劉思潔，過(guò)偉峰，王君君，王小玲

南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

焦慮癥分為慢性焦慮和驚恐障礙兩種形式，主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈、持續(xù)、與實(shí)際環(huán)境不符的擔(dān)憂和恐懼，常伴有心動(dòng)過(guò)速、失眠等自主神經(jīng)功能紊亂癥狀。焦慮的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明確，西醫(yī)治療以苯二氮卓艸類、非苯二氮類抗焦慮藥、選擇性5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)再攝取抑制劑等抗焦慮藥為主，但常存在體質(zhì)量增加、嗜睡、藥物依賴等不良反應(yīng)。中醫(yī)藥治療焦慮癥具有較好療效，尤以黃連溫膽湯最為常用［1-4］?！侗静菥V目》謂黃連“瀉肝火，去心竅惡血，止驚悸”，是治療心煩、失眠、心悸不寧的常用藥物。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究黃連抗焦慮的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 黃連有效成分及其蛋白靶點(diǎn)從中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“黃連”為關(guān)鍵詞搜索黃連的活性成分。按口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18進(jìn)一步篩選黃連的主要活性成分。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得黃連所有蛋白靶點(diǎn)，借助Perl語(yǔ)言獲得黃連主要活性成分相對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)、Perl語(yǔ)言將靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)化成基因名。

1.2 藥物和疾病交集靶點(diǎn)篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）和人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中以“anxiety disorder”為關(guān)鍵詞搜索獲取疾病相關(guān)基因。利用R軟件篩選出疾病基因與藥物靶基因的共同交集，繪制韋恩圖。

1.3 “黃連-活性成分-靶點(diǎn)基因-焦慮”網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/cgi/input.pl）輸入藥物靶點(diǎn)基因與疾病基因的交集，定義物種為“Homo sapien”，構(gòu)建黃連治療焦慮癥的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。最低互動(dòng)評(píng)分設(shè)定為0.4，顯示設(shè)置隱藏游離點(diǎn)，其余保持默認(rèn)值，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。前30名蛋白及節(jié)點(diǎn)連接數(shù)量用柱狀圖表示。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO（gene ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析用R軟件載入Bioconductor數(shù)據(jù)包及相關(guān)分析所用數(shù)據(jù)包，以pvaluecutoff=0.05，qvaluecutoff=0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃連活性成分及靶蛋白基因篩選結(jié)果通過(guò)挖掘共得到黃連主要活性成分14種。去除不存在對(duì)應(yīng)基因和重復(fù)存在的靶點(diǎn)，最終獲取黃連主要活性成分作用靶點(diǎn)84個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 黃連有效活性成分

2.2 韋恩圖利用Genecard疾病數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得焦慮相關(guān)疾病靶點(diǎn)信息，將其與黃連的主要活性成分靶點(diǎn)取交集，再利用R軟件繪制韋恩圖。藍(lán)色圓圈代表疾病相關(guān)靶點(diǎn)5311個(gè)，紅色圓圈代表黃連主要活性成分靶點(diǎn)84個(gè)，2個(gè)圓圈相交部分代表黃連和焦慮的67個(gè)共同靶點(diǎn)，為黃連抗焦慮的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 黃連有效成分與作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “黃連-活性成分-靶點(diǎn)基因-焦慮”網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“黃連-活性成分-靶點(diǎn)基因-焦慮”網(wǎng)絡(luò)，其中紅色圓圈代表藥物黃連，藍(lán)色圓圈代表疾病焦慮癥，綠色方塊為黃連治療焦慮癥的有效活性成分12個(gè)節(jié)點(diǎn)，黃色方塊代表相關(guān)靶點(diǎn)基因67個(gè)節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖2。由圖可知，黃連抗焦慮具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，可以看出核受體輔活化子2（NCOA2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1)、PRSS1、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1（PTGS1）基因靶點(diǎn)與黃連活性成分聯(lián)系最密切。

圖2 黃連-活性成分-靶點(diǎn)基因-焦慮網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，為了網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)潔有效，關(guān)聯(lián)評(píng)分設(shè)定為0.4，顯示隱藏游離蛋白靶點(diǎn)，其余保持默認(rèn)值，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共64個(gè)節(jié)點(diǎn)，374條連線，節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示各作用靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)，兩靶點(diǎn)間的連線越多，表示兩者關(guān)系越密切。節(jié)點(diǎn)發(fā)出的邊越多表示其越可能成為核心靶點(diǎn)。用柱狀圖表示其中關(guān)聯(lián)度最高的前30個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3—4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白關(guān)聯(lián)度排名前30位節(jié)點(diǎn)度值柱狀圖

