肖萌 蔣瑩 崔逸璇 Sadaf Riaz Maurycy Daroch

北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 第59卷 第1期 2023年1月

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 59, No. 1 (Jan. 2023)

10.13209/j.0479-8023.2022.100

深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(GXWD20201231165807007-20200806170221001)資助

2022-02-10;

2022-02-24

重組大腸桿菌利用醋酸及乳酸為碳源合成 PHB

肖萌 蔣瑩 崔逸璇 Sadaf Riaz Maurycy Daroch?

北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055; ? 通信作者, E-mail: m.daroch@pkusz.edu.cn

以廉價(jià)的工業(yè)副產(chǎn)物醋酸及乳酸為碳源, 對(duì)產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng), 考察醋酸及乳酸的添加對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)及 PHB 產(chǎn)量的影響。將來(lái)自的 PHB 合成操縱子 phaCAB 基因簇克隆至 pBAD 載體, 得到產(chǎn) PHB 菌株, 以阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑, 在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。分別使用 LB 及 M9 培養(yǎng)基, 對(duì)重組菌株進(jìn)行培養(yǎng), 研究其生長(zhǎng)速度及 PHB 產(chǎn)量, 探索產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌最適培養(yǎng)基。以添加 0.04g/L 乳酸、1.2g/L 乳酸、0.02g/L 醋酸、0.6g/L 醋酸、0.04g/L乳酸+0.02g/L 醋酸、1.2g/L 乳酸+0.4g/L 醋酸的 M9 培養(yǎng)基(均含 2g/L 葡萄糖)為實(shí)驗(yàn)組, 以 M9 培養(yǎng)基(含 2g/L 葡萄糖)為對(duì)照組, 考察醋酸及乳酸的添加對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)及 PHB 產(chǎn)量的影響。分別取第 6, 12, 24和 36 小時(shí)的培養(yǎng)液, 分析其葡萄糖、醋酸及乳酸含量的變化。結(jié)果表明, 低氮型 M9 培養(yǎng)基更適合產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌在低糖培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)。在葡萄糖消耗殆盡后, 大腸桿菌能夠以醋酸及乳酸為碳源進(jìn)行代謝, 因此在培養(yǎng)基中添加一定濃度的醋酸及乳酸能夠有效地提高重組菌株產(chǎn) PHB 能力, 在乳酸添加量為 1.2 g/L 時(shí), PHB 產(chǎn)量達(dá)到最高(1.43 g/L), 比對(duì)照組提高 78%。

PHB; 乳酸; 醋酸; 大腸桿菌

聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)是一種常見(jiàn)的生物聚合物, 由于具有疏水性、完全的生物降解性和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn), 廣泛用做傳統(tǒng)塑料的替代品[1]。自然界中的 PHB 往往是微生物在碳源豐富且氮、硫、磷等其他營(yíng)養(yǎng)元素缺乏時(shí)積累的[2]。是目前研究最深入的高 PHB 產(chǎn)量微生物[3], 其野生型菌株的 PHB 產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞干重的 78%, 來(lái)源于的 PHB 合成基因 phaCAB 廣泛用于重組大腸桿菌菌株中生產(chǎn)PHB。Napathorn 等[4]的研究表明, 通過(guò)菌株優(yōu)化、基因工程及發(fā)酵條件優(yōu)化等手段, 大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)PHB 的產(chǎn)量可高達(dá)大腸桿菌細(xì)胞干重的 93.3%。與野生型 PHB 生產(chǎn)菌株相比, 重組大腸桿菌產(chǎn) PHB具有許多優(yōu)勢(shì), 如大腸桿菌培養(yǎng)周期短, 可利用的碳源廣泛, PHB 產(chǎn)量相對(duì)較高, 并且由于缺乏解聚酶而在發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)降解 PHB[5]。

