文昌麗，曹偉偉，唐雪蓮，趙雯淑，賈仲君①，孟 磊②

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

經(jīng)典的平板培養(yǎng)技術(shù)是微生物研究的里程碑，但由于理論和技術(shù)發(fā)展的滯后，上百年來(lái)其具體操作卻更多處于一種定性描述過(guò)程，缺乏定量評(píng)估，特別是在連續(xù)傳代富集培養(yǎng)并分離特定功能微生物的過(guò)程中，微生物多樣性的演變規(guī)律鮮有報(bào)道。例如，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離細(xì)菌的主要策略，包括將土壤懸液均勻涂在固體培養(yǎng)基上之后觀測(cè)菌落的數(shù)量和形態(tài)特征，挑選平板上邊界清晰的群落連續(xù)傳代富集培養(yǎng)，直至獲得純菌株，進(jìn)而通過(guò)測(cè)定菌落的生理生化指標(biāo)，研究微生物的多樣性組成和生態(tài)功能[1]。然而，這一經(jīng)典的研究方法具有一定的內(nèi)在局限性。首先，據(jù)估算，每克土壤中微生物數(shù)量高達(dá)10億，這些海量微生物具有迥然不同的生理代謝特性，其底物偏好性、生長(zhǎng)速率、平均代時(shí)和環(huán)境適應(yīng)能力各不相同[2]，很難通過(guò)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)獲得所有微生物，導(dǎo)致在傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中遺漏了相當(dāng)一部分，甚至是大多數(shù)微生物。其次，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成影響可培養(yǎng)菌落生長(zhǎng)[3]。最后，傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基富集分離過(guò)程依賴于單個(gè)菌落的挑選和傳代純化。然而，如前所述，這些單個(gè)菌落的篩選具有極大的隨機(jī)性，一些肉眼不可見(jiàn)的菌落極可能被遺漏，很難實(shí)現(xiàn)特定生態(tài)功能菌群的培養(yǎng)分離，如植物促生菌和病原微生物拮抗菌[4]，特別是在數(shù)量上占弱勢(shì)的一部分功能菌群。因此，固體和液體培養(yǎng)基在連續(xù)傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中，因傳代次數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)基組分的影響極可能導(dǎo)致特定類群的偏好性生長(zhǎng)，進(jìn)而遺漏一些在環(huán)境中發(fā)揮重要功能的微生物，因而無(wú)法全面準(zhǔn)確評(píng)估土壤環(huán)境中微生物群落組成全貌。所以，研究固體和液體可培養(yǎng)菌多樣性變化規(guī)律不具有現(xiàn)實(shí)操作性。

在固體和液體培養(yǎng)基富集分離過(guò)程中，微生物的營(yíng)養(yǎng)獲取和氧氣利用具有極大差異，在可培養(yǎng)菌連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中可能產(chǎn)生顯著差異。固體培養(yǎng)基表層的細(xì)胞菌落需要通過(guò)下層細(xì)胞或細(xì)胞間隙獲取營(yíng)養(yǎng)，而液體培養(yǎng)基從上到下逐漸形成缺氧環(huán)境，可能限制細(xì)胞生長(zhǎng)。已有研究表明，一定時(shí)間內(nèi)的微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，固體和液體培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌和稀有菌的比例保持相對(duì)穩(wěn)定，但隨著代際的增加，豐度低的稀有菌被易生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌所淘汰[5]。據(jù)此，一定時(shí)間內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌和稀有菌可能會(huì)共存，但隨著時(shí)間的增加和由于營(yíng)養(yǎng)資源短缺等因素，稀有菌在競(jìng)爭(zhēng)資源方面的能力較弱，可能會(huì)逐漸消失，繼而導(dǎo)致整個(gè)可培養(yǎng)微生物區(qū)系被優(yōu)勢(shì)菌所主導(dǎo)。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，則為系統(tǒng)評(píng)價(jià)連續(xù)傳代過(guò)程中土壤可培養(yǎng)菌群變化規(guī)律提供重要技術(shù)支撐[6]。20世紀(jì)90年代，Carl Woese提出的核糖體16S rRNA 基因分類系統(tǒng)逐漸得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可，從根本上改變了冗繁的傳統(tǒng)微生物生理和形態(tài)分類鑒定策略[7]。比如對(duì)于土壤中所有微生物的基因組DNA，直接測(cè)定其中的16S rRNA 基因序列并將其與已知純菌株的16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育同源性分析，根據(jù)基因序列相似度即可推斷環(huán)境中棲息的微生物系統(tǒng)發(fā)育分類地位。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)呈爆發(fā)式增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，已經(jīng)成為一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，在固體和液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代富集過(guò)程中，通過(guò)收集固體平板或液體培養(yǎng)基中所有菌落并提取DNA，即可利用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)研究不同代際的微生物多樣性，明確傳統(tǒng)培養(yǎng)分離過(guò)程中可能遺漏的微生物類群。

微生物是地球環(huán)境中最大的分解者，也是維系陸地生態(tài)系統(tǒng)地上-地下相互作用的紐帶。水稻是亞洲主要的糧食作物，我國(guó)水稻種植歷史悠久，但高強(qiáng)度氮肥施用引發(fā)土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)失衡[8]，進(jìn)而改變微生物群落功能并導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)退化[9]。研究表明：由低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可能獲得更多數(shù)量和種類的可培養(yǎng)微生物，且可顯著提高土壤環(huán)境中變形桿菌、放線菌和嗜酸性菌的可培養(yǎng)性[10-11]。但是，與本底土壤微生物多樣性相比，連續(xù)傳代富集過(guò)程中，不同營(yíng)養(yǎng)基可能用于選擇特定的微生物類群，特別是有關(guān)第一代富集的微生物菌落，但在傳代過(guò)程中隨機(jī)出現(xiàn)或者是穩(wěn)定連續(xù)生長(zhǎng)方面的報(bào)道，似乎尚鮮見(jiàn)。據(jù)此，選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)水稻土微生物進(jìn)行連續(xù)傳代富集培養(yǎng)，通過(guò)設(shè)置固體/液體培養(yǎng)狀態(tài)，并對(duì)每種培養(yǎng)基設(shè)置常規(guī)營(yíng)養(yǎng)和1/10營(yíng)養(yǎng)處理獲得可培養(yǎng)菌群，然后直接提取土壤DNA和不同傳代過(guò)程的可培養(yǎng)菌群DNA，研究連續(xù)傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中可培養(yǎng)微生物群落的變化規(guī)律，定量評(píng)估可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌和稀有菌占水稻土本底微生物的比例，為優(yōu)化傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)并深入挖掘微生物資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻土

