裴巧林，陳德芳，張小麗，李良玉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611130)

2021年，我國小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)263.36萬噸，位居淡水養(yǎng)殖品種第6位。然而，春夏交替季節(jié)小龍蝦病害時(shí)有發(fā)生，“五月瘟”、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)(曹海鵬等，2014)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)(馬小榮等，2012)和維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)(胡騫等，2020)感染引起小龍蝦爛鰓、潰瘍和腸炎等疾病是養(yǎng)殖中的常見病害。2022年6月初，四川崇州養(yǎng)殖的小龍蝦表現(xiàn)為體形消瘦、體色加深、活力較差、螯足無力、斷須且斷面發(fā)黑、尾柄有水泡等癥狀，死亡率在30%左右。

本研究針對(duì)該病例開展了病原鑒定和體外藥物篩選工作，以期為小龍蝦的健康養(yǎng)殖和細(xì)菌性疾病防控提供參考。

一、材料與方法

1.細(xì)菌分離與鑒定 取典型患病的小龍蝦，體重(14.08±1.0)克，用75%酒精對(duì)其體表進(jìn)行消毒，無菌操作取其肝胰腺組織，劃線接種于TSA培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基放置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中，24小時(shí)之后取出培養(yǎng)基進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面的菌落光滑、有光澤、半透明狀；挑選菌落進(jìn)行純化，革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陰性菌，短桿狀；對(duì)菌種使用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2.組織病理觀察采集患病小龍蝦的鰓、肝胰腺、腸道組織，經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟處理，切片厚度為4微米，組織切片用蘇木精—伊紅(HE)染色，用中性樹脂封片，再用顯微鏡觀察拍照。

3.藥敏試驗(yàn) 用棉簽蘸取少量菌液均勻涂抹在TSA培養(yǎng)基上，采用標(biāo)準(zhǔn)Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和多西環(huán)素等11種藥物的敏感性進(jìn)行檢測(cè)，以抑菌圈直徑作為判定標(biāo)準(zhǔn)，確定致病菌株對(duì)藥物的敏感程度。

二、結(jié)果

1.剖檢觀察 對(duì)12尾病蝦進(jìn)行剖檢觀察，剪取少量鰓絲制作水壓片，在顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。剖檢可見病蝦鰓絲發(fā)黑、頭胸甲內(nèi)有少量積液、肝胰腺發(fā)黑，部分病蝦肝胰腺顏色呈淺黃色、空胃、空腸、有腸炎。

2.致病菌的鑒定 提取細(xì)菌基因組DNA后，采用PCR擴(kuò)增16S rRNA序列并測(cè)序，擴(kuò)增獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果顯示，分離菌的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫中的弗氏檸檬酸桿菌同源性最高，達(dá)99.8%以上。進(jìn)一步通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，分離菌Pc202006株與弗氏檸檬酸桿菌聚為一支(圖1)，確診該菌為弗氏檸檬酸桿菌。

圖1 分離菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.組織病理觀察 患病小龍蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)松散，呈壞死狀態(tài)；肝小管腔擴(kuò)大或形態(tài)不完整，管腔破裂；肝小管上皮儲(chǔ)存細(xì)胞(R細(xì)胞)、分泌細(xì)胞(B細(xì)胞)等大量壞死解體或空泡化，部分破裂組織落入管腔(圖2A)。一些細(xì)胞內(nèi)有巨大空泡形成，呈海綿狀；分泌細(xì)胞的完整性缺失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)含棕色顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡(圖2B)。鰓絲結(jié)構(gòu)模糊，但鰓膜結(jié)構(gòu)清晰，鰓膜和呼吸上皮細(xì)胞分離形成較大空腔，呼吸上皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞輪廓消失，細(xì)胞核腫大裂解，排列不整齊，嗜酸性粒細(xì)胞增多(圖2C)。皺嵴結(jié)構(gòu)受損；柱狀上皮組織壞死，核裂解；結(jié)締組織部分壞死溶解，部分區(qū)域和肌肉層脫離形成空腔，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(圖2D)。

圖2 患病小龍蝦肝胰腺、鰓和腸道病理變化

4.致病菌的藥敏性Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在11種抗菌藥中，分離菌株對(duì)慶大霉素、氟苯尼考和恩諾沙星敏感，對(duì)于多黏菌素B和多西環(huán)素介于敏感和耐藥之間，對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素、新霉素等耐藥(表1)。