重組大腸桿菌生產(chǎn) PHB 往往以葡萄糖為碳源, 具有一定的經(jīng)濟(jì)局限性, 因此選用廉價(jià)的碳源進(jìn)行PHB 的生物合成可有效地降低成本。醋酸是廉價(jià)易得的工業(yè)副產(chǎn)物, 在許多工業(yè)過(guò)程中都有生成(如石油副產(chǎn)物提取和木質(zhì)纖維素的水解工藝等[6]), 目前醋酸的市場(chǎng)價(jià)格遠(yuǎn)低于葡萄糖[7]。在低葡萄糖條件下, 大腸桿菌內(nèi)的乙酰輔酶 A 合成酶()相關(guān)基因代謝調(diào)控能幫助大腸桿菌對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中的醋酸進(jìn)行利用, 生成大腸桿菌代謝的重要前體物質(zhì)乙酰輔酶 A[8]。乳酸通常是利用工業(yè)、農(nóng)業(yè)及食品廢棄物進(jìn)行生物發(fā)酵而得, 其生產(chǎn)成本低且來(lái)源廣泛[9]。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中乳酸含量較高時(shí), 細(xì)菌體內(nèi)的 D-乳酸脫氫酶()可發(fā)生逆催化反應(yīng), 催化乳酸生成丙酮酸, 參與細(xì)菌代謝[10]。因此, 使用醋酸及乳酸作為產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的碳源, 是低成本生產(chǎn)PHB 的有效方法。此外, 傳統(tǒng)重組大腸桿菌生產(chǎn)PHB 的研究常使用 LB 培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)。LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨組分富含大量氮源, 且 LB 培養(yǎng)基不直接含葡萄糖, 不利于 PHB 的合成。這是由于在低氮條件下, 大腸桿菌的 TCA 循環(huán)會(huì)被抑制, 從而使得乙酰輔酶 A 增加[11], 乙酰輔酶 A 是大腸桿菌合成 PHB 的唯一前體。高含量的乙酰輔酶 A 有利于 PHB 的產(chǎn)生, 因此選擇低氮含量的培養(yǎng)基可以提高重組大腸桿菌的產(chǎn) PHB 能力。LB 培養(yǎng)基中的主要碳源供體為酵母提取物, 其碳源通常以可分解代謝的氨基酸的形式存在[12], 與氨基酸相比, 醋酸及乳酸更接近大腸桿菌合成 PHB 的代謝通路, 理論上以醋酸及乳酸為碳源更利于產(chǎn)物 PHB 的合成。

本文將來(lái)自的 PHB 合成操縱子 phaCAB 基因簇克隆至 pBAD 載體, 以廉價(jià)的阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑, 在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá), 探究不同培養(yǎng)基對(duì)重組菌株產(chǎn) PHB 的影響, 同時(shí)探究重組菌株在低糖且含不同濃度乳酸及醋酸條件下的生長(zhǎng)情況及 PHB 產(chǎn)量, 為低成本、綠色生產(chǎn) PHB的工程化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)菌株和質(zhì)粒: 克隆菌株采用DH5α, 表達(dá)菌株采用BL21(DE3), 采用非連接式克隆 pBAD LIC cloning vector (8A)載體, 來(lái)自的 PHB 合成操縱子phaCAB 基因簇經(jīng)密碼子優(yōu)化后, 由華大基因公司合成。

2)主要試劑: 限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于Thermo 公司, pfu 高保聚合酶、Taq DNA 聚合酶、非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于 Vazyme公司。

3)培養(yǎng)基: LB 培養(yǎng)基的配制參照 Lin 等[13]的方法。M9 培養(yǎng)基粉末購(gòu)于山東拓普生物工程有限公司。終濃度為 2g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基: 配 1g/的葡萄糖母液進(jìn)行過(guò)濾滅菌后, 以 1:500 的體積比添加至經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的構(gòu)建

圖 1 展示預(yù)期的重組大腸桿菌代謝路線。本研究使用的菌株及質(zhì)粒及引物列于表 1。將 pBAD 質(zhì)粒通過(guò)內(nèi)切酶進(jìn)行酶切, 得到線性質(zhì)粒。使用帶同源臂的引物 phaCAB_F 及 phaCAB_R 對(duì) pha CAB 操縱子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 通過(guò)快速克隆試劑盒, 將所得帶同源臂的 phaCAB 基因簇(3693bp)與線性pBAD 載體進(jìn)行連接, 然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài), 進(jìn)行重組質(zhì)粒復(fù)制。質(zhì)粒測(cè)序由廣州艾基生物公司完成。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 得到重組菌株。圖 2 為質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

D-LDH: D-乳酸脫氫酶; AcsA:乙酰輔酶 A 合成酶; phaA: β-酮硫裂解酶; phaB:乙?；阴］o酶 A 還原酶; phaC:PHB 聚合酶

1.2.2 重組菌株__的蛋白表達(dá)

將重組菌株在 LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng), 然后以 2% (體積比)的接種量接種于含 50ng/μL 氨芐青霉素抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。37°C 和 200rpm 條件下培養(yǎng)至 OD600約為 0.4～0.6, 加入終濃度為 1% (質(zhì)量體積比)的阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑, 于 30°C 振蕩表達(dá) 12 小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后, 取 20mL 培養(yǎng)液, 于 4°C 和 10000r/min條件下離心 15 分鐘, 收集誘導(dǎo)菌體, 用 2mL 預(yù)冷的 20mM Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)重懸收集菌體, 冰浴中進(jìn)行超聲破碎處理(5min/樣品, 每個(gè)循環(huán)運(yùn)行 5 秒后暫停 9 秒)。破碎完成后, 在 4°C 和 12000r/ min 條件下離心 20 分鐘, 獲得含 phaC, phaA 及phaB 蛋白的上清粗蛋白酶液。使用所得上清粗酶液進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。由于 SDS-PAGE 不能清楚地確定蛋白的表達(dá)情況, 將 SDS-PAGE 凝膠切下, 送樣至華大基因公司進(jìn)行蛋白 Q-E 質(zhì)譜鑒定。