典型水稻土樣品采自海南白沙黎族自治縣革新村附近(19°06′35″ N，109°42′52″ E)。該地區(qū)水稻土發(fā)育于砂頁(yè)巖。土壤理化性質(zhì)：pH為5.44，w(NH4+-N)為17.3 mg·kg-1，w(NO3--N)為7.82 mg·kg-1，w(全氮)為1.46 g·kg-1，w(全碳)為13.2 g·kg-1，土壤碳氮比為9.04。采集0～20 cm土壤后，去除可見(jiàn)根系和碎石，磨碎、過(guò)2 mm孔徑篩后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 培養(yǎng)基配制

常規(guī)蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，用去離子無(wú)菌水定容至1 000 mL容量瓶中，配制1 000 mL溶液得到常規(guī)營(yíng)養(yǎng)液體(以下簡(jiǎn)稱NB)培養(yǎng)基。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)固體(以下簡(jiǎn)稱NA)培養(yǎng)基額外添加15 g·L-1瓊脂，利用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6。將培養(yǎng)基配制完成后用高壓滅菌鍋在121 ℃、20 min條件下高溫滅菌。同時(shí)，設(shè)置減量的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，即常規(guī)蛋白胨量的1/10培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱1/10 NA或1/10 NB)：牛肉膏3 g，蛋白胨1 g，氯化鈉5 g。其他操作同上。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取土壤樣品1 g，懸于90 mL無(wú)菌水中后，以200 r·min-1轉(zhuǎn)速振蕩0.5 h制成土壤懸液作為接種液，吸取100 μL土壤懸液并均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，將平板正置并利用10 mL無(wú)菌水反復(fù)沖洗培養(yǎng)基表面菌群，獲得菌懸液并保存于50 mL無(wú)菌離心管中制成第1代富集菌液；進(jìn)一步吸取100 μL第1代富集液作為接種液，采用相同方法獲得第2代富集菌液；隨后，每1代均以100 μL菌液傳代，共計(jì)獲得10代富集菌液。所有培養(yǎng)操作步驟均為無(wú)菌操作并設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

液體培養(yǎng)：吸取100 μL土壤懸液接種至裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)3 d后搖勻收集得到第一代菌液，將100 mL第1代富集菌液離心(4 000 r·min-1，8 min)后，棄上清，加入10 mL無(wú)菌水，振蕩混勻后濃縮為10 mL富集菌液后取1 mL提取DNA。同時(shí)，吸取100 μL富集菌液接種至新100 mL液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)3 d后，采用相同方法濃縮為10 mL第2代富集菌液，隨后，每1代均以100 μL菌液傳代，共計(jì)獲得10代富集菌液。取1 mL提取DNA并保存于-20 ℃條件下。針對(duì)固體和液體培養(yǎng)基第1、3、5、7、10代富集物，分別取1 mL富集菌液用于提取DNA并保存于-20 ℃條件下。

1.4 水稻土微生物總DNA和可培養(yǎng)菌總DNA提取

土壤DNA提取采用FastDNA Spin Kit for Soil(MP Bio)試劑盒，稱取0.5 g土壤樣品置于2.0 mL離心管中，加入磷酸鈉緩沖溶液(SPB)和MT緩沖液后，利用Fast Prep 核酸提取儀以6.0 m·s-1振蕩45 s，14 000 r·min-1條件下離心15 min后，轉(zhuǎn)移上清液至新的2.0 mL離心管中，采用沉淀蛋白溶液 (PPS)，通過(guò)Binding Matrix 結(jié)合 DNA，利用鹽乙醇(SEWS-M)洗滌過(guò)濾后，將DNA溶解于50 μL DNA洗脫液超純水(DES)緩沖液中。利用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度，水稻土總DNA質(zhì)量濃度為45.6～58.4 ng·μL-1，純度A260/280約為1.54～1.58，A260/230約為1.48～1.94。此外，利用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

可培養(yǎng)微生物總DNA提取，取第1、3、5、7、10代的10 mL富集菌液，采用Omega公司E.Z.N.A.? Bacterial DNA Kit 試劑盒提取DNA。將1.0 mL富集菌液按4 000 r·min-1離心 10 min，吸除上清液，加入100 μL乙二胺四乙酸緩沖液(TE)重懸，利用 Lysozyme、Proteinase K Solution 和 RNase A裂解細(xì)胞，去除蛋白質(zhì)和RNA，用100% DNA Wash Buffer洗滌過(guò)濾后，加入50 μL Elution Buffer，過(guò)濾收集DNA。如前所述，利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度。DNA 質(zhì)量濃度為 73.4～86.9 ng·μL-1，純度A260/280為1.78～1.89，A260/230為1.58～1.96。

1.5 微生物數(shù)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，針對(duì)水稻土微生物總DNA、固體和液體可培養(yǎng)微生物DNA(第1、3、5、7、10代)，定量分析其中16S rRNA基因拷貝數(shù)，研究水稻土本底土著微生物數(shù)量和可培養(yǎng)微生物數(shù)量。采用515F/907R通用引物[12]，PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq(Takara)，正反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，8 μL DNase/RNase-free H2O。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，39個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：計(jì)算含有16S rRNA目標(biāo)基因片段質(zhì)粒的物質(zhì)的量，然后依次稀釋7個(gè)濃度梯度，以初始模板DNA拷貝數(shù)(C)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以Ct值為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgC=-0.293Ct+11.8(R2=0.994)。根據(jù)待測(cè)樣品Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線推測(cè)16S rRNA基因拷貝數(shù)。

