樊尚珩 李 均

遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū),廣東省珠海市 519000

腎臟纖維化(renal fibrosis)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)發(fā)展的病理基礎(chǔ),其病變包括上皮受損激活炎癥反應(yīng),持續(xù)的炎癥損傷導(dǎo)致腎臟內(nèi)環(huán)境抗損傷修復(fù)系統(tǒng)失調(diào),誘導(dǎo)肌成纖維細胞過度增殖轉(zhuǎn)化,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/基質(zhì)金屬酶組織抑制因子(TIMPs)失衡致大量細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積,引起腎小管萎縮、腎小管組織結(jié)構(gòu)的永久性破壞,最終細胞凋亡器官功能喪失[1-2]。隨著腎臟纖維化的進行性發(fā)展,無法避免危及至人體其他系統(tǒng)功能,引發(fā)一系列并發(fā)癥最終導(dǎo)致死亡。越來越多的研究證實河馬—薩爾瓦多通路(Hippo信號通路)對腎纖維化的發(fā)展發(fā)揮著重要作用。Hippo通路關(guān)鍵核效因子YAP/TAZ持續(xù)激活誘導(dǎo)下游致纖維化靶基因過度表達致組織損傷修復(fù)不良和纖維化[3]。長期以來,使用中藥治療腎纖維化具有獨特的優(yōu)勢和應(yīng)用前景?；谥兴幷w療效應(yīng)且通過多靶點、多機制抑制腎纖維化,將中藥應(yīng)用于抗腎纖維化的研究獲得越來越多的關(guān)注。使用中藥干預(yù)Hippo通路防治腎纖維化也取得了一定的研究成果。本文就Hippo信號通路對腎纖維化的作用以及近年來中醫(yī)藥靶向Hippo信號通路治療腎纖維化的相關(guān)研究進展予以簡要綜述,為尋找潛在的治療靶點及后續(xù)相關(guān)研究提供新思路。

1 Hippo信號通路與腎纖維化

1.1 Hippo信號通路構(gòu)成 Hippo途徑是一條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的信號傳導(dǎo)鏈。哺乳動物Hippo通路由三個激酶級聯(lián)組成：哺乳動物不育20樣激酶1/2(MST1/2)、大腫瘤抑制因子1/2(LAST1/2)、下游重要效應(yīng)因子yes相關(guān)蛋白(YAP)和帶有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)[4]。MST1/2和LAST1/2是該途徑上游信號的核心組成部分, 而YAP、TAZ是Hippo信號通路下游眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,其中TEADs是主要的YAP下游轉(zhuǎn)錄因子[5]。生理狀態(tài)下通路的激活可被看成一條線性級聯(lián),Hippo通路的激活源于MST1磷酸化,磷酸化的MST1與Salvador(SAV1)結(jié)合形成MST-SAV復(fù)合體,其直接磷酸化LAST1/2,活化的LAST1/2磷酸化YAP中的絲氨酸殘基,導(dǎo)致YAP與支架蛋白14-3-3結(jié)合后阻礙YAP由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核的途徑,使YAP滯留在細胞質(zhì)中泛素化、降解;位于細胞質(zhì)中的YAP不能與核內(nèi)TEAD結(jié)合,從而抑制了YAP轉(zhuǎn)錄活性,使細胞增殖和器官生長受到限制[6]。當該途徑上級效應(yīng)因子受外界不良環(huán)境影響而發(fā)生突變、缺失而出現(xiàn)畸變,導(dǎo)致上游MST1/2、LATS1/2激酶級聯(lián)被抑制,去磷酸化的YAP由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)積聚;為誘導(dǎo)下游靶基因的表達,移位至核內(nèi)的YAP本身不與DNA結(jié)合,而與轉(zhuǎn)錄因子TEA結(jié)構(gòu)域家族成員蛋白形成復(fù)合體誘導(dǎo)下級靶基因表達,如CTGF、EGFR、TNF-α,從而激活細胞增殖[7]。

