陳瑜，邱冬妮，孫思佳，卓家隆，廖陽勃，孫旭，毛奇琦，丁偉群，邱志兵，邵雷

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040

高膽固醇血癥屬于一種代謝紊亂性疾病，隨著人們生活水平的改善及飲食習(xí)慣的改變，使得高膽固醇血癥具有較高的發(fā)生率[1]。高膽固醇血癥的發(fā)病周期長，治療較困難，目前尚無特效治療方法。高膽固醇血癥的出現(xiàn)可升高腦卒中、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生率，因此，對(duì)高膽固醇血癥做出診斷并及時(shí)干預(yù)，對(duì)于預(yù)防其并發(fā)癥具有重要意義[2-3]。目前，治療高膽固醇血癥的藥物有很多，治療效果存在差異，有些藥物降低膽固醇的作用顯著，但是其帶來的不良反應(yīng)不容忽視。因此，找尋一種治療效果好、不良反應(yīng)少的降膽固醇藥物是臨床的迫切需求[4]。中藥降脂復(fù)方的降脂效果已被臨床證明，且無明顯不良反應(yīng)[5]。法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是近年發(fā)現(xiàn)的對(duì)脂質(zhì)代謝及糖代謝有調(diào)節(jié)作用的受體，在高膽固醇血癥患者中，F(xiàn)XR呈現(xiàn)過量表達(dá)[6]。在膽汁酸經(jīng)典合成途徑中，膽固醇7α羥化酶(cholesteral 7α-hydroxylase，CYP7A1)是調(diào)節(jié)膽汁酸合成的限速酶[7]。與FXR類似，肝X受體(liver X Receptor，LXR)也是肝細(xì)胞內(nèi)一種核受體，F(xiàn)XR被視為CYP7A1的轉(zhuǎn)錄抑制因子，LXR則為CYP7A1的轉(zhuǎn)錄激活因子。FXR正向調(diào)節(jié)靶基因有膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)與膽汁酸生理性配體小異源二聚體伴侶(short heterodimer partner，SHP)[8]。LXR的正向調(diào)節(jié)靶基因則是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)[9]。上述靶基因mRNA大量表達(dá)可以反映其核受體處于激活狀態(tài)，反之則為非激活狀態(tài)。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR、LXR可通過介導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化的過程[10-11]。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭白兔作為研究對(duì)象，構(gòu)建高膽固醇血癥模型，并對(duì)其進(jìn)行中藥降脂復(fù)方干預(yù)，觀察各組干預(yù)前后CYP7A1的活性以及SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量的改變，以探討中藥降脂復(fù)方對(duì)膽固醇-膽汁酸代謝的干預(yù)作用，為中藥降脂復(fù)方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物選取60只12～16周齡新西蘭白兔，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：20118-0009，所有家兔均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫22～25 ℃，濕度50%～60%，自由攝食及飲水。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批通過，倫理審批號(hào)：(2019)第(77)號(hào)。

1.2 藥物與試劑中藥降脂復(fù)方(規(guī)格：5 g/袋，南京厚生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200113)；總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測(cè)試劑盒(上海名典生物工程有限公司，貨號(hào)：XY-50065)；總膽紅素(total bilirubin，TBIL)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，貨號(hào)：TW15954)；總膽汁酸(total bile acid，TBA)試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：ARB13142、BTN131042)；CYP7A1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海滬震公司，貨號(hào)：hz-M0394c)；Trizol試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：R30506-50T)。

1.3 儀器OlympusAU600型全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯公司)；ELX800型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；ABI PRISM? 7300型定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與干預(yù)方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥降脂復(fù)方低劑量組和中藥降脂復(fù)方高劑量組，每組15只。對(duì)照組動(dòng)物喂食普通兔糧，其余組新西蘭白兔給予高膽固醇兔糧(含2%膽固醇)，每只新西蘭兔每日總食量約為120 g，喂養(yǎng)4周，且中藥降脂復(fù)方低劑量組、中藥降脂復(fù)方高劑量組灌胃給予中藥降脂復(fù)方溶液(低劑量組2.5 g，高劑量組5 g，分別溶于20 mL生理鹽水中)。對(duì)照組、模型組每天每只白兔予以20 mL蒸餾水灌胃，連續(xù)干預(yù)4周。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分別于干預(yù)2周和4周進(jìn)行檢測(cè)。白兔禁食禁水12 h后，采集2 mL兔耳緣靜脈血，常溫下4 000 r·min-1離心5 min后，留取血清待測(cè)。利用OlympusAU600型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè)：用酶水解法測(cè)定血清TC、TBIL的水平；用酶循環(huán)法測(cè)定血清TBA水平。

