胡愛玲，楊婉婷，馬利華

（徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221111）

植物酵素是以一些植物為主要原料，通過有益菌群進(jìn)行發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)品[1]，含有豐富的代謝產(chǎn)物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能成分，特別是富含小分子功能成分[2]，通過微生物的發(fā)酵，使這些成分的功效提高，并減小人體吸收過程中產(chǎn)生的副作用，促進(jìn)消化吸收，降低血脂，提高抗氧化性和免疫性[3-4]。包怡紅等[5]以藍(lán)靛果和米糠為主要原料，開發(fā)出一種新型復(fù)合酵素；夏國燈等[6]以玫瑰干花瓣為主要原料，使用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)獲得了酵素發(fā)酵最佳工藝條件。

α-淀粉酶可以促進(jìn)人體內(nèi)的淀粉及寡糖中的糖苷鍵水解，使淀粉分解為在體內(nèi)血液中易被人體利用的碳水化合物，如葡萄糖和麥芽糖等[7]。通過抑制淀粉酶活性可以降低人體對淀粉的吸收，延緩體內(nèi)的淀粉代謝，降低葡萄糖吸收，從而達(dá)到防治高血糖的目的[8]。服用抑制劑類藥物是目前治療糖尿病的首選方式，市面上化學(xué)類藥物容易引起脹氣、消化不良等副作用[9]，從天然物質(zhì)中提取抑制劑更具安全性，已有研究報(bào)道植物提取物中多酚類、多糖類[10]等物質(zhì)具有良好的α-淀粉酶抑制活性。孟愛蓮等[11]研究了苦筍殼不同提取物的抗氧化作用及其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)苦筍殼乙酸乙酯相的抗氧化能力大于正丁醇相和石油醚相，其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性最強(qiáng)。

燕麥為禾本科一年生草本植物，屬小雜糧。燕麥中含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化物等營養(yǎng)成分，是一種優(yōu)質(zhì)谷物[12]。近年來，由于燕麥等谷物食品對糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等具有潛在抑制作用，從谷物中發(fā)現(xiàn)的具有保健功效的生物活性成分已成為越來越多科研工作者的研究熱點(diǎn)。以燕麥為原料制作酵素亦有報(bào)道，如張?jiān)降萚13]研究了糖添加量對燕麥酵素發(fā)酵特性的影響，但有關(guān)燕麥酵素對α-淀粉酶抑制作用及燕麥酵素中營養(yǎng)素與抑制作用的相關(guān)性尚未見報(bào)道。

本文以燕麥為原料，經(jīng)過發(fā)芽處理后制作酵素，考察了燕麥發(fā)酵過程中β-葡聚糖、總酚等的含量變化，以及燕麥酵素對α-淀粉酶活性的抑制作用，以期為燕麥產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

燕麥：本地大潤發(fā)超市購買。發(fā)酵菌粉：昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司。

剛果紅、聯(lián)苯三酚、茚三酮、硝酸鋁、α-淀粉酶、β-葡聚糖、亮氨酸、蘆丁、3,5-二硝基水楊酸：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚：美國Sigma試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TDZ4臺式低速離心機(jī)：濟(jì)南東儀實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；7230G型可見分光光度計(jì)：常州三豐儀器科技有限公司；DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；ZNCL-BS恒溫磁力加熱攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；TG-16W-I高速離心機(jī)：濟(jì)南鑫宇鑫醫(yī)療設(shè)備有限公司；DHG-9053鼓風(fēng)干燥箱：上海善志儀器設(shè)備有限公司；FSJ-A05N6磨粉機(jī)：小熊電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 燕麥樣品的處理

選用成熟且顆粒飽滿的優(yōu)質(zhì)燕麥，浸入濃度為1%的次氯酸鈉中消毒殺菌20 min，再清洗干凈，浸入蒸餾水泡16 h，以兩層充分被去離子水浸濕的濾紙為發(fā)芽介質(zhì)，將浸泡清洗好的燕麥粒用干凈的紗布擠干水分后平鋪在發(fā)芽床上，放入托盤，放進(jìn)20℃恒溫培養(yǎng)箱中，每12 h進(jìn)行換水通風(fēng)，恒溫箱內(nèi)相對濕度保持在95%以上。待燕麥發(fā)芽至0.5～1.0 cm后，干燥，磨粉，即為樣品，備用。

1.2.2 燕麥酵素的制備

分別取發(fā)芽燕麥粉100 g放入燒杯中，加入適量水，混合均勻后加入1 g發(fā)酵菌粉，30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵168 h，發(fā)酵結(jié)束后過濾，取上清液備用。