表1 本研究所用質(zhì)粒、菌株及引物

*表示終止密碼子

1.2.3 PHB 的胞內(nèi)形態(tài)檢測(cè)

取 0.5mL 過(guò)夜的表達(dá)重組菌液, 離心分離后收集菌體, 采用 PBS 緩沖液(pH=7.0)懸浮菌體, 然后加入電鏡固定液, 將樣品送至中科百測(cè)公司進(jìn)行透射電鏡檢測(cè)。

1.2.4 重組菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化

將重組菌株在常規(guī) LB 培養(yǎng)基中于 37°C 和 200rpm 條件下過(guò)夜培養(yǎng), 得到預(yù)培養(yǎng)液。分別采用 LB 培養(yǎng)基與 M9 液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中均含終濃度為 2g/L 的葡萄糖)對(duì)重組菌株進(jìn)行培養(yǎng)。以 2%的接種量, 將預(yù)培養(yǎng)液分別接種于含兩種 50mL 液體培養(yǎng)基的 250mL 錐形瓶中, 在37°C 和 200rpm 條件下培養(yǎng) 6 小時(shí)后, 培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)為 30°C, 并加入終濃度為 1%的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在此期間, 分別取培養(yǎng) 6, 12, 24 和 36 小時(shí)的菌液測(cè)定 OD600 值, 并對(duì)兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 小時(shí)后的重組菌株分別進(jìn)行 PHB 含量檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置 3 組平行樣品。

1.2.5 添加醋酸和乳酸的影響

分別在含 2g/L 葡萄糖的 M9 培養(yǎng)基中加入不同起始濃度的乳酸、醋酸及二者的組合, 實(shí)驗(yàn)組設(shè)置為 0.04g/L 乳酸(LL)、1.2g/L 乳酸(HL)、0.02g/L 醋酸(LA)、0.6g/L 醋酸(HA)、0.04g/L 乳酸+0.02g/L醋酸(LL+LA)及1.2g/L乳酸+0.4g/L醋酸(HL+HA), 以含 2g/L 葡萄糖的常規(guī) M9 培養(yǎng)基為對(duì)照組。按照1.2.4 節(jié)所述方式, 對(duì)重組菌株 B 進(jìn)行培養(yǎng), 取培養(yǎng)6, 12, 24 和 36 小時(shí)的菌液進(jìn)行 OD600值的測(cè)定, 并測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸及醋酸的含量, 最終對(duì)培養(yǎng) 36 小時(shí)后的重組菌株 PHB 含量及產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置 3 組平行樣品。

1.2.6 重組菌株 PHB 的產(chǎn)量測(cè)定

通過(guò) GC-MS 對(duì) PHB 進(jìn)行定量分析[14–15], 以PHB 質(zhì)量/細(xì)胞干重作為 PHB 的含量, 以 1L 重組菌株培養(yǎng)液所含總 PHB 質(zhì)量作為產(chǎn)量。在 GC-MS 檢測(cè)之前, 需要對(duì) PHB 進(jìn)行衍生化反應(yīng)[16], 操作步驟如下: 取表達(dá)完成的菌液進(jìn)行離心分離后, 收集菌體, 冷凍干燥 48 小時(shí), 稱取25mg 干燥菌體, 置于高壓反應(yīng)管中, 依次加入 2mL 氯仿、2mL 和 7%甲醇–硫酸溶液及 200μL 的 3%甲醇–苯甲酸溶液, 在 105°C 條件下反應(yīng) 8 小時(shí), 期間每 2 小時(shí)取出, 均勻搖晃 30 秒。反應(yīng)完成后, 向反應(yīng)液中加入 2mL 去離子水, 充分振蕩搖勻。此過(guò)程中, 利用甲醇在氯仿與水中的溶解度不同, 將甲醇等雜質(zhì)萃取到水相中, 靜置 1 小時(shí)后, 上層為水相, 下層為氯仿層, 取下層進(jìn)行 GC-MS 檢測(cè)。PHB的 GC-MS 色譜測(cè)定條件如下: 采用安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀 8890-5977B; 采用安捷倫公司 HP-5MS (30m× 0.25mm×0.25μm)毛細(xì)色譜柱; 載氣為氦氣, 1mL/ min 恒流模式; 進(jìn)樣口溫度為 250°C; 采用不分流模式。升溫程序: 初始溫度為 80°C, 保持 1 分鐘, 以10°C/min 的速率升溫至 140°C, 保持 2 分鐘, 再以4°C/min 的速率升溫至 250°C, 保持 8 分鐘。

1.2.7 葡萄糖、乳酸及醋酸的檢測(cè)

重組菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的葡萄糖消耗量、乳酸及醋酸的變化量由 HPLC 進(jìn)行檢測(cè)[17–18]。取 1mL 重組菌株培養(yǎng)液, 離心分離后取上清液, 過(guò)濾后進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)。高效液相色譜測(cè)定條件如下: 采用安捷倫高效液相色譜儀 1271, 安捷倫 Hi-plex H (4.6×250 mm)色譜柱, 柱溫 60°C, 流動(dòng)相為 5mM 硫酸溶液, 流速 0.6mL/min。葡萄糖采用 RID 檢測(cè)器檢測(cè), 醋酸及乳酸采用 DAD 檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm。

