的基質(zhì)標準曲線濃度為橫坐標(X，μg/L)，以相應的峰面積為縱坐標(Y)作圖，AOH、AME、TeA和TEN回歸方程的相關系數(shù)全部高于0.995 8，線性關系良好。試驗得到的AOH、AME、TeA和TEN的檢出限分別為0.73、0.57、0.92和0.25 μg/L，定量限分別為2.45、1.90、3.06和0.83 μg/L。

表2 AOH、AME、TeA和TEN的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、基質(zhì)效應、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,matrix effects,LOD and LOQ for AOH,AME,TeA and TEN

2.2 準確度和精密度

由表3可知，在5、10和50 μg/kg 3種加標情況下，TeA、AOH、AME和TEN的加標回收率分別為74.70%～84.60%、77.94%～103.84%、72.61%～102.14%，71.16%～73.16%，RSD分別為4.08%～8.36%、2.03%～4.07%、1.80%～4.61%、1.99%～2.40%。

表3 TeA、AOH、AME和TEN毒素的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and RSD of TeA,AOH,AME and TEN

2.3 山東省30份飼用玉米樣品中AOH、AME、TeA和TEN的背景值

由表4可知，在檢測的山東省30份飼用玉米樣品中，有96.67%(29/30)的玉米樣品至少受到1種鏈格孢霉毒素的污染，4種鏈格孢霉毒素中AOH和AME的檢出率較高，分別為96.67%和93.30%，TEN未檢出，4種鏈格孢霉毒素的含量平均值為AOH>TeA>AME>TEN。

表4 玉米樣品中TeA、AOH、AME和TEN的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of TeA,AOH,AME and TEN in maize samples (n=30)

3 討 論

3.1 飼用玉米基質(zhì)中AOH、AME、TeA和TEN的QuEChERS-UHPLC-MS/MS檢測方法的建立

QuEChERS法可以根據(jù)基質(zhì)的變化而做出相應的調(diào)整，通過調(diào)整無水硫酸鎂的用量和吸附劑的用量，使得QuEChERS法更適合處理玉米。在QuEChERS法進行前處理時，添加一定量的無水硫酸鎂的目的是為了消除前處理步驟中多余的水份。預試驗分別嘗試添加4、3、2和1 g無水硫酸鎂，發(fā)現(xiàn)加入無水硫酸鎂后，飼用玉米容易結(jié)塊。提取液加入無水硫酸鎂后，無水硫酸鎂和水發(fā)生反應的同時會放出大量熱量，飼用玉米樣品受熱后容易發(fā)生結(jié)塊。因此，本試驗在使用QuEChERS法進行前處理時選擇不添加無水硫酸鎂。QuEChERS法前處理所得的提取液在乙腈初步提取后，一般提取液需要使用吸附劑凈化，以達到更好的提取效果。QuEChERS法常用的吸附劑有3類，即N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和十八烷基硅烷(ODS，C18)，應用PSA和GCB可以用于抵消糖類、脂肪酸和色素等物質(zhì)的影響，而C18對非極性物質(zhì)吸附效果較好。玉米中糖類和色素等物質(zhì)含量較少，有報道說PSA和GCB對AOH和AME有很強的吸附作用，因此本試驗不再添加PSA和GCB[14]。本試驗嘗試在每毫升提取液中添加25 mg C18的吸附劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18吸附劑對TeA有明顯的吸附作用，鑒于此，本試驗中不添加任何吸附劑。本試驗中流動相B嘗試設置為0.1%甲酸、0.1%甲酸銨和水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸和甲酸銨的加入都會導致TeA受到抑制，因此本試驗選取超純水為流動相B。

在樣品中，4種鏈格孢霉毒素在不同的基質(zhì)條件下建立的檢測方法中，檢出限和定量限也不同。在不同基質(zhì)中面對相同的鏈格孢霉毒素，基質(zhì)效應造成的影響也不同。程家興等[11]利用UHPLC-MS/MS法測定了紅棗的TEN、AME、AOH和TeA，檢出限的區(qū)間是0.5～12.4 μg/kg，基質(zhì)效應對AOH、AME、TeA和TEN造成的影響較小。王碩等[15]對小麥制品中的4種鏈格孢霉毒素使用UHPLC-MS/MS法進行了檢測，得到的TEN、AME、AOH和TeA檢出限的區(qū)間是0.01～0.1 μg/kg，定量限的區(qū)間是0.02～0.3 μg/kg，AOH、AME、TeA和TEN全部受到了基質(zhì)抑制效應的影響。而在本試驗中，AME、AOH、TeA和TEN檢出限的區(qū)間是0.25～0.92 μg/kg，定量限的區(qū)間是0.83～3.06 μg/kg，AME、AOH、TeA和TEN全部受到了基質(zhì)抑制效應的影響。張子庚等[16]對芒果中的6種鏈格孢霉毒素進行了檢測，檢出限的區(qū)間為0.6～3 μg/kg，6種鏈格孢霉毒素中交鏈孢烯(altenuene，ALT)、TEN、細格菌素(altenusin，ATS)以及帶皮芒果全果AME存在基質(zhì)增強效應，TeA、AOH以及去皮芒果中AME存在基質(zhì)抑制效應。魯玲玲等[17]對紅棗及其制品中鏈格孢霉毒素進行檢測發(fā)現(xiàn)，紅棗酒中TeA為基質(zhì)抑制效應，AOH為基質(zhì)增強效應，紅棗提取物中TEN為基質(zhì)抑制效應。本試驗建立的QuEChERS-UHPLC-MS/MS檢測方法有著較低的檢出限和定量限，AOH、AME、TeA和TEN的檢出限分別為0.73、0.57、0.92、0.25 μg/L，定量限分別為2.45、1.90、3.06和0.83 μg/L?；|(zhì)為玉米情況下，AOH、AME、TeA和TEN全部受到了基質(zhì)抑制效應的影響，測量值偏小，通過對基質(zhì)效應值的計算，判定需要使用基質(zhì)標準曲線進行校準。