1.6 高通量測(cè)序及序列分析

對(duì)于土壤和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA，1/10 NA)、液體培養(yǎng)基(NB，1/10 NB)第1、3、5、7、10代富集菌液DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)共63個(gè)樣品。利用北京諾禾致源科技股份有限公司的Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。采用QIIME (quantitative insights into microbial ecology，version 1.9.1)軟件進(jìn)行序列分析。首先，開(kāi)展高通量原始測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和樣本拆分，并采用usearch軟件去除嵌合體，并以97%的一致性(identity)將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。其中，測(cè)得水稻土本底土著微生物高質(zhì)量16S rRNA序列共計(jì)92 975條，利用固體培養(yǎng)基得到104 301條高質(zhì)量序列，其中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA處理高質(zhì)量序列104 066條，1/10 NA處理104 536條；利用液體培養(yǎng)基得到高質(zhì)量16S rRNA基因序列共計(jì)95 261條，其中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB處理96 347條，1/10 NB處理94 175條。

最后，通過(guò)與Greengenes的16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分別在微生物門(mén)、綱、目、科、屬水平獲得物種分類信息及相對(duì)豐度。OTUs聚類基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用于Alpha多樣性指數(shù)Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)計(jì)算以及主成分PCA聚類分析。

1.7 水稻土可培養(yǎng)微生物的比例及富集率計(jì)算

水稻土可培養(yǎng)微生物比例由固體或液體培養(yǎng)基中富集物物種數(shù)量除以土壤中所有微生物物種數(shù)量得到。水稻土本底所有微生物物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)基于16S rRNA分類，包括微生物門(mén)、綱、目、科、屬水平的物種分類信息?？膳囵B(yǎng)微生物物種數(shù)量是固、液體培養(yǎng)基富集物第1、3、5、7、10代所有菌落富集的物種分類信息。

可培養(yǎng)微生物富集率計(jì)算方法：首先，獲得土壤DNA中所有細(xì)菌屬的相對(duì)豐度；其次，獲得固體和液體培養(yǎng)基富集物菌落DNA中所有細(xì)菌屬的相對(duì)豐度；用后者除以前者，即可計(jì)算得到特定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的富集率。富集率>1表示該菌屬在培養(yǎng)中得到富集。

1.8 數(shù)據(jù)分析與制圖

利用IBM SPSS statistics 23對(duì)水稻土可培養(yǎng)菌數(shù)量在不同代際的基因拷貝數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。采用Origin 2021制作柱狀圖和箱線圖，采用Raphpad prism 8制作火山圖并完成差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻土本底及連續(xù)傳代過(guò)程中可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化規(guī)律

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)狀況和連續(xù)培養(yǎng)代數(shù)均可能對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量產(chǎn)生顯著影響。圖1顯示，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著高于背景土壤中微生物數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，水稻土本底土壤(以干重計(jì))微生物拷貝數(shù)為1.53×1010copies·g-1，而固體和液體連續(xù)培養(yǎng)10代過(guò)程中，可培養(yǎng)菌數(shù)量范圍為1.86×1010～26.70×1010copies·mL-1。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA培養(yǎng)基中微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)是1/10 NA營(yíng)養(yǎng)處理的1.17～1.56倍，而常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB培養(yǎng)基處理則是1/10 NB營(yíng)養(yǎng)處理的1.20～1.58倍(圖1)。

1st、3rd、5th、7th和10th分別指第1、3、5、7和10代富集液；固體牛肉膏蛋白胨簡(jiǎn)稱NA(常規(guī)蛋白胨簡(jiǎn)稱NA,1/10常規(guī)蛋白胨簡(jiǎn)稱1/10 NA)；液體牛肉膏蛋白胨簡(jiǎn)稱NB(常規(guī)蛋白胨簡(jiǎn)稱NB，1/10常規(guī)蛋白胨簡(jiǎn)稱1/10 NB)。(b)和(c)分圖中同一組直方柱上方英文小寫(xiě)字母不同表示代際間基因拷貝數(shù)差異顯著(P<0.05)。所有處理均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

連續(xù)傳代富集過(guò)程中，液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基更容易促進(jìn)微生物生長(zhǎng)。例如，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA培養(yǎng)基中可培養(yǎng)細(xì)菌連續(xù)傳代10次的16S rRNA基因數(shù)量變化范圍為2.90×1010～3.86×1010copies·mL-1〔圖1(b)〕，而常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB液體培養(yǎng)基中約為8.99×1010～26.70×1010copies·mL-1〔圖1(c)〕。將牛肉膏蛋白胨量降低為1/10后，固體和液體培養(yǎng)基中可培養(yǎng)菌數(shù)量差異更加明顯，前者為1.86×1010～3.30×1010copies·mL-1，后者顯著增加為7.50×1010～16.90×1010copies·mL-1。值得注意的是，在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB營(yíng)養(yǎng)基傳代富集過(guò)程中，第7和10代細(xì)菌數(shù)量較高，分別為2.67×1011和2.31×1011copies·mL-1，均顯著高于第1、3、5代。但1/10 NB培養(yǎng)下則未觀測(cè)到類似現(xiàn)象。

2.2 水稻土本底及連續(xù)傳代過(guò)程中可培養(yǎng)微生物多樣性變化規(guī)律

水稻土細(xì)菌群落的Alpha多樣性采用Chao指數(shù)和Simpson指數(shù)表征?；谖锓NOTUs水平的分析結(jié)果表明，水稻土背景土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)顯著高于固體和液體可培養(yǎng)菌；傳代培養(yǎng)10次過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)條件下固體和液體可培養(yǎng)菌多樣性指數(shù)均表現(xiàn)出一致性的規(guī)律，即呈先增加后減少；然而，低營(yíng)養(yǎng)條件下可培養(yǎng)菌多樣性指數(shù)則表現(xiàn)出不一致的規(guī)律，1/10 NA培養(yǎng)基表現(xiàn)出逐漸增加趨勢(shì)并在第10代多樣性指數(shù)最高，但1/10 NB可培養(yǎng)菌多樣性整體規(guī)律則呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。