1.2.3 β-葡聚糖含量的測定

參考剛果紅顯色法[14]測定燕麥酵素中β-葡聚糖含量。以β-葡聚糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.003 6x+0.129，R2=0.993 5。

式中：C為燕麥酵素β-葡聚糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N為燕麥酵素上清液稀釋的倍數(shù)；V為燕麥酵素提取樣液的總體積，mL；m為燕麥原料的質(zhì)量，g。

1.2.4 總酚含量的測定

采用福林酚比色法[15]測定燕麥酵素中總酚含量。以聯(lián)苯三酚質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.960 8x+0.012 41，R2=0.994 9。

式中：C為酵素液中提取總酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為酵素上清液稀釋的倍數(shù)；V為燕麥酵素提取樣液的總體積，mL；m為燕麥原料的總質(zhì)量，g。

1.2.5 游離氨基酸含量的測定

采用茚三酮比色法[16]測定燕麥酵素中游離氨基酸含量。以亮氨酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=2.713 7x-0.016 3，R2=0.993 4。

式中：C為酵素液中提取的游離氨基酸質(zhì)量濃度，mg/mL；N為酵素上清液稀釋的倍數(shù)；V為燕麥酵素提取樣液的總體積，mL；m為燕麥原料總質(zhì)量，g。

1.2.6 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁顯色法[17]測定燕麥酵素中總黃酮含量。蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.198x+0.005，R2=0.991 2。

式中：C為酵素液中提取總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為酵素上清液稀釋的倍數(shù)；V為燕麥酵素提取樣液的總體積，mL；m為燕麥原料總質(zhì)量，g。

1.2.7 燕麥酵素對α-淀粉酶的抑制率測定及抑制動力學(xué)分析

取α-淀粉酶溶液0.3 mL和1 mL酵素上清液，混勻，加0.4 mL 1%淀粉溶液，37℃反應(yīng)15 min，加入3,5-二硝基水楊酸0.5 mL，搖勻混合后于100℃下反應(yīng)5 min，冷卻，用水定容至25 mL。用去離子水代替燕麥酵素溶液作空白組，去離子水取代α-淀粉酶作對照組，去離子水取代燕麥酵素溶液、α-淀粉酶作空白對照，在540 nm處測其吸光度，計(jì)算抑制率[18]。

式中：A0為去離子水代替燕麥酵素溶液在540 nm處的吸光值；A1為去離子水代替酵素溶液和α-淀粉酶在540 nm處的吸光值；A2為酵素溶液在540 nm處的吸光值；A3為去離子水代替α-淀粉酶在540 nm處的吸光值。

半數(shù)抑制率IC50定義為抑制率為50%時的樣品濃度。IC50越小，說明該物質(zhì)抑制效果越明顯。

米氏方程是指在理想狀態(tài)下，酶促反應(yīng)的起始速度隨底物濃度變化而變化的速度方程。雙倒數(shù)方程如下：

酶促反應(yīng)中的米氏常數(shù)（Km）和最大酶促反應(yīng)速度（Vm）值通常都是采用米氏方程的轉(zhuǎn)換形式求出。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)和Hanes作圖法即可以測定計(jì)算得到Km和Vm。

在其他反應(yīng)條件一定的情況下，改變底物濃度（[S]），添加或不添加燕麥酵素的條件下，測定酶促反應(yīng)速度（V），以1/V對1/[S]作圖，得到Lineweaver-Burk曲線，確定抑制類型[19]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件作圖，并應(yīng)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥發(fā)酵過程中β-葡聚糖含量和游離氨基酸含量的變化

燕麥富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、酚類化合物、維生素和礦物質(zhì)，以及β-葡聚糖、總黃酮、生物堿等對人體有利的活性成分，其中β-葡聚糖是燕麥可溶性纖維的主要成分之一，它被公認(rèn)為燕麥中的主要有效活性成分，主要作用是降低膽固醇和抗糖尿病[20]。由圖1可見：發(fā)酵過程中，燕麥酵素中β-葡聚糖及游離氨基酸含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵96 h時含量最高，與發(fā)酵前相比，β-葡聚糖含量增加了1.8%，游離氨基酸含量增加了25.46%。這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的生長繁殖釋放了燕麥細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)，使其溶出增多，另一方面微生物代謝也導(dǎo)致其含量有所上升，這與史小萌等[21]的研究結(jié)果一致。

圖1 發(fā)酵時間對燕麥酵素β-葡聚糖、游離氨基酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the contents ofβ-glucan and free amino acid in oat Jiaosu