1.2 Hippo信號通路對腎纖維化的影響

1.2.1 Hippo信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)：在器官纖維化中,炎癥導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)TGF-β產(chǎn)生和上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)變樣表型(EMT),上調(diào)YAP/TAZ蛋白表達,并觸發(fā)炎癥信號NF-κB途徑促進炎癥反應(yīng)進一步加重并導(dǎo)致促纖維化進展的一系列細胞機制使組織硬度增加[8]。周細胞存在于大血管和毛細血管的壁上,它積極參與血栓形成和新生血管的炎癥反應(yīng)。當血管內(nèi)皮細胞受損時,周細胞表達的組織因子促進血小板聚集并釋放促炎因子[9]。Yang等[10]通過YAP基因敲除(YAP-SiRNA)抑制了周細胞、內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng),觀察到對下游炎癥因子JNK、NF-κB和TNF-α的抑制作用。提示YAP/TAZ激活參與了周細胞炎癥反應(yīng)的啟動,并證實了YAP/TAZ是所有炎癥因子的上游基因。此外,Zheng等[11]使用腎缺血/再灌注誘導(dǎo)小鼠AKI-CKD轉(zhuǎn)變模型發(fā)現(xiàn)腎臟不良修復(fù)、巨噬細胞浸潤和MCP-1過表達與YAP持續(xù)激活有關(guān),且使用YAP抑制劑維替泊芬(VP)可抑制上述改變。

1.2.2 Hippo信號通路參與EMT：Seo等[12]在腎小管上皮細胞特異性缺失Sav1基因的單側(cè)輸尿管梗阻模型誘導(dǎo)小鼠中發(fā)現(xiàn)腎臟纖維化加重,上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)變樣表型改變,EMT標志物如α-SMA、波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1、上皮細胞標志物E-cadherin等表達增加,細胞凋亡和不良增殖。Xu等[13]使用突變小鼠研究發(fā)現(xiàn)特異性敲除MST1、MST2可使YAP/TAZ在組織中表達增加,導(dǎo)致纖維相關(guān)因子纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白等表達增加。與之對比,選擇性敲除YAP表達可顯著減輕腎功能下降,并降低纖維化因子TGF-β和CTGF的表達[14]。此外,MST1/2的缺失可誘導(dǎo)炎癥細胞因子TNF-α表達增加,且TNF-α通過正反饋回路激活YAP,最終突變小鼠腎臟出現(xiàn)進行性炎癥、腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致纖維化和功能損害[15]。

1.2.3 Hippo通路參與機械轉(zhuǎn)化及與其他信號通路的串擾：YAP/TAZ可感應(yīng)細胞微環(huán)境如細胞外基質(zhì)硬度、細胞密度和細胞骨架張力等變化,即通過機械轉(zhuǎn)導(dǎo)感知器官物理環(huán)境,將機械力和變形轉(zhuǎn)化為生化信號,影響基因表達、細胞形狀和細胞命運[16]。Jin等[17]在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型中發(fā)現(xiàn)腎缺血性損傷引起的炎癥反應(yīng)促進腎實質(zhì)ECM沉積,ECM的過度積累驅(qū)動進行性器官纖維化,增加組織硬度,激活機械敏感的“物理傳感器”YAP。活躍的YAP上調(diào)ECM沉積并激活正反饋回路,誘導(dǎo)成纖維細胞激活加重腎纖維化。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,包括Smad依賴和非Smad依賴途徑。Szeto等[18]的研究表明腎臟硬化后,在堅硬的基質(zhì)中YAP/TAZ通過將激活的Smad2/3保留在細胞核中來促進TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo),首次證明了TGF-β誘導(dǎo)的典型Smad2/3信號是通過ECM剛性變化控制Smad2/3的定位來調(diào)節(jié)的,并且這種機制的調(diào)節(jié)可能依賴于蛋白Yap和TAZ。YAP/TAZ通過機械調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路促進UUO小鼠腎纖維化,從而導(dǎo)致成纖維細胞轉(zhuǎn)化和ECM的產(chǎn)生。

