高冬梅，杜振亭

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

香豆素類化合物具有α-苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)[1]，廣泛存存在于植物、動(dòng)物、微生物及其次生代謝物中。目前已分離得到的1300多種香豆素類化合物及其衍生物，根據(jù)環(huán)上取代基種類及位置不同，將香豆素類化合物分為簡(jiǎn)單香豆素、吡喃香豆素、呋喃香豆素及其他香豆素[2]4大類。

由于香豆素類化合物苯并吡喃環(huán)共軛體系及特殊取代基的存在，使該類化合物具有豐富的結(jié)構(gòu)和多樣的用途，如抗凝血[3-5]、抗菌[6-7]、抗腫瘤[8-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、殺蟲[13-14]等生物活性，還可作為熒光增白劑、熒光燃料[15]、檢測(cè)陰陽(yáng)離子[16-17]和中性分子[18]的生物熒光探針等材料使用。雖然香豆素類化合物用途廣泛，但是從植物中提取該類化合物，產(chǎn)量低，分離難度大等缺陷極大的限制了其大規(guī)模開(kāi)發(fā)與利用，因此，對(duì)該類化合物結(jié)構(gòu)修飾與化學(xué)合成方法的研究受到極大的關(guān)注。目前應(yīng)用最廣泛的香豆素衍生物制備方法是Knoevenagel縮合反應(yīng)[19]、Wittig反應(yīng)[18]、Claisen重排反應(yīng)、Heck反應(yīng)、Pechmann縮合反應(yīng)[20]。除此之外,還出現(xiàn)了一些合成香豆素衍生物的新型反應(yīng),如無(wú)溶劑有機(jī)反應(yīng)、光催化反應(yīng)、微波輔助反應(yīng)等。

本文借助合成手段將香豆素母核與新穎模式酰胺基團(tuán)通過(guò)活性亞結(jié)構(gòu)拼接途徑連接，得到一系列香豆素衍生物并評(píng)價(jià)其抑菌活性，旨在尋找結(jié)構(gòu)優(yōu)良、高效、環(huán)保的抑菌劑先導(dǎo)化合物并通過(guò)探索其構(gòu)效關(guān)系為后續(xù)化合物的設(shè)計(jì)與合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCEШ 核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司，500 MHz)；DFY-5/80低溫恒溫反應(yīng)浴(鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；BC-R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；IKA C-MAG HS7磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)；SB25-12DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；MP420全自動(dòng)視頻熔點(diǎn)儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司vasinfectum)；WFH-203三用紫外分析儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

取代水楊醛、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽均為市售分析純；無(wú)水乙醇、冰乙酸、乙酰乙酸乙酯、哌啶、丙酮、甲苯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等為天津博迪化工分析純?cè)噭?/p>

1.2 目標(biāo)化合物合成

系列目標(biāo)化合物以取代水楊醛和丙二酸二乙酯為原料，首先得到中間體1(3-甲酸乙酯-香豆素衍生物)，然后進(jìn)行酯的堿性水解反應(yīng)酸化得到反應(yīng)中間體2(3-甲酸-香豆素衍生物)，在此基礎(chǔ)上使用羧酸?；呋瘎?-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)催化活化，進(jìn)行一系列酰基化取代獲得a(a1～a9)、b(b1～b9)、c(c1～c2)、d(d1～d3)、e(e1～e3)5類共26個(gè)目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物合成路線如圖1所示；系列目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)如表1所示。

圖1 目標(biāo)化合物合成路線Fig.1 The synthetic route of the target compound

中間產(chǎn)物1的合成：在50 mL圓底燒瓶中分別加入丙二酸二乙酯(3.4 mL)，各類取代水楊醛(2.1 mL)、六氫吡啶(哌啶0.3 mL)、無(wú)水乙醇(15 mL)、冰醋酸(0.5 mL)，磁力攪拌下加熱回流2 h，然后放置至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)程)，溫度降低后加入20 mL水，后冰浴冷卻1 h，待結(jié)晶后，減壓抽濾，無(wú)水乙醇洗滌2～3次，得到白色晶體(熔點(diǎn)90-93 ℃)。

表1 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)Tab.1 Structure of the target compound