2 結(jié)果

2.1 重組菌株 BL21_pBAD_phaCAB 的蛋白表達(dá)

重組菌株在 1%阿拉伯糖誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)情況如圖 3 所示。根據(jù)預(yù)測(cè), 重組蛋白的 phaC 理論大小為 60kDa, phaA 理論大小為 40kDa, phaB 理論大小為 26kDa。通過(guò) SDS-PAGE 結(jié)果可以看出, 與未誘導(dǎo)表達(dá)的重組細(xì)胞上清粗酶液相比, 誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞上清粗酶液擁有一個(gè)明顯的 phaB 歸屬條帶, 但 phaC 和 phaA 的表達(dá)情況難以通過(guò) SDS-PAGE 結(jié)果判斷。從理論上講, phaCAB 操縱子均受同一啟動(dòng)子的調(diào)控, 且其基因片段排列順序依次為 phaC, phaA 和 phaB, 由于 phaB 處于下游, 一定是在 phaC和 phaA 之后表達(dá)。因此, 猜測(cè)細(xì)胞上清粗酶液中存在 phaC 和 phaA 目的蛋白, 但濃度較低, 無(wú)法從SDS-PAGE 結(jié)果中看出。如圖 3 所示, 將猜測(cè)歸屬于 phaC, phaA 和 phaB 的 SDS-PAGE 條帶(接近其大小范圍的條帶)分別切下后, 進(jìn)行蛋白質(zhì)譜 Q-E 鑒定。檢測(cè)結(jié)果(表 2)顯示, 對(duì)于 3 種目標(biāo)蛋白, 其蛋白覆蓋率分別為 phaC 15%, phaA 62%和 phaB 73%。且每一個(gè)所檢測(cè)樣品均能匹配到原始蛋白序列中的特有多肽片段。檢測(cè)結(jié)果清晰地表明, 3 種目的蛋白均成功表達(dá)。

M:蛋白標(biāo)準(zhǔn); 1:未誘導(dǎo)重組菌株破壁細(xì)胞上清; 2:未誘導(dǎo)重組菌株破壁細(xì)胞下沉; 3:誘導(dǎo)重組菌株破壁細(xì)胞上清; 4:誘導(dǎo)重組菌株破壁細(xì)胞下沉

2.2 重組菌株 BL21_pBAD_phaCAB 產(chǎn) PHB的透射電鏡分析

PHB 在大腸桿菌中的積累是以胞內(nèi)顆粒的形式存在的[19]。重組大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的透射電鏡結(jié)果如圖 4 所示。樣品采用包埋切片的方式進(jìn)行處理, 通過(guò)圖片可清晰看見(jiàn)重組大腸桿菌胞內(nèi)存在密集的球形顆粒, 該胞內(nèi)顆粒即為 PHB。這一結(jié)果證明, 重組蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了功能化。通過(guò)圖 4(a)可以看到, 重組菌株所產(chǎn) PHB 粒徑最大可達(dá) 200 nm, 整體而言, PHB 粒徑分布于 50～200nm 之間。根據(jù)圖 4(b)來(lái)看, PHB 顆粒主要以聚集而非分散的分布形式存在于大腸桿菌胞內(nèi), 占重組細(xì)胞橫切面面積的 30%以上。圖 4(c)和4(d)為野生型大腸桿菌 BL21 的細(xì)胞形態(tài), 可以清楚地看到細(xì)胞內(nèi)部無(wú)明顯聚集顆粒, 進(jìn)一步證明了重組菌株__的功能性。

表2 重組菌株BL21_pBAD_phaCAB誘導(dǎo)表達(dá)蛋白phaC, phaA和phaB的質(zhì)譜分析

說(shuō)明: 評(píng)分的計(jì)算公式為?10×Log, 其中是隨機(jī)事件的概率;r為參考蛋白質(zhì)質(zhì)量; 計(jì)算得出的 pI 值表示參考蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的理論值; 下劃線標(biāo)記的肽序列表示與參考蛋白質(zhì)為同源序列。

(a)～(b):重組菌株BL21_pBAD_phaCA的胞內(nèi)形態(tài); (c)～(d):野生型大腸桿菌菌株BL21的胞內(nèi)形態(tài)