2 腎纖維化在中醫(yī)領(lǐng)域的認知

腎纖維化是西醫(yī)病理名詞,中醫(yī)古籍中無此定義,根據(jù)其各種病理與臨床表現(xiàn),包括“水腫”“關(guān)格”“癃閉”“虛勞”“腎勞”“腎風”“溺毒”“腰痛”“尿濁”等病證范疇。其病因病機可總概括為“本虛標實”,本虛為脾腎兩臟的氣血陰陽虧虛為疾病發(fā)病之本,以外邪、濕濁、濕熱、水飲、瘀血、濁毒等為標,尤其以瘀血貫穿于慢性腎臟病至纖維化的始終[19]?！疤怠薄皾帷薄梆觥薄岸尽奔仁遣±懋a(chǎn)物又是致病因素,與“本虛”相互作用,互為因果。綜上所述,RIF發(fā)展涉及多種病機,因此治療上當以活血化瘀、補虛培本、益腎健脾、排濁解毒、清熱利濕為法。相較于西藥作用靶點單一,中醫(yī)藥注重整體觀念和人的整體功能,考慮疾病的綜合因素以及臟腑之間的關(guān)系。通過充分認識腎纖維化的病機及中醫(yī)藥發(fā)揮的功效有助于創(chuàng)造更多更優(yōu)的治療選擇。

3 中藥調(diào)控Hippo信號通路干預(yù)腎纖維化的相關(guān)研究

3.1 單味中藥

3.1.1 祛濕類：雷公藤作為一類祛風通絡(luò)、除濕止痛的中藥,臨床上常用來治療腎臟疾病、風濕免疫類疾病等,可通過調(diào)節(jié)NF-κB、Wnt/β-catenin、TGF-β等多條信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用。臧勇等[20]使用致纖維化因子TGF-β誘導(dǎo)HK-2細胞發(fā)生EMT變化,產(chǎn)生纖維化現(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)使用TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細胞中TAZ蛋白表達量相較于TGF-β與TP共同誘導(dǎo)的HK-2細胞TAZ蛋白表達量顯著升高,提示TP可通過調(diào)節(jié)Hippo通路效應(yīng)因子表達抑制腎小管上皮細胞纖維化。

桑枝作為藥食兼用植物是一味傳統(tǒng)中藥材,其是?？浦参锏母稍镏l,性平味苦,入肝、脾、肺、腎經(jīng),具有祛風活絡(luò)、利關(guān)節(jié)和燥濕利水等療效,臨床上可用于治療關(guān)節(jié)腫痛、手足麻木、風濕癰痛等疾病。余文勝等[21]對糖尿病db/db小鼠模型使用不同劑量桑枝多糖進行干預(yù)發(fā)現(xiàn),桑枝多糖高劑量組(1 200mg/kg)小鼠腎功能、腎臟組織纖維化因子、炎癥因子以及YAP、TAZ蛋白表達量明顯低于桑枝多糖低劑量組(600mg/kg),且桑枝多糖低劑量組腎功能及腎臟病理變化較模型組明顯改善。以此提示桑枝多糖可能通過調(diào)節(jié)腎臟組織YAP、TAZ蛋白表達以及抑制YAP/TAZ信號通路下游的效應(yīng)因子生成減緩腎間質(zhì)纖維化的形成從而發(fā)揮抗纖維化作用。

3.1.2 活血類：姜黃素是一種姜黃屬根莖提取物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)脂降糖等生物學(xué)活性[22]。嚴穎等[23]運用改良的5/6腎結(jié)扎方式誘導(dǎo)CKD模型觀察腎纖維化病理、腎功能及纖維化指標α-SMA的表達量增加,而使用姜黃素100mg/kg的含藥飼料治療3個月后發(fā)現(xiàn)可以顯著減緩CKD進程,減慢腎纖維化進展,有利于腎功能恢復(fù),且姜黃素治療組腎組織YAP蛋白表達量較結(jié)扎組顯著下降。