2.2 燕麥發(fā)酵過程中總酚含量和總黃酮含量的變化

燕麥中的酚類化合物可以抵御各種病原體的攻擊，預(yù)防癌癥、腦卒中和冠心病等疾病。由圖2可見：燕麥酵素發(fā)酵過程中，其總酚和總黃酮含量于發(fā)酵96 h達(dá)到最高，與發(fā)酵前相比分別增加了40.31%和47.62%。這是由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶系可以破壞細(xì)胞壁纖維成分的致密結(jié)構(gòu)，或者破壞多酚、黃酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)之間交聯(lián)的共價鍵，促進(jìn)這類物質(zhì)的釋放和轉(zhuǎn)化，從而增加了酵素中游離酚、酮類物質(zhì)的濃度。這與丁玉鋒等[23]的研究結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵時間對燕麥酵素總酚、總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the contents of total phenols and total flavonoids in oat Jiaosu

2.3 燕麥發(fā)酵過程對α-淀粉酶活性抑制效果分析

2.3.1 燕麥發(fā)酵過程對α-淀粉酶活性抑制率的影響

α-淀粉酶是參與小腸碳水化合物消化降解的關(guān)鍵酶，抑制其活性就可減緩淀粉分解，從而降低糖尿病患者的餐后血糖水平[24]。

由圖3可見：燕麥酵素在發(fā)酵過程中對α-淀粉酶的抑制于發(fā)酵96 h達(dá)到最高，抑制率為72.27%，比發(fā)酵前提高了22.58個百分點(diǎn)。

圖3 燕麥發(fā)酵時間對α-淀粉酶活性抑制率的影響Fig.3 Effects of fermentation time on inhibition rate ofα-amylase activity in oat Jiaosu

為研究不同燕麥酵素濃度對α-淀粉酶的抑制效果，分別在發(fā)酵96 h的燕麥酵素中加入蒸餾水稀釋，制成不同質(zhì)量濃度的酵素，測定其對α-淀粉酶活性的抑制率，以半數(shù)抑制率IC50衡量其對α-淀粉酶活性的抑制效果。以酵素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，α-淀粉酶活性抑制率為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：燕麥酵素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與α-淀粉酶活性抑制率呈線性正相關(guān)，所得到的線性方程式為：y=1.701 4x-3.261 8，R2=0.990 6，存在很好的線性關(guān)系；經(jīng)計(jì)算得出IC50=30.96 g/L。這與李云姣等[25]的研究結(jié)論相似。

圖4 燕麥酵素質(zhì)量濃度與α-淀粉酶活性抑制效果的相關(guān)性Fig.4 Correlation between oat Jiaosu cocentration and inhibition ofα-amylase activity

2.3.2 燕麥酵素對α-淀粉酶活性的抑制動力學(xué)分析

以底物濃度倒數(shù)值為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速率倒數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制不同燕麥酵素濃度下的雙倒數(shù)曲線圖，可以得到4種類型：

①競爭性抑制：Km值增大，Vm值不變。

酶抑制劑和底物在結(jié)構(gòu)上有相似之處，當(dāng)酶抑制劑與酶結(jié)合以后，阻斷了底物與酶的結(jié)合，降低了酶與底物的親和能力，酶反應(yīng)速率減慢，增大抑制劑的濃度即可增強(qiáng)抑制強(qiáng)度。

②非競爭性抑制：Km值不變，Vm值減小。

酶抑制劑會與游離的酶發(fā)生結(jié)合作用，但不影響酶對底物的反應(yīng)作用。因酶與底物作用同時可與抑制劑結(jié)合，導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而降低酶活性。

③反競爭性抑制：Km值減小，Vm值減小。

酶抑制劑能與酶-底物復(fù)合物作用，不能同游離的酶作用，反應(yīng)最大速率小于未添加抑制劑的反應(yīng)最大速率。

④混合型抑制：Vm值減小，Km值增大；Vm值減小，Km值減小。

該類型是非競爭性抑制與另外兩種抑制類型的混合，作用機(jī)理與非競爭性抑制大體相似，但因酶與底物種類或底物結(jié)合次序不同，因而反應(yīng)常數(shù)不同。競爭性與反競爭性抑制兩者之間不屬于混合型[26]。

由圖5可見：未添加燕麥酵素樣品的反應(yīng)方程為y=0.09x+18.319，R2=0.994 1，Vm=0.054 5 mg/（mL·min），Km=0.004 9 mg/mL。33.91g/L低濃度燕麥酵素樣品的反應(yīng)方程為y=0.0901x+25.346，R2=0.995，V’m=0.039 4 mg/（mL·min），K’m=0.003 6 mg/mL。100 g/L高濃度燕麥酵素樣品的反應(yīng)方程為y=0.146 9x+18.418，R2=0.996 8，V’m’=0.0543 mg（/mL·min），K’m’=0.008 mg/mL。