中間產(chǎn)物 2的合成：將中間產(chǎn)物1(2 g)置入50 mL圓底燒瓶中，依次分別加入NaOH(1.5 g)、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(10 mL)、水(5 mL)，在溫度65 ℃條件下磁力攪拌加熱回流1 h，放置降溫至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)程)；然后轉(zhuǎn)入燒杯中，加入5 mL濃鹽酸、25 mL水，冰浴加速結(jié)晶，后抽濾，用冰水洗滌2次干燥即可(熔點(diǎn)188 ℃)。

目標(biāo)化合物3的合成：將中間產(chǎn)物2(2 g)加入50 mL圓底燒瓶中，依次分別加入DMAP(0.1 g)、EDC(0.1 g)，各類苯胺(4 g)，溶劑DMF25 mL，磁力攪拌下在溫度85 ℃加熱回流2.5 h，靜置至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)程)，然后將反應(yīng)體系一同轉(zhuǎn)入大燒杯中，加入水50 mL水洗滌2～3次后減壓抽濾，干燥后，采用硅膠柱層析、重結(jié)晶等方法分離純化得到系列目標(biāo)化合物。

1.3 抑菌活性測(cè)定

以氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，氯仿為陰性對(duì)照，采用濾紙片法測(cè)試供試化合物對(duì)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)8種供試病原菌的抑菌活性。將供試化合物配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的氯仿溶液，待牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基等高壓滅菌處理后，采用涂布平板法將菌種均勻涂在培養(yǎng)基表面；然后將含有待測(cè)藥液的濾紙片(6 mm)完全貼合于帶菌培養(yǎng)基上，一個(gè)化合物設(shè)置3組重復(fù)，一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。待處理完成后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至溫度37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～12 h，觀察各濾紙片透明程度，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈大小，篩選出活性較好的化合物后，進(jìn)一步測(cè)定其最小抑菌濃度MIC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物物態(tài)與產(chǎn)率

按照?qǐng)D1 合成路線，合成出的a(a1～a9)、b(b1～b9)、c(c1～c2)、d(d1～d3)、e(e1～e3)5類26個(gè)目標(biāo)化合物，其物態(tài)、產(chǎn)率結(jié)果如表2所示。

表2 目標(biāo)化合物物態(tài)與產(chǎn)率Tab.2 State and yield of target compound

2.2 抑菌活性

目標(biāo)化合物抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL條件下，該類型化合物對(duì)蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌抑制活性不佳；不同結(jié)構(gòu)類型化合物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌的抑制活性差異較大，c類化合物對(duì)這幾種供試菌無(wú)抑制活性，d、e類化合物抑制活性優(yōu)于a類化合物，d2、e2化合物的抑菌效果甚至接近陽(yáng)性對(duì)照組；較多化合物a3、a4、a5、a6、d1、d2、d3、e1、e2、e3對(duì)枯草芽孢桿菌具有廣譜抑菌性。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)

根據(jù)目標(biāo)化合物抑菌活性測(cè)試結(jié)果，篩選出部分抑菌活性較好的化合物，測(cè)定其最小抑菌濃度(MIC)值。表1中化合物d1、d2、d3、e1、e2、e3對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌有廣譜抑菌效果且對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值低于50 μg/mL，表明抑制效果良好。表1中化合物d1對(duì)大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果優(yōu)于煙草青枯病菌和獼猴桃潰瘍病菌；化合物e1對(duì)大腸埃希氏菌和獼猴桃潰瘍病菌的活性相對(duì)于枯草芽孢桿菌和煙草青枯病菌較弱。

3 結(jié)語(yǔ)

(1)本文通過(guò)簡(jiǎn)便、快捷的方法合成了香豆素類衍生物26個(gè)，其中多數(shù)為文獻(xiàn)未報(bào)到的新化合物，并采用核磁、紅外等方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征確認(rèn)。所采用的合成方法路線便捷、產(chǎn)率高，為該類化合物的合成研究提供了參考；

(2)以氨芐青霉素為對(duì)照，測(cè)試26個(gè)目標(biāo)化合物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌、蠟狀芽孢桿等8種供試病原菌的活性，以及部分抑菌活性較好化合物的MIC值，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)中供電子基團(tuán)所在的位置不同，其抑菌活性差別較大，該結(jié)論為香豆素類化合物結(jié)構(gòu)修飾合成研究提供了理論基礎(chǔ)。