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析GO和KEGG富集分析從基因功能和通路兩個(gè)方面解讀差異基因的生物學(xué)功能，GO富集分析涵蓋細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過(guò)程（biological process）3部分。以p=0.05，q=0.05為篩選條件，得到相關(guān)條目共840條，生物過(guò)程721條，細(xì)胞組分36條、分子功能83條，取3部分中富集程度前10位基因功能繪制成圖。KEGG通路富集分析以p=0.05，q=0.05為篩選條件，得到相關(guān)條目78條，取富集程度前20位信號(hào)通路繪制成圖。見(jiàn)圖5—9。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

圖7 KEGG功能富集分析柱狀圖

圖8 KEGG功能富集分析氣泡圖

圖9 AGE-RAGE信號(hào)通路

3 討論

焦慮癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”“驚悸”“不寐”“百合病”等范疇。病因以情志刺激為主，病位在心，與肝膽脾腎相關(guān)。肝氣郁結(jié)，肝郁化火，灼液成痰，痰熱互結(jié)，上擾心神而致焦慮煩躁。《醫(yī)宗金鑒》中說(shuō)：“心靜則藏神，若七情所傷，則心不得靜，而神躁不寧也?！狈麨槊瘢?］認(rèn)為痰熱內(nèi)擾是焦慮癥最常見(jiàn)的病機(jī)，以黃連溫膽湯治療焦慮癥效果顯著，其中黃連作為君藥起清心除煩之效。交泰丸由黃連、肉桂組成，交泰丸聯(lián)合烏靈膠囊可降低失眠伴焦慮患者的焦慮自評(píng)量表（self-rating anxiety scale，SAS)評(píng)分［5］，效果優(yōu)于艾司唑侖。黃連阿膠湯出自《傷寒論》，方用黃連瀉心火，使心氣下交于腎，其減輕焦慮的效果較西藥更明顯，且不良反應(yīng)?。?］。

黃連的主要成分有生物堿類、黃酮醇類、微量元素等［7］。生物堿類中的黃連堿［7-8］、黃酮醇類中的槲皮素［9］已被證明可通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)起抗焦慮作用。此外，本研究顯示黃連的其他有效成分如小檗堿、巴馬汀、黃連苷、小檗浸堿等靶點(diǎn)與焦慮的靶點(diǎn)對(duì)接數(shù)目較多，也具有抗焦慮作用。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，黃連抗焦慮的作用機(jī)制多樣，黃連作用靶點(diǎn)和焦慮癥靶點(diǎn)之間相互影響、關(guān)系復(fù)雜，主要有以下幾類：1）炎癥相關(guān)蛋白：白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、原癌基因（Fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）、C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）；2）性激素相關(guān)蛋白：雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、AR、雌激素受體2（estrogen receptor 2，ESR2）；3）胰島素相關(guān)蛋白：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)；4）脂類代謝相關(guān)蛋白：PPARA、窖蛋白-1（caveolin-1，CAV1）?？梢酝茰y(cè)黃連抗焦慮可能與調(diào)控炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)性激素水平、調(diào)節(jié)胰島素水平、脂類代謝等相關(guān)?，F(xiàn)代研究提示焦慮與免疫系統(tǒng)［10］、內(nèi)分泌系統(tǒng)［11］相互影響，表現(xiàn)為T細(xì)胞紊亂及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸、下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的紊亂，這與本研究結(jié)果一致。

GO富集分析顯示，黃連抗焦慮的生物過(guò)程主要涉及對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等；分子功能主要涉及核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等；細(xì)胞組成包括突觸當(dāng)中各部分、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膽堿能突觸等。KEGG富集分析結(jié)果表示，黃連抗焦慮與糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等78條通路有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是與炎癥相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路，NF-κB的激活誘發(fā)IL-6、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等大量促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，引起焦慮［12］。AGE-RAGE信號(hào)通路中，糖基化終末產(chǎn)物AGEs升高引起晚期糖基化終產(chǎn)物異常高表達(dá)并與晚期糖基化終產(chǎn)物結(jié)合后激活p38大鼠肉瘤（rat sarcoma，ras）蛋白及絲裂原化蛋白激酶途徑，上調(diào)并激活NF-κB表達(dá)［13］?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒感染通路也包含NF-κB。TNF信號(hào)通路中TNF除了激活NF-κB外還通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致焦慮［14］。以此推斷，阻斷NF-κB通路可能成為研究黃連治療焦慮癥的新切入點(diǎn)。

綜上所述，黃連可通過(guò)多分子、多靶點(diǎn)、多途徑治療焦慮癥，其物質(zhì)基礎(chǔ)可能為小檗堿、槲皮素，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)控炎性因子表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫紊亂等。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得黃連抗焦慮的多個(gè)靶點(diǎn)及通路，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)黃連抗焦慮的某些作用靶點(diǎn)如CASP、MYC及信號(hào)通路如卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的相關(guān)文獻(xiàn)較少，本研究結(jié)果可為以后擴(kuò)展黃連抗焦慮研究提供思路。