圖5 燕麥酵素對α-淀粉酶活性抑制的動力學(xué)分析Fig.5 Kinetics of oat Jiaosu on inhibition of α-amylase activity

加入低濃度燕麥酵素后，Vm值變小，同時Km值也變小，因此低濃度燕麥酵素對α-淀粉酶活性的抑制為反競爭性和非競爭性特性混合的抑制類型；加入高濃度燕麥酵素后，Vm值變小，同時Km值變大，因此高濃度燕麥酵素對α-淀粉酶活性的抑制為反競爭性和非競爭性特性混合的抑制類型，這與潘玥等[27]的研究結(jié)果一致。

2.4 燕麥酵素中β-葡聚糖、游離氨基酸含量與α-淀粉酶活性抑制效果的相關(guān)性

以不同發(fā)酵時間的燕麥酵素中β-葡聚糖、游離氨基酸含量為橫坐標(biāo)，α-淀粉酶活性抑制率為縱坐標(biāo)擬合曲線，考察β-葡聚糖、游離氨基酸含量與α-淀粉酶活性抑制率間是否存在相關(guān)性。

圖6 燕麥酵素中β-葡聚糖、游離氨基酸含量與α-淀粉酶活性抑制率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between the content ofβ-glucan,free amino acid in oat Jiaosu andα-amylase inhibition rate

由圖6可以看出：燕麥酵素中的β-葡聚糖含量與α-淀粉酶活性抑制率的線性方程為y=138.92x-1 734.2，R2=0.4825，游離氨基酸含量對α-淀粉酶活性抑制率的線性方程為y=4.093 3x+12.428，R2=0.491 6，說明在發(fā)酵過程中隨著β-葡聚糖、游離氨基酸含量的增加，其對α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)增加趨勢，均存在著一定的正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，決定系數(shù)均小于0.5。

2.5 燕麥酵素中總酚含量、總黃酮含量與α-淀粉酶活性抑制效果的相關(guān)性

以不同發(fā)酵時間的燕麥酵素中總酚、總黃酮含量為橫坐標(biāo)，α-淀粉酶活性抑制率為縱坐標(biāo)擬合曲線，考察總酚、總黃酮含量與α-淀粉酶活性抑制率之間是否存在相關(guān)性。

圖7 燕麥酵素中總酚、總黃酮含量與α-淀粉酶活性抑制率的相關(guān)性Fig.7 Correlation between the content of total phenols and total flavonoids in oat Jiaosu andα-amylase inhibition rate

由圖7可見：燕麥酵素中的總酚含量與α-淀粉酶活性抑制率的線性方程為y=32.151x+11.068，R2=0.857 8，總黃酮含量與α-淀粉酶活性抑制率的線性方程為y=40.557x+9.004 5，R2=0.918 2，說明在發(fā)酵過程中隨著總酚、總黃酮含量的增加，其對α-淀粉酶活性的抑制率亦增強(qiáng)，均存在著顯著正相關(guān)（P＜0.05），決定系數(shù)分別達(dá)到0.857 8和0.918 2。

3 結(jié)論

燕麥酵素中β-葡聚糖、游離氨基酸、總酚、總黃酮含量均隨著發(fā)酵時間的延長而呈現(xiàn)一定的增加趨勢，在發(fā)酵96 h達(dá)到最高，比發(fā)酵前分別提高了1.8%、25.46%、40.31%、47.62%；燕麥酵素對α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，最高抑制率為72.27%，IC50=30.96 g/L；動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，無論是高濃度還是低濃度的燕麥酵素，其對α-淀粉酶活性的抑制類型都是混合型抑制。通過相關(guān)性分析可以看出：燕麥發(fā)酵過程中，隨著總酚、總黃酮、β-葡聚糖、游離氨基酸含量的增加，其對α-淀粉酶活性的抑制作用增強(qiáng)，總酚含量及總黃酮含量均與α-淀粉酶活性的抑制率存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），而β-葡聚糖、游離氨基酸含量均與α-淀粉酶活性的抑制率無明顯相關(guān)性，說明燕麥酵素對α-淀粉酶活性的抑制作用主要是與燕麥酵素中的總酚和總黃酮含量有著密切關(guān)系。綜上可見，燕麥酵素是一種開發(fā)前景廣闊、營養(yǎng)豐富、具有較好的營養(yǎng)性和抗氧化性的產(chǎn)品。