水稻土背景土壤Chao指數(shù)為4 806，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA和低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA處理可培養(yǎng)菌Chao指數(shù)平均值分別為62.1和90.9，后者是前者的 1.5倍〔圖2(a)〕。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA可培養(yǎng)菌第1代Chao指數(shù)為49.7，最低值為49.7，最高值為77.3，平均值為62.1；低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA 可培養(yǎng)菌第1代Chao指數(shù)為75.1，最低值為75.1，最高值為117.7，平均值為90.9。類似地，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB和低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB連續(xù)傳代10次過(guò)程中，可培養(yǎng)菌Chao指數(shù)平均值分別為767.0和774.0，后者是前者的 1.0倍〔圖2(b)〕。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB可培養(yǎng)菌第1代Chao指數(shù)為142.0，最低值為136.7，最高值為1 502.7，平均值為767.0；低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB可培養(yǎng)菌第1代Chao指數(shù)為531.0，最低值為468.9，最高值為1 279.6，平均值為774.0。

(a)水稻土本底土著微生物及氮素脅迫下固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10代過(guò)程中可培養(yǎng)菌Chao指數(shù)；(b)氮素脅迫下液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10代過(guò)程中可培養(yǎng)菌Chao指數(shù)；(c)水稻土本底土著微生物及氮素脅迫下固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10代過(guò)程中可培養(yǎng)菌Simpson指數(shù)；(d)氮素脅迫下液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10代過(guò)程中可培養(yǎng)菌Simpson指數(shù)；(e)水稻土本底土著微生物和固液培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌的PCA主成分聚類分析；(f)不同氮素水平下固液培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌的PCA主成分聚類分析。NA、1/10 NA、NB和1/10 NB含義見(jiàn)圖1。(a)～(d)分圖中同一組直方柱上方英文小寫(xiě)字母不同表示代際間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。所有處理均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采用Simpson指數(shù)表征細(xì)菌多樣性也得到類似規(guī)律。水稻土背景土壤Simpson指數(shù)為1，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA和低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA可培養(yǎng)菌Simpson指數(shù)平均值分別為0.07和0.21，后者是前者的3倍〔圖2(c)〕。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA可培養(yǎng)菌第1代Simpson指數(shù)為0.06，最低值為0.05，最高值為0.08，平均值為0.07。低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA可培養(yǎng)菌第1代Simpson指數(shù)為0.14，最低值為0.11，最高值為0.52，平均值為0.21。類似地，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB和低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB連續(xù)傳代10次過(guò)程中，可培養(yǎng)菌Simpson指數(shù)平均值分別為0.69和0.45，前者是后者的1.5倍〔(圖2(d)〕。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB可培養(yǎng)菌第1代Simpson指數(shù)為0.66，最低值為0.66，最高值為0.71，平均值為0.69。低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB可培養(yǎng)菌第1代Simpson指數(shù)為0.79，最低值為0.30，最高值為0.79，平均值為0.45。

采用PCA主成分聚類分析，在OTUs水平上研究連續(xù)傳代過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。與水稻土本底土著微生物相比，連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯分異，表明固體和液體培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌發(fā)生特異性分異〔圖2(e)〕。此外，針對(duì)所有可培養(yǎng)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)固體和液體培養(yǎng)是微生物群落結(jié)構(gòu)分異的主要控制因子，同時(shí)，1/10營(yíng)養(yǎng)狀況下不同培養(yǎng)代數(shù)微生物群落也發(fā)生明顯分異〔圖2( f )〕。

2.3 水稻土本底及連續(xù)傳代過(guò)程中可培養(yǎng)微生物物種共現(xiàn)規(guī)律

針對(duì)背景水稻土、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，開(kāi)展共有和特有物種共現(xiàn)規(guī)律的維恩圖分析〔圖3(a)〕。在微生物門(mén)水平上，采用高通量測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到水稻土本底土著微生物54門(mén)，連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中共計(jì)獲得可培養(yǎng)菌48門(mén)，連續(xù)10次傳代富集的可培養(yǎng)菌門(mén)占所有微生物門(mén)的比例為88.9%。所有可培養(yǎng)48門(mén)中，固體和液體培養(yǎng)基分別獲得可培養(yǎng)菌9門(mén)和47門(mén)，可培養(yǎng)菌門(mén)比例分別為16.7%和87.0%〔圖3(a)〕。其中，固體培養(yǎng)基獨(dú)有門(mén)1個(gè),液體培養(yǎng)基獨(dú)有門(mén)39個(gè)，兩者共有門(mén)8個(gè)。固體培養(yǎng)基的9個(gè)微生物門(mén)包括常規(guī)營(yíng)養(yǎng)獨(dú)有門(mén)3個(gè)，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA獨(dú)有門(mén)2個(gè)，兩者共有門(mén)4個(gè)〔圖3(b)〕。液體培養(yǎng)基的47個(gè)微生物門(mén)包括常規(guī)營(yíng)養(yǎng)獨(dú)有門(mén)3個(gè)，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB獨(dú)有門(mén)3個(gè)，兩者共有門(mén)41個(gè)〔圖3(b)〕。

進(jìn)一步針對(duì)固體可培養(yǎng)的9個(gè)微生物門(mén)分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳代第1、3、5、7和10次培養(yǎng)過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理分別獲得5、3、4、5和3門(mén)，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA處理則分別獲得3、3、6、3和4門(mén)，無(wú)論常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理還是低營(yíng)養(yǎng)處理，連續(xù)10次傳代過(guò)程中穩(wěn)定出現(xiàn)的有3個(gè)微生物門(mén)〔圖3(c)〕。

(a)和(b)分別為水稻土和可培養(yǎng)菌在微生物門(mén)和屬水平的物種共現(xiàn)維恩圖；(c)和(d)分別為土壤可培養(yǎng)細(xì)菌第1、3、5、7、10代的門(mén)和屬水平的物種共現(xiàn)維恩圖。NA、1/10 NA、NB和1/10 NB含義見(jiàn)圖1。

類似地，針對(duì)液體可培養(yǎng)的47個(gè)微生物門(mén)分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)第1、3、5、7和10次傳代培養(yǎng)過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理分別獲得5、3、43、39和27門(mén)，低營(yíng)養(yǎng) 1/10 NB處理則分別獲得32、41、37、28和27門(mén)；然而，連續(xù)10次傳代過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)共有微生物門(mén)穩(wěn)定出現(xiàn)，低營(yíng)養(yǎng)處理則發(fā)現(xiàn)23個(gè)共有微生物門(mén)。