由于前處理方法的差異和試驗所選擇的基質(zhì)不同，AOH、AME、TeA和TEN的回收率和精密度也不相同。Xing等[18]選用UHPLC-MS/MS法測定了果泥中的多種鏈格孢霉毒素，其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率為79.5%～106.7%，RSD低于9.78%。吳希等[19]選用UHPLC-MS/MS法測定了麥類中的多種鏈格孢霉毒素，其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率為70.7%～101.3%，RSD低于4.11%。邢家溧等[20]用UHPLC-MS/MS法測定了奶粉中的多種鏈格孢霉毒素，其中AOH、AME、TeA和TEN的回收率為86.4%～114.3%，RSD低于7.13%。而使用本試驗所建立的QuEChERS-UHPLC-MS/MS檢測方法，4種鏈格孢霉毒素的加標回收率為71.16%～103.84%，RSD低于8.36%。因此，與麥類和奶粉等含水較少的基質(zhì)進行對比，本試驗所建立的檢測方法有著較低的RSD和較高的回收率，符合方法建立的相關要求。

3.2 山東省飼用玉米中AOH、AME、TeA和TEN的污染情況

蘇爽等[21]選用UHPLC-MS/MS法，檢測了2018年10月鄭州市超市和農(nóng)貿(mào)市場47份玉米中4種鏈格孢霉毒素的污染情況，其中66.0%(31/47)的樣品至少受1種鏈格孢霉毒素污染，TeA、AOH、TEN和AME的檢出率分別為23.4%、10.6%、4.3%和63.8%。本試驗中，山東省30份飼用玉米中TeA、AOH和AME的檢出率分別為40.00%、96.67%和93.30%，TEN未檢出。與蘇爽等[21]的報道相比較，本試驗中AOH、AME和TeA的檢出率明顯升高。出現(xiàn)這3種鏈格孢霉毒素檢出率升高的原因可能是由于采用時間和采樣地不同，本試驗的采樣地選取了養(yǎng)殖場和飼料廠，飼用玉米貯存過程中容易遭到鏈格孢霉毒素的污染，導致養(yǎng)殖場和飼料廠的飼用玉米品質(zhì)變差。

目前主要使用的飼料原料是玉米和小麥，而在小麥粉中，鏈格孢霉毒素的檢出率也很高。盧素格等[22]檢測了河南省182份小麥粉樣品，其中AOH的檢出率為10.4%(19/182)，AME的檢出率為42.9%(78/182)，TeA的檢出率為91.2%(166/182)，TEN的檢出率為45.6%(83/182)。代永霞等[23]檢測了赤峰地區(qū)120份小麥粉樣品，其中TeA的檢出率達到90%，TEN的檢出率高達100%，AOH和AME的檢出率達到96.7%。與玉米相比，小麥粉中TEN的檢出率明顯升高，這表明在不同的飼料原料中，鏈格孢霉毒素的污染程度不完全相同，比如玉米可能不容易受到TEN的污染，而在小麥中TEN卻很容易檢出。食用油也是鏈格孢霉毒素污染源之一，Bansal等[24]報道了食用油中AOH和AME的污染情況，蘭豐等[25]報道了食用油中存在AME的污染。綜上所述，在飼料原料玉米和小麥中鏈格孢霉毒素存在廣泛的污染情況，食用油中也存在鏈格孢霉毒素污染。因此，根據(jù)飼料原料的污染情況，可以推測家禽和家畜的配合飼料中也會存在鏈格孢霉毒素的污染。遺憾的是，目前家禽和家畜的相關毒理和毒性報道很少，無法對鏈格孢霉毒素的風險進行綜合評估，相關的試驗和工作仍然需要開展，才能消除這種潛在的風險。

4 結(jié) 論

通過檢出限和定量限試驗、準確度和精密度試驗及基質(zhì)效應試驗驗證，本試驗運用QuEChERS-UHPLC-MS/MS法檢測玉米中4種鏈格孢霉毒素AOH、AME、TeA和TEN，具有精密度高、穩(wěn)定性好、易于操作和價格低廉等多種優(yōu)點。通過對山東省30份飼用玉米樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)AOH、AME和TeA這3種鏈格孢霉毒素的檢出率較高，存在潛在風險，應當引起重視。