2.3 培養(yǎng)基對(duì)重組菌株 BL21_pBAD_phaCAB生長(zhǎng)及 PHB 含量的影響

圖 5 比較重組菌株在 LB 和 M9 培養(yǎng)基中(均含2 g/L 葡萄糖)的生長(zhǎng)曲線及其 PHB 終含量。如圖5(a)所示, 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組菌株在 6～12小時(shí)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期, 能夠以較快的速度生長(zhǎng)至OD600 大于 1, 12 小時(shí)后細(xì)胞趨于穩(wěn)定生長(zhǎng), OD600值最終穩(wěn)定在 1.1 左右。在 M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組菌株, 12 小時(shí)前的生長(zhǎng)速度與 LB 培養(yǎng)基中的細(xì)胞相當(dāng), 但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)約 18 小時(shí), 細(xì)胞 OD600 值能夠達(dá)到 2.6, 遠(yuǎn)大于 LB 培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度。如圖 5(b)所示, 以 LB 為培養(yǎng)基培養(yǎng)的重組菌株的 PHB 終產(chǎn)量為 11.3%, 遠(yuǎn)低于以 M9 為培養(yǎng)基的重組菌株 PHB 產(chǎn)量29.3%。

2.4 醋酸和乳酸對(duì)重組菌株 BL21_pBAD_phaCAB產(chǎn) PHB 的影響

圖 6 展示重組菌株在含不同起始濃度醋酸及乳酸的 M9 培養(yǎng)基(含 2g/L 葡萄糖)中的生長(zhǎng)曲線及 PHB 終含量。如圖 6(a)所示, 在高含量乳酸(HL)的培養(yǎng)基中, 重組菌株在前 20 小時(shí)的生長(zhǎng)速度比其他條件下更快; 在高起始乳酸及醋酸含量(HL+HA)的培養(yǎng)基中, 細(xì)胞能夠在 24 小時(shí)內(nèi)達(dá)到最高的穩(wěn)定 OD 值, 約為 3.3, 高于對(duì)照組的2.6; 在添加高濃度醋酸(HA)的實(shí)驗(yàn)組中, 細(xì)胞生長(zhǎng)速度及最高穩(wěn)定 OD 值均大于對(duì)照組。如圖 6(b)所示, 在高含量乳酸(HL)及高含量醋酸(HA)中生長(zhǎng)的重組細(xì)胞能夠獲得分別為 42%和 40.8%的 PHB 含量, 遠(yuǎn)高于對(duì)照組的 29.7%。然而, 生長(zhǎng)速度最快且終 OD 值最高的 HL+HA 實(shí)驗(yàn)組獲得較低的 PHB終含量, 僅為 29.9%。此外, 終 OD 值小于對(duì)照組的 LA 實(shí)驗(yàn)組獲得 29.4%的 PHB 終含量, 也是唯一一組 PHB 終含量小于對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)組。表 3 總結(jié)各種條件下的 PHB 終含量、產(chǎn)量及產(chǎn)率, 通過(guò)計(jì)算得出, 在 HL 條件下可獲得的 PHB 產(chǎn)量為1.43g/L, 即36 小時(shí)內(nèi)的產(chǎn)率為 0.040g/(L?h), 比對(duì)照組的產(chǎn)量(0.8g/L)提高 78%。

2.5 培養(yǎng)基中的葡萄糖、乳酸及醋酸的含量變化

本研究在利用含不同起始濃度的醋酸及乳酸的低糖 M9 培養(yǎng)基(含 2g/L 葡萄糖)對(duì)重組菌株進(jìn)行培養(yǎng)期間, 分別于第 6, 12, 24和 36 小時(shí)對(duì)培養(yǎng)基中的葡萄糖、乳酸及醋酸含量進(jìn)行測(cè)定, 觀察細(xì)胞對(duì) 3 種物質(zhì)的代謝情況, 圖 7顯示實(shí)驗(yàn)組 HL, HA, HL+HA 及對(duì)照組在 0～36 小時(shí)中的葡萄糖、乳酸及醋酸含量變化。可以看出, 重組細(xì)胞在這 4 種條件下的葡萄糖消耗均有相同的趨勢(shì): 在前 6 小時(shí)大量消耗葡萄糖, 6 小時(shí)以后培養(yǎng)基中的葡萄糖含量極低, 6～12 小時(shí)期間細(xì)胞消耗葡萄糖速度放緩, 直到第 36 小時(shí), 培養(yǎng)基中幾乎無(wú)葡萄糖殘余。此外, 前 12 小時(shí), 4 種條件下的醋酸含量均呈增加趨勢(shì), 直到第 12 小時(shí), 培養(yǎng)基中的醋酸含量達(dá)到約 0.6g/L, 而 12 小時(shí)以后, 在葡萄糖含量極低的狀態(tài)下, 醋酸被細(xì)胞作為碳源參與代謝, 含量逐漸降低, 直到第 36 小時(shí), 培養(yǎng)基中幾乎無(wú)醋酸殘留。在不添加乳酸的培養(yǎng)條件下, 重組細(xì)胞在生長(zhǎng)的前 6 小時(shí)均有乳酸的分泌, 終濃度達(dá)到約 0.4g/L, 而細(xì)胞從第 6 小時(shí)就開(kāi)始緩慢消耗培養(yǎng)基中的乳酸, 直到第 36 小時(shí)培養(yǎng)基中的乳酸含量接近 0。值得注意的是, 初始乳酸添加量相同的 HL 及HL+HA 實(shí)驗(yàn)組的乳酸含量變化趨勢(shì)有所不同。HL 實(shí)驗(yàn)組中, 乳酸含量始終呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì), 而 HL+HA 實(shí)驗(yàn)組中, 前 6 小時(shí), 重組細(xì)胞在含高起始濃度乳酸的培養(yǎng)基中仍然呈現(xiàn)乳酸含量增加的趨勢(shì), 表明重組細(xì)胞在此條件下的乳酸消耗量小于生成量。

