于凱雯，劉沐欣，王升厚，王 澤*

（ 1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034 ； 2.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034 ）

蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris(L.) Link]是蛹蟲(chóng)草菌子座與菌核的復(fù)合體，屬于子囊菌門(mén)（Ascomycetes）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲(chóng)草屬（Cordyceps）[1]。蛹蟲(chóng)草不僅作為食品受眾廣泛，在藥用領(lǐng)域也具有舉足輕重的地位和作用[2-3]。目前，隨著市場(chǎng)需求增多和相關(guān)研究不斷深入，蛹蟲(chóng)草人工栽培技術(shù)愈發(fā)完善和成熟[4-5]。蛹蟲(chóng)草的生物活性成分含量與菌種選育[6]、栽培基質(zhì)和培養(yǎng)方式[7-8]等息息相關(guān)。如以柞蠶蛹為栽培基質(zhì)的蛹蟲(chóng)草，其多糖和蛋白質(zhì)含量高于小麥和大米為栽培基質(zhì)的蛹蟲(chóng)草[9]；麥粒培養(yǎng)基獲得的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體核苷含量顯著高于大米米基栽培方式[10]。因此，市場(chǎng)流通中的蛹蟲(chóng)草的生物活性成分含量存在顯著差異。前期急性試驗(yàn)結(jié)果顯示，富硒蛹蟲(chóng)草組小鼠出現(xiàn)了肝臟臟器指數(shù)偏大、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性下降等異常狀況[11]。基于此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)亞慢性試驗(yàn)和30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)富硒蛹蟲(chóng)草的食用安全性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通蛹蟲(chóng)草及富硒蛹蟲(chóng)草子實(shí)體樣品均由沈陽(yáng)師范大學(xué)功能性蛹蟲(chóng)草省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室栽培提供。

SPF昆明系級(jí)小白鼠，18~22 g，雌雄均有，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。小鼠于動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃、濕度50%~60%。

1.2 試劑與儀器

小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、白蛋白（ALB）試劑盒、尿素氮（BUN）試劑盒、肌酐（CREA）試劑盒及膽固醇（TC）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

5424-R高速冷凍離心機(jī)（艾本德股份公司）、9PT-3502Q酶標(biāo)分析儀（北京市普天新橋技術(shù)有限公司）、BX-50系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS公司）、石蠟切片機(jī)（上海青鋼包裝機(jī)械有限公司）、CS-Ⅲ高純水發(fā)生儀（滕州市經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲(chóng)草噴霧粉制備

普通蛹蟲(chóng)草及富硒蛹蟲(chóng)草真空干燥后，機(jī)器粉碎，過(guò)80目篩，去離子水溶解，55 ℃旋蒸浸提2 h，4 000 r/min離心10 min，過(guò)濾后噴霧干燥制備噴霧粉，4 ℃密封儲(chǔ)存，配制成水溶液使用。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告，蛹蟲(chóng)草正常成人推薦使用量為2 g/60 kg·bw，根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算得出小鼠基礎(chǔ)使用劑量為12.1 mg/20 g·bw。

1.3.2.1 亞慢性試驗(yàn)

亞慢性試驗(yàn)共設(shè)置3組，每組10只小鼠。兩個(gè)試驗(yàn)組小鼠分別灌胃基礎(chǔ)使用劑量的富硒蛹蟲(chóng)草（FX組）及普通蛹蟲(chóng)草（PT組），容量為0.5 mL/只；空白對(duì)照組（CK組）小鼠灌胃等量蒸餾水。試驗(yàn)期60 d。

1.3.2.2 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置7組，每組10只小鼠。6個(gè)試驗(yàn)組小鼠分別灌胃3倍、10倍和30倍基礎(chǔ)使用劑量的富硒蛹蟲(chóng)草（FX組）及普通蛹蟲(chóng)草（PT組），用量為0.5 mL/只；空白對(duì)照組（CK組）小鼠灌胃等量蒸餾水，連續(xù)記錄小鼠的生存狀態(tài)。試驗(yàn)期30 d。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.3.1 組織病理學(xué)檢查

灌胃結(jié)束24 h后，所有小鼠處死，解剖并稱取肝臟、脾臟、胸腺、腎臟、胃及睪丸重量，計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100% （1）

采集各組小鼠肝臟、腎臟、胃及小腸組織，4%多聚甲醛固定，4 ℃保存過(guò)夜。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，7 μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色，隨機(jī)選取20個(gè)視野觀察記錄。

1.3.3.2 肝臟、腎臟基礎(chǔ)功能檢測(cè)

灌胃結(jié)束后，所有小鼠眼球取血，室溫靜置2 h，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取血清-80 ℃儲(chǔ)存。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行定量檢測(cè)。其中ALT采用賴氏法測(cè)定；AST采用微板法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm；ALB采用溴甲酚綠法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為628/630 nm；BUN采用脲酶法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為640 nm；CREA采用肌氨酸氧化酶法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為546 nm；TC采用單試劑GPO-PAP法測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞慢性試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖1、圖2、表1）