2.3 肝臟CYP7A1活性檢測(cè)執(zhí)行采血及其他操作后，將動(dòng)物處死，解剖動(dòng)物，將其肝臟取出，并切成小塊于液氮中低溫保存。按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作，配置標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，最終于ELX800酶標(biāo)儀下讀取各孔在450 nm波長處的光密度值(optical density，OD)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算CYP7A1的水平。

2.4 HE染色檢測(cè)肝臟病理變化新西蘭白兔采血操作完畢后，從耳緣靜脈注入烏拉坦進(jìn)行麻醉，取肝臟右葉組織，多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋切片，進(jìn)行病理檢驗(yàn)。

2.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)取300 mg肝臟組織，加入600 μL裂解液，制成勻漿；12 000 r·min-1離心 2 min；取400 μL上清液于EP管中，加入200 μL無水乙醇后轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，12 000 r·min-1離心 1 min，棄去廢液；加入500 μL RW液，12 000 r·min-1離心1 min，棄去廢液；將吸附柱置入EP管中，加入40 μL DEPC，靜置5 min，12 000 r·min-1離心 2 min；按照Trizol試劑盒操作說明提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37 ℃～15 min，85 ℃～5 s為1個(gè)循環(huán)；利用并遵照達(dá)輝生物公司生產(chǎn)的SYBRGreen PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃～1 min，94 ℃～30 s，72 ℃～30 s循環(huán)230次；55 ℃～30 s，72 ℃～10 min，40 ℃～60 min保存。各基因引物序列見表1，PCR反應(yīng)總體系為50 μL，內(nèi)參選擇GAPDH。用ABI公司生產(chǎn)的ABI PRISM? 7300定量PCR儀檢測(cè)結(jié)果。

表1 各基因引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組新西蘭白兔血清TC、TBA、TBIL水平比較干預(yù)前，各組新西蘭白兔血清TC、TBA和TBIL水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)2周及干預(yù)4周后，與對(duì)照組相比，各造模新西蘭白兔血清TC、TBIL水平升高，TBA水平降低；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高；與中藥降脂復(fù)方低劑量組相比，中藥降脂復(fù)方高劑量組新西蘭白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、表3、表4。

表2 各組新西蘭白兔干預(yù)前后血清TC水平比較

表3 各組新西蘭白兔干預(yù)前后血清TBIL水平比較

表4 各組新西蘭白兔干預(yù)前后血清TBA水平比較

3.2 各組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性比較與對(duì)照組相比，各造模組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性降低；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性升高；與中藥降脂復(fù)方低劑量組相比，中藥降脂復(fù)方高劑量組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組新西蘭白兔肝臟CYP7A1活性比較

3.3 各組新西蘭白兔肝臟病理變化比較對(duì)照組新西蘭白兔肝臟組織結(jié)構(gòu)正常；模型組可見肝細(xì)胞腫大，炎細(xì)胞浸潤；給予中藥降脂復(fù)方后，各組新西蘭白兔肝臟病理改變有所改善。見圖1。

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：中藥降脂復(fù)方低劑量組；D：中藥降脂復(fù)方高劑量組

3.4 各組新西蘭白兔肝臟SHPmRNA、BSEPmRNA、ABCA1mRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，各造模組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高；與模型組相比，各給藥組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量降低；與中藥降脂復(fù)方低劑量組相比，中藥降脂復(fù)方高劑量組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組新西蘭白兔肝臟SHP、BSEP和ABCA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

4 討論

高膽固醇飲食是出現(xiàn)進(jìn)展性高膽固醇血癥的主要原因[12-13]。研究表明，膽汁酸合成途徑及膽汁酸腸肝循環(huán)為膽汁酸-膽固醇代謝性疾病的發(fā)生機(jī)制及診斷治療提供了方向[14-15]。腸道是吸收膽汁酸的主要部位，膽汁酸還會(huì)隨糞便排出體外，膽固醇在肝內(nèi)合成膽汁酸能夠彌補(bǔ)機(jī)體內(nèi)丟失的膽汁酸[16-17]。FXR是肝細(xì)胞核內(nèi)的膽汁酸受體，肝臟的膽汁酸可以激活FXR，調(diào)控與膽汁酸-膽固醇代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，如CYP7A1、SHP、BSEP等[18-19]。