圖5 重組菌株BL21_pBAD_phaCAB在LB和M9培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及PHB終含量

LL: 0.04 g/L乳酸; HL: 1.2 g/L乳酸; LA: 0.02 g/L醋酸; HA: 0.6 g/L醋酸; LL+LA: 0.04 g/L乳酸+0.02 g/L醋酸; HL+HA: 1.2 g/L乳酸+0.4 g/L醋酸; 對(duì)照組: 無(wú)醋酸及乳酸添加, 下同

表3 重組菌株BL21_pBAD_phaCAB在不同乳酸及醋酸條件下的PHB終含量、產(chǎn)量及產(chǎn)率

說(shuō)明: CDW 為細(xì)胞干重, 即 1L 菌液所含菌體在充分干燥后的質(zhì)量; PHB 含量 = PHB 質(zhì)量(g)/細(xì)胞干重(g); PHB 產(chǎn)量 = 細(xì)胞干重(g/L)×PHB 含量; PHB 產(chǎn)率= PHB 產(chǎn)量/36 (h)。

圖7 培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸及醋酸含量的變化

3 討論

通過(guò)蛋白質(zhì)譜及透射電鏡結(jié)果, 我們確定了重組菌株的功能性。通過(guò)對(duì)比產(chǎn) PHB 重組菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況, 我們發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的 LB 培養(yǎng)基并不是培養(yǎng)產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的最佳選擇。這是因?yàn)?LB 培養(yǎng)基中氮元素過(guò)多, 且不直接含葡萄糖, 氮源缺乏型 M9 培養(yǎng)基更符合產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的生長(zhǎng)條件。在添加 2 g/L 葡萄糖的情況下, M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的產(chǎn) PHB 重組菌株中的 PHB 含量接近 LB 培養(yǎng)基中的 3 倍, 為細(xì)胞干重的 29.7%, 其 PHB 產(chǎn)量為 LB 培養(yǎng)基中的 8倍, 為 0.7g/L, 此時(shí)的 PHB 含量受限于低糖的條件。Sathish 等[20]將 20g/L 的葡萄糖添加至 M9 培養(yǎng)基中, 在 37°C 條件下對(duì)產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌培養(yǎng)48 小時(shí), 得到細(xì)胞干重 62%的 PHB 含量。

通常認(rèn)為, 醋酸和乳酸是對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有害的物質(zhì)[21], 但本研究發(fā)現(xiàn), 濃度適當(dāng)?shù)拇姿峒叭樗峥勺鳛楫a(chǎn) PHB 重組菌株的有效碳源。在細(xì)胞生長(zhǎng)懸浮期及細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的早中期, 細(xì)胞快速消耗大量葡萄糖用于自身代謝, 此階段醋酸總量有明顯的積累。這是由于在葡萄糖水平高于細(xì)胞生長(zhǎng)所需限制水平時(shí), 細(xì)胞代謝能夠自主分泌醋酸與乳酸[22]。值得注意的是, 在細(xì)胞懸浮期, 大多數(shù)情況下乳酸處于積累狀態(tài), 唯一例外的是在僅添加高濃度乳酸的培養(yǎng)基中, 乳酸含量在監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)均處于減少狀態(tài), 說(shuō)明細(xì)胞從培養(yǎng)早期便開(kāi)始消耗乳酸進(jìn)行自身代謝。結(jié)合葡萄糖消耗曲線及生長(zhǎng)曲線可以推測(cè), 這是由于細(xì)胞在此條件下生在速度極快, 培養(yǎng)基中葡萄糖消耗速度較快, 葡萄糖水平很快跌到細(xì)胞生長(zhǎng)所需限制水平, 從而抑制乳酸的產(chǎn)生, 而較高的乳酸起始濃度激活了 D-乳酸脫氫酶的逆向催化, 促使細(xì)胞利用乳酸合成丙酮酸[23]。此外, 我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于同時(shí)添加高濃度乳酸及醋酸的細(xì)胞, 其生長(zhǎng)速度及最終的穩(wěn)定 OD 值均高于其他條件, 但其細(xì)胞 PHB 含量與對(duì)照組相差無(wú)幾, 說(shuō)明在此條件下細(xì)胞更多地利用碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng)及繁殖, 因此細(xì)胞中 PHB 含量較低。