亞慢性試驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠活動(dòng)正常，被毛有光澤，糞便良好，未出現(xiàn)死亡案例。

由圖1可知，F(xiàn)X組小鼠的肝臟指數(shù)和胃指數(shù)顯著高于CK組（P<0.05），其他臟器差異不顯著（P>0.05）。

圖1 亞慢性試驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)結(jié)果Fig.1 Results of organ index in subchronic mice

由圖2可知，各組小鼠肝臟、腎臟、胃、腸組織均未見(jiàn)病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變。

圖2 亞慢性試驗(yàn)小鼠臟器HE染色結(jié)果（×400）Fig.2 HE staining results of organs in subchronic mice (×400)

由表1可知，各組小鼠肝功能、腎功能基礎(chǔ)性血清生化指標(biāo)差異均不顯著（P>0.05）。

表1 亞慢性試驗(yàn)小鼠肝臟、腎臟基礎(chǔ)功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Detection results of basic function indexes of liver and kidney in subchronic mice

2.2 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖3、圖4、表2）

30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)期間，30倍劑量FX組小鼠出現(xiàn)拒絕飲食飲水、腹瀉、身體佝僂、全身顫抖、被毛粗亂稀疏且偏黃、精神不振等不良狀態(tài)，并于灌胃7 d內(nèi)全部死亡，其他各組無(wú)死亡案例。因此，30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果僅有CK組、3個(gè)劑量PT組以及3倍、10倍FX組。

由圖3可知，與CK組相比，各劑量PT組小鼠腎臟指數(shù)均顯著降低（P<0.05），30倍劑量PT組小鼠胃臟指數(shù)顯著降低明顯（P<0.05），3倍劑量及10倍劑量FX組小鼠腎臟指數(shù)顯著降低（P<0.05）。

圖3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)結(jié)果Fig.3 Results of organ index of mice in 30 days feeding test

由圖4可知，各組小鼠臟器組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞完整，未見(jiàn)瘀血、水腫、壞死或炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)改變。

圖4 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)小鼠臟器HE染色結(jié)果（×400）Fig.4 HE staining results of organs of mice in 30 days feeding test (×400)

由表2可知，與CK組相比，30倍劑量PT組小鼠血清ALT活性及TC含量顯著降低（P<0.05），CREA含量顯著升高（P<0.05）；10倍劑量FX組小鼠血清TC含量顯著降低（P<0.05），CREA含量顯著升高（P<0.05）。與CK組相比，PT組及FX組小鼠血清AST活性及ALB、BUN的含量差異 均不顯著（P>0.05）。

表2 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)小鼠肝臟、腎臟基礎(chǔ)功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of basic function indexes of liver and kidney of 30 day feeding test

3 討論

亞慢性試驗(yàn)通過(guò)較長(zhǎng)期的動(dòng)物試驗(yàn)確定受試物的安全性，為慢性試驗(yàn)摸索適宜的接觸劑量。本研究中，亞慢性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠大體解剖、病理切片結(jié)果及血清生化指標(biāo)差異均不顯著，表明較長(zhǎng)時(shí)間攝入推薦劑量的兩種蟲(chóng)草均未對(duì)小鼠產(chǎn)生亞慢性毒性。

30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)可初步獲得受試物造成機(jī)體損傷的劑量范圍，從而確定受試物的食用安全性及范圍。有研究表明，當(dāng)小鼠的硒攝入量為0.06~0.99 μg/g時(shí)，會(huì)出現(xiàn)不同程度的硒中毒現(xiàn)象[12]。本試驗(yàn)中，30倍劑量FX組小鼠出現(xiàn)拒食、腹瀉、身體佝僂、全身顫抖、被毛粗亂稀疏且偏黃等不良生長(zhǎng)狀況，并在7 d內(nèi)全部死亡，由此推測(cè)30倍劑量FX組小鼠存在硒中毒傾向。機(jī)體血清TC含量的降低與肝臟功能異常具有一定相關(guān)性，當(dāng)出現(xiàn)肝炎、肝硬化等肝功能障礙時(shí)，血清TC含量會(huì)降低[13]。CREA是衡量腎功能的主要指標(biāo)，其含量增高表示腎功能出現(xiàn)損傷，甚至衰竭，故可作為早期腎病診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一[14-15]。本試驗(yàn)中，30倍劑量PT組和10倍劑量FX組小鼠出現(xiàn)血清TC含量降低及CREA含量顯著升高的狀況，推測(cè)30倍劑量普通蛹蟲(chóng)草和10倍劑量富硒蛹蟲(chóng)草對(duì)小鼠機(jī)體的肝臟和腎臟代謝功能產(chǎn)生了較明顯的損害。

4 結(jié)論

綜上所述，普通蛹蟲(chóng)草和富硒蛹蟲(chóng)草均建議按照推薦劑量使用，同時(shí)較長(zhǎng)時(shí)期連續(xù)攝入兩種蟲(chóng)草均具有良好的食用安全性。為更完整地評(píng)價(jià)兩種蟲(chóng)草的使用安全性，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行慢性毒理性試驗(yàn)加以深入佐證。