表1 弗氏檸檬酸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

三、分析與討論

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)為隸屬于腸桿菌科、檸檬酸桿菌屬的革蘭氏陰性短桿菌。該菌具有鞭毛，菌毛遍布菌體，無莢膜，廣泛分布于自然界，是人和動(dòng)物腸道的正常菌群。楊方園(2013)等報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致花鰻鱺(Anguilla marmorata)鰓部嚴(yán)重腫脹、鰓絲潰爛、肝臟充血、膽囊腫大，累計(jì)死亡率可達(dá)30%。張東星等(2016)報(bào)道團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)經(jīng)人工感染弗氏檸檬酸桿菌之后，可導(dǎo)致團(tuán)頭魴腹部、鰾、肝臟嚴(yán)重出血，腎臟和脾臟腫大而死亡。石征宇等(2018)從羅非魚(Oreochromis mossambicus)心臟中分離出弗氏檸檬酸桿菌，回歸感染7天死亡率達(dá)93.3%。小龍蝦中弗氏檸檬酸桿菌感染的報(bào)道逐年增加。陳紅蓮等(2014)從活力較差、體表無潰瘍、肝胰腺顏色變淺、空腸、空胃的患病小龍蝦肝胰腺中分離到弗氏檸檬酸桿菌。唐慶權(quán)等(2019)從患病小龍蝦肝胰腺中分離出弗氏檸檬酸桿菌，病蝦的主要癥狀為攝食量減少、螯足無力、活力較差、抗應(yīng)激能力較差，部分個(gè)體體表變黑，解剖發(fā)現(xiàn)肝胰腺顏色變淺。

本研究中，弗氏檸檬酸桿菌感染的主要癥狀為病蝦鰓絲發(fā)黑、頭胸甲內(nèi)有少量積液、肝胰腺發(fā)黑，部分病蝦肝胰腺顏色為淺黃色、空胃、空腸且腸道變藍(lán)等。此次小龍蝦發(fā)病前崇州的氣溫突然升高，白天平均氣溫達(dá)到32℃左右。溫度的升高導(dǎo)致池塘中藻類大量繁殖、溶氧降低，小龍蝦的應(yīng)激變大、抵抗力下降，同時(shí)促進(jìn)了小龍蝦的攝食，排泄物和殘餌也增加，加劇水質(zhì)變差，使得病原菌更加容易滋生。

本研究分離株對(duì)慶大霉素、氟苯尼考和恩諾沙星敏感，但分離株對(duì)同為氨基糖苷類的藥物新霉素耐藥。岳剛毅等(2011)研究揭示口服氟苯尼考可通過小龍蝦的胃腸道迅速吸收，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為1.00小時(shí)，血淋巴中藥物消除半衰期為10.01小時(shí)，而生物利用度較低，僅為21.6%。甲殼動(dòng)物的肝胰腺不僅是藥物吸收器官，也是藥物代謝消除器官，氟苯尼考經(jīng)肝胰腺代謝消除后再進(jìn)入血淋巴的藥量減少，引起生物利用度變低。因此在使用氟苯尼考時(shí)需要考慮其在體內(nèi)的代謝速度和血藥濃度。恩諾沙星是本研究分離株另一敏感藥物，在已報(bào)道的四川內(nèi)江、廣東三水、江蘇揚(yáng)州、安徽滁州等地蝦檸檬酸桿菌的藥敏結(jié)果中，恩諾沙星普遍表現(xiàn)出了良好的殺菌作用。錢云云等(2007)研究發(fā)現(xiàn)恩諾沙星在羅氏沼蝦中的組織滲透能力較強(qiáng)，其在組織中的藥物濃度高于血淋巴。

從組織病理來看，病蝦肝胰腺、鰓和腸道組織出現(xiàn)明顯的病理特征。在肝胰腺中，肝胰腺小管是其結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。肝小管內(nèi)常見4種細(xì)胞，即分泌細(xì)胞、儲(chǔ)存細(xì)胞、纖維細(xì)胞和胚細(xì)胞，其中分泌細(xì)胞和儲(chǔ)存細(xì)胞數(shù)量較多(陶易凡等，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，病蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷，肝小管腔擴(kuò)大或形態(tài)不完整，B細(xì)胞、R細(xì)胞嚴(yán)重空泡化，與Liu等(2020)研究結(jié)果一致。但Liu等(2020)觀察到肝胰腺上皮細(xì)胞與結(jié)締組織分離，與本次研究結(jié)果不同。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)病蝦肝胰腺B細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)含有棕色顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡，胡騫等(2020)在維氏氣單胞菌感染的小龍蝦肝胰腺組織病理學(xué)研究中也觀察到了這種現(xiàn)象，而棕色顆粒的實(shí)質(zhì)以及其產(chǎn)生的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本次研究觀察到微血腔結(jié)締組織消失，無血細(xì)胞，說明鰓的基本功能已經(jīng)受損。鰓絲結(jié)構(gòu)模糊、鰓膜和呼吸上皮細(xì)胞分離、呼吸上皮細(xì)胞壞死、嗜酸性粒細(xì)胞增多，這些表現(xiàn)與Liu(2020)等結(jié)果一致。此外，BALDISSERA M D等(2018)還發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌通過抑制肌酸激酶，從而影響鰓的代謝，造成鰓損傷，這為病原菌造成小龍蝦鰓損傷機(jī)制的研究提供了思路。觀察病蝦腸道，發(fā)現(xiàn)腸道皺嵴結(jié)構(gòu)受損、柱狀上皮組織壞死、結(jié)締組織部分壞死溶解、部分區(qū)域和肌肉層脫離形成空腔、出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，與草魚被病原菌感染后的腸道組織相似；不同的是草魚腸道未出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和結(jié)締組織與肌肉層脫離的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)轸~類免疫系統(tǒng)的發(fā)達(dá)程度高于甲殼類動(dòng)物(XIONG F等，2020)。