在微生物屬水平上，水稻土本底土著微生物共有713屬，連續(xù)10次傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中，固體和液體常規(guī)培養(yǎng)基分別檢測(cè)到52和600屬，可培養(yǎng)菌占比分別為7.3%和84.2%。低營(yíng)養(yǎng)1/10培養(yǎng)條件下，固體和液體培養(yǎng)基分別檢測(cè)到62和597屬，可培養(yǎng)菌占比分別為8.7%和83.7%〔圖3(b)〕。其中，固體培養(yǎng)基獨(dú)有屬6個(gè)，液體培養(yǎng)基獨(dú)有屬594個(gè)，兩者共有屬68個(gè)。固體培養(yǎng)基的74個(gè)微生物屬包括常規(guī)營(yíng)養(yǎng)獨(dú)有屬12個(gè)，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA獨(dú)有屬22個(gè)，兩者共有屬40個(gè)。液體培養(yǎng)基的662個(gè)微生物屬包括常規(guī)營(yíng)養(yǎng)獨(dú)有屬65個(gè)，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB獨(dú)有屬62個(gè)，兩者共有屬535個(gè)。

進(jìn)一步針對(duì)連續(xù)傳代固體可培養(yǎng)微生物74屬的分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA處理分別獲得31、23、23、30和27屬，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA處理分別獲得38、32、34、32和33屬〔圖3(d)〕。然而，連續(xù)10次傳代培養(yǎng)過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理僅發(fā)現(xiàn)9個(gè)共有屬，而低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA處理則發(fā)現(xiàn)21個(gè)共有屬。類似地，針對(duì)液體可培養(yǎng)662個(gè)微生物屬的分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)第1、3、5、7和10次傳代培養(yǎng)過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB處理分別獲得44、29、501、441和317屬，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB處理則分別獲得271、485、420、287和258屬。值得注意的是，連續(xù)10次傳代過(guò)程中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)處理僅發(fā)現(xiàn)17個(gè)共有微生物屬穩(wěn)定出現(xiàn)，但低營(yíng)養(yǎng)處理則發(fā)現(xiàn)159個(gè)共有微生物屬穩(wěn)定出現(xiàn)〔圖3(d)〕。

2.4 水稻土本底及連續(xù)傳代過(guò)程中可培養(yǎng)微生物的物種組成變化

在微生物門(mén)分類水平上〔圖4(a)〕，本底水稻土中相對(duì)豐度>1%的優(yōu)勢(shì)門(mén)由高到低依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，上述菌門(mén)相對(duì)豐度分別為(31.04±2.46)%、(15.94±0.77)%、(13.35±0.32)%、(9.57±0.86)%和(9.14±1.03)%。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA培養(yǎng)基連續(xù)10次傳代過(guò)程中，變形菌門(mén)成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)類群，其相對(duì)豐度變化范圍為(97.91±0.14)%～(99.59±0.15)%，而綠灣菌門(mén)在第5、7代最高相對(duì)豐度分別僅為(1.18±0.81)%和(2.08±0.15)%。低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA培養(yǎng)條件下也得到了類似結(jié)果，變形菌門(mén)相對(duì)豐度變化范圍為(98.16±0.22)%～(99.00±0.55)%；而所有傳代過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)綠灣菌門(mén)，其相對(duì)豐度則略有增加，變化范圍為(0.51±0.31)%～(1.83±0.22)%。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB培養(yǎng)基連續(xù)10次傳代過(guò)程中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)類群，前者相對(duì)豐度變化范圍為(46.79±6.60)%～(57.13±6.78)%，后者為(38.91±6.78)%～(51.68±8.00)%；值得注意的是，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB培養(yǎng)條件下，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度隨著傳代次數(shù)增加而顯著降低，其變化范圍為(14.43±3.80)%～(67.23±7.35)%；此外，與固體培養(yǎng)基相比，液體培養(yǎng)基中均未檢測(cè)到綠灣菌門(mén)。

在微生物屬分類水平上〔圖4(b)〕，本底水稻土中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬依次為梭菌屬(Clostridium)、桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，上述菌屬相對(duì)豐度分別為(3.25±0.11)%、(1.74±0.25)%、(1.33±0.18)%、(0.51±0.41)%和(0.49±0.06)%。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA培養(yǎng)基連續(xù)10次傳代過(guò)程中，假單胞菌屬成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)類群，其相對(duì)豐度變化范圍為(97.70±0.61)%～(99.47±0.05)%。此外，也檢測(cè)到梭菌屬和桿菌屬，但兩個(gè)菌屬相對(duì)豐度極低，僅為(1.24±0.40)%和(0.35±0.05)%。低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA 培養(yǎng)條件下假單胞菌屬仍是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，但其相對(duì)豐度略有下降，變化范圍為(66.38±7.12)%～(96.29±0.95)%。同時(shí)，隨著傳代次數(shù)的增加，桿菌屬和代爾夫特菌屬(Delftia)成為優(yōu)勢(shì)類群，特別在第10代兩者相對(duì)豐度分別高達(dá)(18.07±4.40)%和(13.82±3.01)%，而在第1～7代兩個(gè)菌屬相對(duì)豐度范圍僅為(0.81±0.41)%～(2.16±0.39)%和(1.17±0.34)%～(2.73±2.12)%。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB連續(xù)10次傳代過(guò)程中，與固體培養(yǎng)基相比，假單胞菌屬相對(duì)豐度略有下降，但仍占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度為(45.48±6.62)%～(55.99±6.79)%。其他優(yōu)勢(shì)類群則包括梭菌屬、桿菌屬和類芽孢桿菌屬，上述菌屬相對(duì)豐度分別為(23.58±3.02)%～(42.40±11.70)%、(0.50±0.13)%～(5.90±0.62)%和(0.95±0.43)%～(3.52±0.98)%。此外，第1、3代檢測(cè)到的賴氨酸芽孢桿菌屬占比小，但在第5、7、10代其相對(duì)豐度增至(1.46±1.21)%～(6.74±1.53)%。值得注意的是，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB培養(yǎng)條件下，梭菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬隨著培養(yǎng)代數(shù)增加而急劇降低，假單胞菌屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，而類芽孢桿菌屬則呈現(xiàn)隨著傳代次數(shù)增加而增加的趨勢(shì)。