3.1.3 槲皮素：槲皮素屬于天然黃酮類物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物活性,且已有研究報道槲皮素具有緩解腎纖維化的作用[24]。Du等[25]證實了Hippo通路參與了高糖 (HG) 誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞(MCs)的增殖,促進系膜基質(zhì)和ECM的合成、沉積增加,導(dǎo)致腎小球硬化。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素呈劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)的MCs中降低的磷酸化MST1和LATS1,使用槲皮素逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)的YAP-TEAD結(jié)合,減少YAP的核表達?？傊?槲皮素可以通過重新激活糖尿病小鼠的Hippo 通路來抑制 MCs 的增殖,并減輕糖尿病小鼠的腎間質(zhì)纖維化。

3.2 中藥復(fù)方

3.2.1 黃芪三七合劑：黃芪三七合劑為臨床上長期用于治療慢性腎病的復(fù)方制劑,對腎功能能受損有明顯改善作用。該方主要由黃芪、三七、昆布、懷牛膝等組成,對糖尿病腎病、急性腎損傷炎癥發(fā)展有一定改善作用[26]。雷小琴等[27]使用黃芪三七合劑對AKI小鼠(86.746mg/只)連續(xù)灌胃3d,發(fā)現(xiàn)治療組NF-κB p65及相關(guān)炎癥因子、YAP蛋白水平量較模型組降低。因此認為黃芪三七合劑改善小鼠急性腎損傷可能與YAP/NF-κB信號軸有關(guān)。

3.2.2 蟲草益腎方：蟲草益腎方是宋立群教授治療CKD的經(jīng)驗方。全方以冬蟲夏草為君藥,以改善脾腎臟腑虛損之本;黃芪為臣藥,益氣健脾,補后天以養(yǎng)先天。全方兼健脾益腎、活血化瘀、瀉濁解毒之效。苑伯菲等[28]觀察到UUO大鼠模型中蟲草益腎方組腎功能指標、組織纖維化面積較模型組減少,磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白表達量較模型組上調(diào)。因此考慮蟲草益腎方保護UUO大鼠腎功能、抑制EMT、延緩RIF進展,其機制可能與調(diào)控Hippo信號通路中核心蛋白YAP、Mst1、Lats1蛋白磷酸化表達程度相關(guān)。

4 展望

腎纖維化病理機制復(fù)雜,涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用。近年更多的研究顯示Hippo信號通路在腎纖維化中發(fā)揮重要作用,涉及細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥損傷、EMT、ECM合成及沉積等多種機制。鑒于中藥的多靶點治療效應(yīng),且中藥治療腎纖維化的療效明確?，F(xiàn)已有相關(guān)研究表明中藥靶向調(diào)控Hippo信號通路的各級激酶蛋白及下級效應(yīng)因子表達達到抗腎纖維化作用。盡管中藥干預(yù)Hippo信號通路延緩腎纖維化的研究取得了一定的成果,但目前的研究現(xiàn)狀仍有不足：第一,中醫(yī)藥種類繁多,單味中藥及復(fù)方其有效成分、藥理作用復(fù)雜,但真正發(fā)揮療效的組分提取、劑量,不同有效組分劑量配伍仍有待深入研究;第二,目前很多研究限于基礎(chǔ)實驗和動物實驗,于臨床應(yīng)用仍有一定差距,中藥發(fā)揮作用機制復(fù)雜,未來仍需進一步研究以得到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的接受;第三,在已有的中藥干預(yù)Hippo信號通路抗腎纖維化研究中,大部分為祛濕類、清熱類、活血類,那么屬于以上類別的其他中藥是否也具有相似的抗腎纖維化機制,在未來研究類別相同的中藥可否通過Hippo通路抗腎纖維化值得我們進一步實踐。總之,依據(jù)目前已有的Hippo通路在腎纖維化中的作用及中藥干預(yù)實驗,未來仍需更深入的研究中醫(yī)藥防治腎纖維化的潛在機制并將其應(yīng)用在臨床工作中,并逐漸完善中藥有效組分之間的配伍—劑量關(guān)系,“精準配伍”有利于提高主效應(yīng),減少毒副反應(yīng),為延緩腎纖維化提供理論參考和藥物策略。