本文研究結(jié)果表明, 當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中的葡萄糖消耗殆盡時(shí), 細(xì)胞可利用培養(yǎng)基中的醋酸及乳酸來(lái)維持自身代謝, 直到培養(yǎng)基中乳酸及醋酸均消耗殆盡, 細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。在添加 1.2g/L 乳酸的培養(yǎng)基中, 產(chǎn) PHB 重組菌株生長(zhǎng), 能夠獲得高達(dá) 42%的 PHB 含量, 比不添加乳酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞 PHB 含量高約 41%。然而, 過(guò)高濃度的醋酸及乳酸添加會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng), 在乳酸濃度大于 1.2g/L 及醋酸濃度大于 0.6g/L 的生長(zhǎng)條件下, 重組菌株的生長(zhǎng)速度明顯減慢, 終 OD 值明顯降低, 且在乳酸濃度 1.2g/L 及醋酸濃度 0.6g/L 以內(nèi)范圍, 有機(jī)酸的添加不會(huì)對(duì)培養(yǎng)基整體 pH 造成明顯的改變(培養(yǎng)基 pH 始終在 6.8～7.0 之間)。Sun 等[24]在產(chǎn)PHB 重組大腸桿菌中過(guò)表達(dá)基因, 使得大腸桿菌可以在含 3g/L 醋酸及 1g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng), 得到最終 PHB 產(chǎn)量約為 0.12g/L。但是, 目前仍然沒(méi)有在大腸桿菌中過(guò)表達(dá) D-乳酸脫氫酶產(chǎn)PHB 的報(bào)道, 未來(lái)可嘗試?yán)么朔椒ㄌ岣呔陮?duì)乳酸的耐受能力。

4 結(jié)論

本研究將來(lái)自的 PHB 合成操縱子 phaCAB 基因簇在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá), 獲得產(chǎn) PHB 的重組大腸桿菌。通過(guò)用不同的培養(yǎng)基對(duì)重組菌株進(jìn)行培養(yǎng), 選出更適合產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的 M9 營(yíng)養(yǎng)缺乏型培養(yǎng)基。通過(guò)向培養(yǎng)基中添加不同濃度的醋酸及乳酸, 探究產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌的生長(zhǎng)情況、PHB 含量及產(chǎn)量以及生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)葡萄糖、醋酸及乳酸的消耗情況, 得出以下結(jié)論: 1)在低糖環(huán)境中, 添加適量醋酸及乳酸能夠提高重組菌株產(chǎn) PHB 能力; 2)細(xì)胞傾向于在葡萄糖消耗殆盡后開(kāi)始利用醋酸進(jìn)行代謝, 而較高含量的乳酸添加可以在細(xì)胞生長(zhǎng)初期激活細(xì)胞消耗乳酸的能力。

綜上所述, 利用比葡萄糖更為廉價(jià)的醋酸及乳酸為碳源, 對(duì)產(chǎn) PHB 重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)是極具經(jīng)濟(jì)潛力的手段, 可大大降低 PHB 的生產(chǎn)成本。未來(lái)可利用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因改造, 提高對(duì)乳酸及醋酸的耐受力及利用率, 進(jìn)一步提高其市場(chǎng)化價(jià)值。

[1]Madison L, Huisman G W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Mic-robiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63 (1): 21–53

[2]Al-Haj Ibrahim H, et al. Bio-energy production from rice straw a review. Recent Adv Petrochem Sci, 2018, 5(5): 555671

[3]Vandamme P, Coenye T. Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2004, 54(6): 2285–2289

[4]Napathorn S C, Visetkoop S, Pinyakong O, et al. Poly-hydroxybutyrate (PHB) production using an arabinose- inducible expression system in comparison with cold shock inducible expression system in. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9: 661096

[5]Lee S.moves into the plastic age. Nature Bio-technology, 1997, 15(1): 17–18

[6]Leif J, Carlos M. Pretreatment of lignocellulose: for-mation of inhibitory by-products and strategies for mi-nimizing their effects. Bioresource Technology, 2016, 199: 103–112

[7]Lim H G, Lee J H, Noh M H, et al. Rediscovering acetate metabolism: its potential sources and utiliza-tion for bio-based transformation into value-added chemicals. Journal of Agricultural and Food Chemis-try, 2018, 66(16): 3998–4006

[8]Enjalbert B, Millard P, Dinclaux M, et al. Acetate fluxes inare determined by the ther-modynamic control of the Pta-AckA pathway. Scien-tific Reports, 2017, 7: 42135

[9]John R P, Nampoothiri K M, Pandey A. Fermentative production of lactic acid from biomass: an overview on process developments and future perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(3): 524–534

[10]Nessler S, Bras G L, Bras G L, et al. Crystallization of d-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulga-ricus. Journal of Molecular Biology, 1994, 235(1): 370–371

[11]Wang Qian, Yu Hongmin, Xia Yongzhen, et al. Com-plete PHB mobilization inenhances the stress tolerance: a potential biotechnological app-lication. Microbial Cell Factories, 2009, 8(1): 1–9