下劃線的分類群表示這些分類群序列顯示出高度的相似性，也表示固體培養(yǎng)基中所有優(yōu)勢(shì)門(mén)/屬，其余無(wú)下劃線標(biāo)記的分類群表示本底土壤、液體培養(yǎng)基中所有門(mén)/屬的分類群，兩者分類群圖例一致。(a) 水稻土和可培養(yǎng)菌在微生物門(mén)水平的物種組成；(b)水稻土和可培養(yǎng)菌在微生物屬水平的物種組成。NA、1/10 NA、NB和1/10 NB含義見(jiàn)圖1。所有處理均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.5 水稻土連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中可培養(yǎng)菌的變化規(guī)律

微生物在屬水平的組成差異火山圖見(jiàn)圖5。與水稻土背景微生物類群相比，固體培養(yǎng)基有43個(gè)優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度顯著降低，14個(gè)屬未發(fā)生顯著變化，僅假單胞菌屬顯著增加，其在本底土壤中的相對(duì)豐度僅為1.33%，而在固體可培養(yǎng)菌群落中占比高達(dá)93.90%，為本底土壤的70.6倍〔圖5(a)〕。液體培養(yǎng)基中可培養(yǎng)微生物也存在類似規(guī)律，相較于水稻土背景微生物類群，共計(jì)643屬相對(duì)豐度顯著降低，而69個(gè)屬未發(fā)生明顯變化，僅假單胞菌屬顯著增加，占比高達(dá)44.70%，為本底土壤的33.6倍〔圖5(b)〕。

進(jìn)一步針對(duì)固體和液體培養(yǎng)基中相對(duì)豐度最高的10個(gè)可培養(yǎng)微生物屬，計(jì)算其相對(duì)于本底土壤的富集率〔圖5(c)〕。結(jié)果表明，固體可培養(yǎng)微生物選擇性地富集了假單胞菌屬、代爾夫特菌屬和無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)微生物類群，3個(gè)菌屬在本底土壤的相對(duì)豐度分別為(1.33±0.18)%、(0.02±0.01)%和(0.001±0.00)%，在傳代過(guò)程中的最高相對(duì)豐度分別為(99.47±0.05)%、(15.56±3.00)%和(0.19±0.02)%，最高富集率分別為75倍、778倍和190倍，而且在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)和低營(yíng)養(yǎng)條件下沒(méi)有明顯差異〔圖5(c)〕。然而，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB液體培養(yǎng)基主要富集假單胞菌屬、梭菌屬、桿菌屬、類芽孢桿菌屬、代爾夫特菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬優(yōu)勢(shì)物種，在傳代過(guò)程中的最高相對(duì)豐度為(85.22±1.97)%、(17.92±1.85)%、(4.38±1.33)%、(16.35±6.55)%、(1.04±0.52)%和(34.55±14.07)%，最高富集率分別為64倍、6倍、3倍、33倍、52倍和68倍。低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB培養(yǎng)條件下，主要富集假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬，其在本底土壤的相對(duì)豐度分別為(1.33±0.18)%、(0.49±0.06)%和(0.51±0.41)%，在傳代過(guò)程中的最高相對(duì)豐度分別為(55.99±6.79)%、(3.52±0.98)%和(6.74±1.53)%，最高富集率分別為42倍、7倍和13倍〔圖5(c)〕。

圖5 連續(xù)10代培養(yǎng)過(guò)程中水稻土可培養(yǎng)微生物屬的富集增長(zhǎng)規(guī)律

3 討論

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析水稻土本底微生物多樣性，通過(guò)與連續(xù)傳代過(guò)程中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后的微生物多樣性遠(yuǎn)低于原始土壤多樣性，第1代可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性最低，僅為本底土壤多樣性的1%～5%，并且不同傳代過(guò)程中微生物多樣性基本穩(wěn)定，但低營(yíng)養(yǎng)連續(xù)傳代富集在一定程度上可提高微生物多樣性。一般認(rèn)為，由于實(shí)驗(yàn)室采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，且此類培養(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而原始自然環(huán)境中大多為貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)；因此，在傳統(tǒng)微生物富集培養(yǎng)過(guò)程中，由于環(huán)境條件的劇烈變化，一些微生物不能適應(yīng)而死亡，另一些微生物則可能產(chǎn)生孢子進(jìn)入休眠狀態(tài)，或者通過(guò)改變細(xì)胞形態(tài)進(jìn)入維持一定代謝活性但不生長(zhǎng)繁殖的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”[13]。另一方面，可培養(yǎng)細(xì)菌初期獲取養(yǎng)分大量繁殖會(huì)產(chǎn)生“活性氧化物”破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，從而加速部分細(xì)胞死亡，最終降低細(xì)菌可培養(yǎng)性[14]。筆者研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)平板涂布培養(yǎng)無(wú)法代表土壤微生物群落全貌，應(yīng)結(jié)合分子生態(tài)學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)可培養(yǎng)策略，利用兩種技術(shù)的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，更好地挖掘可培養(yǎng)微生物資源。