本研究建立新西蘭白兔的高膽固醇血癥模型，并給予中藥降脂復(fù)方干預(yù)，探討模型白兔機(jī)體內(nèi)膽固醇-膽汁酸的變化特點(diǎn)。結(jié)果顯示，新西蘭兔接受高膽固醇喂食后，其機(jī)體內(nèi)TC和TBIL水平增高，TBA水平降低，應(yīng)用中藥降脂復(fù)方可使攝入高膽固醇的新西蘭白兔血清TC和TBIL水平下降，TBA水平升高，劑量愈大，作用越好，提示中藥降脂復(fù)方可通過影響膽汁酸在腸道內(nèi)的吸收，使進(jìn)入肝臟的TBA水平降低，致使血清TBA水平升高。中藥降脂復(fù)方可抑制FXR的激活，并激活經(jīng)典肝臟膽汁酸合成途徑，TBA水平增加后，彌補(bǔ)腸道內(nèi)丟失的TBA，維持機(jī)體內(nèi)TBA的穩(wěn)定狀態(tài)，因在膽汁酸的合成過程中消耗掉了膽固醇及TBIL，肝臟從循環(huán)中攝取TC及TBIL的量增加，肝內(nèi)膽固醇儲(chǔ)備減少，因而使機(jī)體內(nèi)TC和TBIL含量下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組、中藥降脂復(fù)方低劑量組和中藥降脂復(fù)方高劑量組肝臟CYP7A1活性顯著低于對(duì)照組；中藥降脂復(fù)方高劑量組肝臟CYP7A1活性顯著較中藥降脂復(fù)方低劑量組和模型組高。給予新西蘭兔高膽固醇喂養(yǎng)后，機(jī)體內(nèi)膽固醇水平增加，激活膽汁酸替代途徑，并使膽汁酸池?cái)U(kuò)大，使CYP7A1的活性減弱。中藥降脂復(fù)方具有益氣健脾、清濁的作用。澤瀉、生蒲黃及山楂等藥材的降血脂作用顯著，這已在很多研究中得以證實(shí)[20-21]，澤瀉中的脂溶性部分含有三萜類化合物，是降血脂的有效成分，澤瀉醇A、B、C的乙酸酯及生蒲黃的黃酮類物質(zhì)能夠顯著降低膽固醇水平，并促使膽固醇從腸道排出體外，從而使機(jī)體內(nèi)膽固醇水平降低，丟失的膽固醇會(huì)向膽汁酸轉(zhuǎn)化，彌補(bǔ)膽汁酸水平，重建膽汁酸腸肝循環(huán)中新的平衡，此時(shí)會(huì)激活肝臟FXR進(jìn)而激活CYP7A1轉(zhuǎn)錄途徑[22-23]。CYP7A1的激活得益于膽固醇降解和膽汁酸合成[24-25]。本研究結(jié)果顯示：模型組可見肝細(xì)胞腫大，炎性細(xì)胞浸潤，而中藥降脂復(fù)方低劑量和中藥降脂復(fù)方高劑量組肝臟病理有所改善，推測(cè)中藥降脂復(fù)方能阻止炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制肝損傷后炎性介質(zhì)的分泌和釋放，從而減輕對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

本研究結(jié)果顯示：模型組、中藥降脂復(fù)方低劑量組和中藥降脂復(fù)方高劑量組肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組；中藥降脂復(fù)方高劑量組肝臟SHP、BSEP和ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于低劑量組、模型組。長期高膽固醇攝入引起新西蘭兔血清TBA水平升高。高膽固醇血癥屬中醫(yī)學(xué)“痰濁”“眩暈”等范疇，中藥降脂復(fù)方有降低血脂作用，SHP和BSEP是FXR正向調(diào)節(jié)靶基因，ABCA1則相反[26-27]。應(yīng)用中藥降脂復(fù)方可抑制FXR的激活狀態(tài)，促進(jìn)膽汁酸經(jīng)典合成途徑，BSEPmRNA、SHPmRNA大量表達(dá)激活了SHP，促使ABCA1基因調(diào)控區(qū)與SHP復(fù)合為活性結(jié)合物，使得ABCA1mRNA表達(dá)水平顯著增加。

綜上所述，中藥降脂復(fù)方能有效調(diào)節(jié)新西蘭白兔膽固醇-膽汁酸代謝，可能與調(diào)控SHP、BSEP及ABCA1有關(guān)。本研究通過構(gòu)建動(dòng)物模型較為全面地探討了膽汁酸-膽固醇代謝疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病的診斷、新靶點(diǎn)的確認(rèn)提供依據(jù)。