[12]Sezonov G, Joseleau-Petit D, d’Ari R.physiology in Luria-Bertani broth. Journal of Bacteriology, 2007, 189(23): 8746–8749

[13]Lin Jihong, Lee M C, Sue Yousheng, et al. Cloning of phaCAB genes from thermophilicinfor poly(3-hydrox-ybutyrate) (PHB) production. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(16): 6419–6430

[14]Lageveen R G, Huisman G W, Preusting H, et al. Formation of polyesters by pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydro-xyalkenoates. Applied & Environmental Microbiolo-gy, 1988, 54(12): 2924–2932

[15]Roh H, Lee J S, Choi H I, et al. Improved CO2-derived polyhydroxybutyrate (PHB) production by engineering fast-growing cyanobacteriumUTEX 2973 for potential utilization of flue gas. Bioresource Technology, 2021, 327: 124789

[16]Mai V R. Gas chromatographic determination of poly--hydroxybutyric acid in microbial biomass after hy-drochloric acid propanolysis. Journal of Chromato-graphy A, 1988, 445: 285–289

[17]Palmer J K, Brandes W B. Determination of sucrose, glucose, and fructose by liquid chromatography. Jour-nal of Agricultural & Food Chemistry, 1974, 22(4): 709–712

[18]?zcelik S, Kuley E, ?zogul F. Formation of lactic, acetic, succinic, propionic, formic and butyric acid by lactic acid bacteria. LWT, 2016, 73: 536–542

[19]Zhang Xingchen, Guo Yingying, Liu xu, et al. Engi-neering cell wall synthesis mechanism for enhanced PHB accumulation in. Metabolic Engineering, 2018, 45: 32–42

[20]Sathish A, Glaittli K, Sims R C, et al. Algae biomass based media for poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) pro-duction by. Journal of Polymers and the Environment, 2014, 22(2): 272–277

[21]Shi Lihong, Da Yangyang, Zheng Weitao, et al. Pro-duction of polyhydroxyalkanoate from acetate by metabolically engineered. Jour-nal of Bioscience and Bioengineering, 2020, 130(3): 290–294

[22]Neijssel O M, Teixeira de Mattos M J, Tempest D W. Growth yield and energy distribution // Neidhart F C.&, Cellular & Molecular Biology. Washington: ASM Press, 1996: 1683–1693

[23]Kochhar S, Hunziker P E, Leongmorgenthaler P, et al. Primary structure, physicochemical properties, and chemical modification of NAD(+)-dependent D-lactic acid dehydrogenase: evidence for the presence of Arg-235, His-303, Tyr-101, and Trp-19 at or near the active site. Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(12): 8499–8513

[24]Sun Shenmei, Ding Yamei, Liu Min, et al. Compari-son of glucose, acetic acid and ethanol as carbon resource for production of poly(3-hydroxybutyrate) and other acetyl-CoA derivatives. Frontiers in Bio-engineering and Biotechnology, 2020, 8: 833

Synthesis of PHB by Recombinant.Using Acetic Acid and Lactic Acid as Carbon Sources

XIAO Meng, JIANG Ying, CUI Yixuan, Sadaf Riaz, Maurycy Daroch?

School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; ? Corresponding author, E-mail: m.daroch@pkusz.edu.cn

Two cheap byproducts lactic and acetic acid were directly used as the carbon sources of polyhy-droxybutyrate (PHB)-producing recombinantto investigate the effects of acetic acid and lactic acid on the growth and PHB yield of recombinant. The PHB synthetic operon phaCAB gene cluster constructed on the basis ofgenes was cloned into pBAD vector to obtain PHB-producing recombinant strain, which was expressed inby using arabinose as an inducer. The recombinant strain was cultured using LB and M9 medium respectively, and the growth rate and PHB yield were studied to lead the exploration of optimum medium for PHB-producing recombinant. To explore the effect of lactic acid and acetic acid on the growth and PHB yield of the recombinant strain, 0.04 g/L lactic acid, 1.2 g/L lactic acid, 0.02 g/L acetic acid, 0.6 g/L acetic acid, 0.04 g/L lactic acid + 0.02 g/L acetic acid, 1.2 g/L lactic acid + 0.4 g/L acetic acid were added into M9 medium (containing 2 g/L glucose) as the experimental group where M9 medium (containing 2 g/L glucose) was the control group. The culture media of the 6, 12, 24, and 36 hours were taken respectively to explore the concentration changes in glucose, acetic acid, and lactic acid. The results show that the low nitrogen M9 medium is more suitable for the growth of PHB-producing recombinantin a low sugar culture environment. After the consumption of glucose,.can use acetic acid and lactic acid as carbon sources for metabolism, and by adding a proper amount of acetic acid and lactic acid, the PHB yield of the recombinant strain can get improved. When 1.2 g/L lactic acid is added, an up to 1.43 g/L PHB yield can be achieved which is 78% higher than the control.

PHB; lactic acid; acetic acid;