筆者研究選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，分別取第1、3、5、7、10代進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序?；?6S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分類結(jié)果表明，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA和NB培養(yǎng)基具有可培養(yǎng)穩(wěn)定性，隨著傳代次數(shù)的增加，水稻土優(yōu)勢(shì)可培養(yǎng)微生物類群穩(wěn)定連續(xù)出現(xiàn)，而低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA 和1/10 NB條件下，隨著傳代次數(shù)增加，第1代出現(xiàn)的微生物菌群逐漸被某些優(yōu)勢(shì)菌替代。微生物的群落豐富度和均勻度是反映微生物物種多樣性的重要指標(biāo)，且一般情況下物種豐富度越低，其均勻度就越高[15]。在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，雖然物種豐富度有所下降，但其均勻度升高，致使物種多樣性變化不大。在相同的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA或者NB培養(yǎng)條件下，不同傳代次數(shù)的選擇壓力并未發(fā)生本質(zhì)變化，各存活物種的數(shù)量和生存權(quán)重之和越來(lái)越接近，可能是導(dǎo)致物種均勻度升高而趨于穩(wěn)定的原因。此外，水稻土本底土著微生物多樣性較高，在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，被淘汰微生物的生態(tài)位易被群落內(nèi)其他微生物替代，以維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡[16]。微生物群落結(jié)構(gòu)受各種環(huán)境因子的影響，不同的因子能夠觸發(fā)微生物群落產(chǎn)生不同的演替方向[17]。筆者研究中本底土壤微生物群落與傳代富集物群落結(jié)構(gòu)有顯著差異，主要原因可能是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)元素(碳、氮)、狀態(tài)(固液體)等因素的選擇性富集驅(qū)動(dòng)壓力所致。例如，微生物生長(zhǎng)底物和生態(tài)位方面的選擇可能與微生物進(jìn)化適應(yīng)策略緊密相關(guān)[18]。研究表明采用經(jīng)典的可培養(yǎng)法分析微生物群落的高復(fù)雜性可能是由初始土壤內(nèi)在的高豐度和隨機(jī)性微生物輸入引起的[19]。例如，研究表明烴類物質(zhì)越難降解，微生物間的協(xié)同作用就越強(qiáng)，且微生物群落的合作強(qiáng)度隨氮素脅迫的增強(qiáng)而增加[20]。因此，在持續(xù)選擇壓力作用下，連續(xù)傳代培養(yǎng)階段微生物群落不斷演化并適應(yīng)該選擇壓力，且各物種協(xié)同作用可能不斷優(yōu)化，逐漸形成了相對(duì)穩(wěn)定的菌群[21]。

培養(yǎng)基成分顯著影響可培養(yǎng)細(xì)菌群落，筆者研究結(jié)果表明液體培養(yǎng)相比于固體培養(yǎng)可獲得更多的細(xì)菌類群。液體可培養(yǎng)細(xì)菌占土壤微生物的比例高達(dá)92.8%，而固體培養(yǎng)基僅為10.4%，表明液體培養(yǎng)基策略優(yōu)于固體培養(yǎng)。在微生物屬的分類水平上，16S rRNA基因分析結(jié)果表明，固體培養(yǎng)基選擇性地富集了假單胞菌屬、桿菌屬、代爾夫特菌屬，而液體培養(yǎng)基選擇富集了假單胞菌屬、梭菌屬、桿菌屬、類芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬。氧氣濃度差異可能是導(dǎo)致固液培養(yǎng)基選擇不同微生物的重要原因。例如，空氣中氧氣體積分?jǐn)?shù)高達(dá)19%，而液體培養(yǎng)基中溶解氧濃度可能低于1 g·L-1。固體培養(yǎng)基中菌落易與空氣接觸，假單胞菌屬專性好氧，在固體培養(yǎng)基中更易生長(zhǎng)，而液體培養(yǎng)基中僅有液體表面微生物接觸氧氣，這可能是液體培養(yǎng)基假單胞菌屬相對(duì)豐度低的重要原因。也有研究表明類芽孢桿菌屬和梭菌屬適應(yīng)氧氣脅迫能力更強(qiáng)，而桿菌屬是一類好氧和兼性厭氧菌。此外，盡管理論上瓊脂不容易被微生物代謝吸收利用，但也有研究發(fā)現(xiàn)在中性或堿性條件下，磷酸鹽和瓊脂混合經(jīng)高溫滅菌后會(huì)產(chǎn)生 H2O2[22]，而液體培養(yǎng)基中磷酸鹽單獨(dú)加熱則不會(huì)產(chǎn)生 H2O2，H2O2對(duì)微生物生長(zhǎng)有明顯抑制作用[23]，這也可能是造成固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)之間微生物富集物具有較大差異的重要原因。

筆者研究結(jié)果表明土壤中可培養(yǎng)菌比例極有可能被低估。經(jīng)典的“99%難培養(yǎng)”概念，事實(shí)上缺乏可信的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。筆者前期的分析表明，“99%難培養(yǎng)”是“平板計(jì)數(shù)異常”的同義詞。通過(guò)顯微計(jì)數(shù)和培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)，GRAY[24]分析了草地土壤和農(nóng)田土壤中微生物數(shù)量，發(fā)現(xiàn)基于固體平板菌落的稀釋平板計(jì)數(shù)法所得微生物數(shù)量，僅占顯微計(jì)數(shù)所得微生物數(shù)量的0.09%～0.74%，提出了“平板計(jì)數(shù)異?！钡默F(xiàn)象和名詞。最近，MARTINY[25]對(duì)來(lái)自6個(gè)不同生境的樣品進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)微生物比例為52%～74%，在一定程度上表明土壤中微生物多樣性的定量化分析仍需開(kāi)展更多研究。筆者研究中固體平板培養(yǎng)的微生物多樣性遠(yuǎn)低于液體培養(yǎng)，采用高通量測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到水稻土本底土著微生物713屬，連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中共獲得可培養(yǎng)菌668屬，連續(xù)10次傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中，固體和液體常規(guī)培養(yǎng)基分別檢測(cè)到52屬和600屬，可培養(yǎng)菌占比分別為7.3%和84.2%。低營(yíng)養(yǎng)1/10培養(yǎng)條件下，固體和液體培養(yǎng)基分別檢測(cè)到62屬和597屬，可培養(yǎng)菌占比分別為8.7%和83.7%。如前所述，造成固體和液體可培養(yǎng)菌比例差異的原因可能包括氧氣、瓊脂、附著物環(huán)境差異[26]，特別是固體和液體培養(yǎng)基的環(huán)境特征差異較大。固體平板表面為微生物提供了附著物，更利于可培養(yǎng)微生物群落形成由胞外多聚基質(zhì)聯(lián)合的微生物被膜，導(dǎo)致其微生境形成后極難發(fā)生顯著改變，進(jìn)而刺激了特定的微生物群落快速生長(zhǎng)，遺漏了大多數(shù)微生物[27]。在液體培養(yǎng)基中，可能隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，其生態(tài)位一直處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，包括細(xì)菌群落之間的群體感應(yīng)過(guò)程，進(jìn)而可能影響細(xì)菌及其共生微生物的生理行為及生態(tài)位，刺激更多微生物生長(zhǎng)并提升可培養(yǎng)菌比例[28]。然而，已有研究大多針對(duì)純菌株的生理生化和遺傳學(xué)研究[26]，未來(lái)仍需針對(duì)復(fù)雜的混合菌群深入開(kāi)展相關(guān)機(jī)理分析，筆者研究結(jié)果則為定量化研究復(fù)雜土壤中可培養(yǎng)微生物提供了依據(jù)。

不同營(yíng)養(yǎng)狀況也可能顯著影響原位土壤微生物區(qū)系組成和可培養(yǎng)菌。例如，有研究表明，施氮量顯著影響土壤微生物群落的數(shù)量、豐度及多樣性[15-16]。經(jīng)典的可培養(yǎng)方法使用高濃度營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，可能抑制一部分微生物生長(zhǎng)，若適當(dāng)降低營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度則可能減弱不利影響。研究發(fā)現(xiàn)低濃度基質(zhì)培養(yǎng)條件下，可培養(yǎng)細(xì)菌在數(shù)量和種類上顯著多于高濃度基質(zhì)培養(yǎng)基[10]。盡管筆者研究中高營(yíng)養(yǎng)和低營(yíng)養(yǎng)處理效果在固體和液體之間的差異較大，但與已有研究結(jié)論基本一致。例如，在固體培養(yǎng)基中，與常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NA相比，低營(yíng)養(yǎng)1/10 NA能夠獲得更多可培養(yǎng)微生物類群，如Chao指數(shù)〔圖2(a)〕，群落多樣性高，如Simpson指數(shù)〔圖2(c)〕，但在數(shù)量上卻呈降低趨勢(shì)〔圖1(b)〕；其中可能的原因是筆者試驗(yàn)中添加的蛋白胨量過(guò)低。有研究表明營(yíng)養(yǎng)濃度過(guò)低時(shí)，可培養(yǎng)微生物數(shù)量反而下降[11]，但筆者研究結(jié)果表明物種多樣性反而增加，更有利于富集分離土壤中的重要功能微生物。氮素濃度也可能影響特定的微生物富集。例如，筆者研究中液體可培養(yǎng)微生物中，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)NB主要富集假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬，其中，賴氨酸芽孢桿菌屬優(yōu)勢(shì)物種屬在連續(xù)傳代過(guò)程中保持相對(duì)增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明賴氨酸芽孢桿菌屬喜好富氮環(huán)境，而低營(yíng)養(yǎng)1/10 NB培養(yǎng)條件下，則額外富集了梭菌屬、桿菌屬、代爾夫特菌屬優(yōu)勢(shì)物種，特別是這些物種在傳代富集過(guò)程中，隨代際增加而增加，表明這幾類微生物可能更喜低氮環(huán)境。已有研究表明，高氮供應(yīng)使土壤微生物DNA/RNA復(fù)制、蛋白代謝提高，有益于桿菌等富營(yíng)養(yǎng)型微生物生長(zhǎng)[16]，而缺氮脅迫會(huì)激發(fā)更多種類的寡營(yíng)養(yǎng)型微生物生長(zhǎng)，并刺激其利用難降解碳源的能力，使其相對(duì)豐度增加[4]。筆者研究結(jié)果與上述報(bào)道基本一致，表明相對(duì)于富營(yíng)養(yǎng)型微生物，氮素脅迫下更多的不同營(yíng)養(yǎng)利用類型微生物更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，這可能是低氮土壤環(huán)境中微生物多樣性較高的重要原因。整體而言，筆者研究結(jié)果表明土壤可培養(yǎng)微生物的主要決定因素是固體和液體條件，適當(dāng)增加培養(yǎng)代數(shù)并降低營(yíng)養(yǎng)含量，有可能獲得更多可培養(yǎng)微生物。

4 結(jié)論

土壤可培養(yǎng)微生物受到培養(yǎng)基形態(tài)、培養(yǎng)基成分和傳代次數(shù)的影響?；?6S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分類結(jié)果表明，通過(guò)高通量測(cè)序分析可獲得更多的微生物分類信息，規(guī)避了傳統(tǒng)培養(yǎng)的內(nèi)在缺陷；隨著傳代次數(shù)的增加，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)固體和液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中土壤可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群假單胞菌屬、梭菌屬、桿菌屬、類芽孢桿菌屬穩(wěn)定連續(xù)出現(xiàn)，而營(yíng)養(yǎng)降低為1/10之后，隨著傳代次數(shù)增加，第1代出現(xiàn)的部分微生物菌群逐漸被某些優(yōu)勢(shì)菌替代，如代爾夫特菌屬。同時(shí)，連續(xù)10次傳代富集培養(yǎng)過(guò)程中，固體和液體常規(guī)培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌占比分別為7.3%和84.2%。低營(yíng)養(yǎng)1/10培養(yǎng)條件下，固體和液體培養(yǎng)基可培養(yǎng)菌占比分別為8.7%和83.7%，僅有7個(gè)屬相對(duì)豐度顯著增加；固體和液體培養(yǎng)基具有極強(qiáng)的選擇性，分別富集了假單胞菌屬和桿菌屬優(yōu)勢(shì)屬，而液體相比于固體能富集更多優(yōu)勢(shì)微生物類群，其中1/10低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)也表現(xiàn)出類似規(guī)律，且桿菌屬、類芽孢桿菌屬和代爾夫特菌屬等不同營(yíng)養(yǎng)水平微生物，在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中隨代際增加而增加。這些研究結(jié)果表明，適當(dāng)減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)元素含量，合理增加傳代次數(shù)，有可能獲得更多可培養(yǎng)微生物資源，未來(lái)應(yīng)深入研究可培養(yǎng)微生物功能網(wǎng)絡(luò)互作機(jī)制及其農(nóng)業(yè)環(huán)境意義，為定向發(fā)掘重要微生物資源及功能提供參考。