梁夢夏，劉怡文，孫 蔚，李婉瑩，孔金玉，張 寧，周福有

1)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南洛陽 471003 2)河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽 471003 3)河南科技大學(xué)附屬安陽市腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡診療中心 河南安陽 455000 4)河南科技大學(xué)附屬安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽 455000 5)河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南安陽 455000

食管癌對人類健康威脅極大，我國90%以上為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)，目前ESCC患者的生存率仍很低。研究[1]表明，多種病原微生物均可通過長期定植促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n)是毒力最強(qiáng)的口腔致病菌之一，與ESCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。前期關(guān)于Fn感染與ESCC的研究大多集中在腫瘤細(xì)胞[3]，而對腫瘤微環(huán)境的探討較少。有研究[4-5]表明多種病原微生物能富集腫瘤微環(huán)境中的髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。本研究將Fn感染的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)，探討Fn對MDSC的富集效應(yīng)；通過檢測ESCC組織中Fn感染及MDSC浸潤情況，分析Fn對MDSC的富集效應(yīng)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為ESCC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2016年1月至4月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院及安陽市腫瘤醫(yī)院的130例ESCC患者的癌組織石蠟包埋標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療性ESCC切除術(shù)后患者。②術(shù)后病理診斷明確為ESCC。③ 病例資料信息完整。④ 術(shù)前未接受放化療和免疫治療。⑤確診后隨訪60個(gè)月。130例患者中男81例，女49例；年齡<60歲59例，≥60歲71例；吸煙65例，不吸煙65例；飲酒63例，不飲酒67例；低分化26例，中、高分化104例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例；侵及外膜89例，未侵及外膜41例；臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期74例，Ⅲ、Ⅳ期56例。該研究獲得河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院及附屬安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，并于術(shù)前獲得患者的書面知情同意。

1.2 主要試劑與儀器健康人外周血(實(shí)驗(yàn)室志愿者提供)；人ESCC細(xì)胞系KYSE150(中國博谷生物科技有限公司)；Fn標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25586，由美國路易斯維爾大學(xué)口腔生物實(shí)驗(yàn)室捐贈)。Ficoll-Paque密度梯度分離液(美國GE公司)；白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及CD3單克隆抗體(美國 PeproTech 公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)；抗CD45/APC-Cy7、抗HLA-DR/FITC、抗CD11b/APC及抗CD33/PE的熒光標(biāo)記抗體(美國Biolegend公司)；RNAscope試劑盒及16S rRNA特異探針(美國ACD公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗Fn抗體(意大利Diatheva公司)；熒光兔二抗(647 nm)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin，488 nm)及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，405 nm)(美國CST公司)；CD11b、CD33兔抗人單克隆抗體及二抗(美國Abcam公司)；蘇木精(武漢谷歌生物有限公司)；甲醛、曲拉通X-100、牛血清白蛋白、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液及檸檬酸抗原修復(fù)液(中國索萊寶公司)。光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)，共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)，流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)，厭氧工作站(美國COY公司)。

1.3 Fn感染KYSE150細(xì)胞的免疫熒光法檢測于細(xì)胞培養(yǎng)箱和厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞和Fn，具體方法參照本課題組前期的研究[6]。待KYSE150細(xì)胞密度為70%時(shí)，選取活力較好的Fn(菌液OD600 nm=1～2)感染KYSE150細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=10。感染24 h后加入體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛固定1 h，曲拉通X-100通透5 min，50 g/L 牛血清白蛋白封閉30 min。加入兔抗Fn抗體(按照1∶100 稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS清洗后加入熒光兔二抗孵育1 h，Phalloidin和DAPI染色10 min，甘油封片。共聚焦顯微鏡下拍照，觀察Fn在細(xì)胞中的定位。

1.4 Fn對PBMC中MDSC富集影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測

1.4.1PBMC的分離和培養(yǎng) 取健康人外周血置于抗凝管，生理鹽水稀釋，緩慢鋪于Ficoll-Paque密度梯度分離液表面，800×g離心20 min，分層后小心吸取白膜層，800×g離心 5 min，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察形態(tài)，確定沉淀為PBMC[7]。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸PBMC。

1.4.2細(xì)胞分組與處理[6]①取6孔板，每孔加入1×106個(gè)PBMC，加入1 000 U/mL的IFN-γ，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入50 μg/L CD3單克隆抗體、100 kU/L IL-1β和1 000 kU/L IL-2，此為對照組。②取6孔板，每孔加入1×105個(gè)KYSE150細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。然后加入1×106個(gè)PBMC，建立共培養(yǎng)體系，此為KYSE150組。③取6孔板，每孔加入1×106個(gè)PBMC常規(guī)培養(yǎng)。然后加入1×107個(gè)Fn進(jìn)行感染(MOI=10)，此為Fn組。④取6孔板，每孔加入1×105個(gè)KYSE150細(xì)胞和1×106個(gè)PBMC共培養(yǎng)。然后加入1×107個(gè)Fn進(jìn)行感染，此為KYSE150+Fn組。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4.3MDSC百分比的流式細(xì)胞術(shù)檢測 分別于培養(yǎng)24、48及72 h后，收集各組中的PBMC，并采用抗CD45/APC-Cy7、抗HLA-DR/FITC、抗CD11b/APC及抗CD33/PE熒光標(biāo)記抗體染色，應(yīng)用側(cè)向散射光和前向散射光特性的單核細(xì)胞形態(tài)學(xué)門分選出白細(xì)胞(CD45+細(xì)胞)，并從白細(xì)胞中分選出HLA-DR-細(xì)胞，最終從CD45+HLA-DR-細(xì)胞中分選出CD11b+CD33+的MDSC。具體步驟參照文獻(xiàn)[8]。采用Summit 5.3軟件分析，計(jì)算MDSC百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ESCC組織Fn感染和MDSC富集情況

1.5.1ESCC組織Fn感染的RNAscope檢測 取常規(guī)石蠟包埋的ESCC組織，2.5 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、靶標(biāo)修復(fù)及蛋白酶處理后，F(xiàn)n探針40 ℃雜交2 h；依次加入顯色試劑孵育，蘇木精復(fù)染后封片。具體步驟參照本課題組前期的研究[7-8]。Fn感染陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：以細(xì)胞質(zhì)中單獨(dú)的紅色顆?！?個(gè)為Fn感染陽性細(xì)胞；高倍鏡(×400)下取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞和總細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)>30%為陽性樣本。

1.5.2ESCC組織MDSC富集的免疫組化[11]檢測取常規(guī)石蠟包埋的ESCC組織， 2.5 μm厚連續(xù)切片，取兩張切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、過氧化物酶阻斷及山羊血清封閉后，分別加入CD11b及CD33抗體(按1∶200 稀釋)孵育；PBS清洗后經(jīng)二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。以ECSS組織間質(zhì)細(xì)胞胞膜呈黃或棕色為CD11b或CD33染色陽性細(xì)胞。選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野觀察、計(jì)數(shù)。染色強(qiáng)度：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞占間質(zhì)細(xì)胞百分比：<5%為0分，5%～為1分，30%～為2分，>70%為3分；兩項(xiàng)相加≤3分為陰性，>3分為陽性。兩張ESCC組織CD11b和CD33表達(dá)同時(shí)陽性的為MDSC富集陽性,不滿足以上條件的為MDSC富集陰性。

1.5.3結(jié)果判定 Fn+MDSC陽性組：同一患者ESCC組織中Fn、CD11b及CD33同時(shí)陽性；Fn+MDSC陰性組：不滿足以上條件。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0分析。應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析探討與KYSE150共培養(yǎng)及Fn感染對PBMC中MDSC百分比的影響。采用Cohen′s Kappa 檢驗(yàn)分析ESCC組織中Fn感染與MDSC富集的一致性。Fn+MDSC陽性組與陰性組ESCC患者臨床病理特征的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組患者生存曲線的繪制及比較采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸分析ESCC患者預(yù)后的影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Fn在KYSE150細(xì)胞中的定植情況結(jié)果見圖1，F(xiàn)n成功感染KYSE150細(xì)胞，并定植于細(xì)胞質(zhì)。

圖1 Fn感染KYSE150細(xì)胞的免疫熒光檢測結(jié)果

2.2 各組PBMC中MDSC百分比的比較結(jié)果見表1。PBMC與KYSE150共培養(yǎng)或感染Fn均可升高PBMC中MDSC百分比，且兩者存在協(xié)同作用。

表1 各組PBMC中MDSC百分比的比較 %

2.3 ESCC組織Fn感染及MDSC富集情況結(jié)果見圖2、3。Fn感染陽性的ESCC組織中MDSC大量富集，而Fn感染陰性的ESCC組織中MDSC富集較少。Fn感染與MDSC富集具有較高一致性(表2)。

A:陽性；B:陰性

A1:CD11b陽性；B1:CD11b陰性;A2:CD33陽性；B2:CD33陰性

表2 ESCC組織Fn感染 與MDSC富集的一致性分析 例

2.4 Fn+MDSC陽性組與陰性組ESCC患者臨床病理特征比較結(jié)果見表3。與Fn+MDSC陰性組比較，F(xiàn)n+MDSC陽性組中男性、有吸煙及飲酒史者居多，且腫瘤多為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及外膜，臨床分期多為Ⅲ、Ⅳ期。

2.5 Fn+MDSC陽性組與陰性組ESCC患者預(yù)后比較結(jié)果見圖4。兩組生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.962，P=0.003)。與Fn+MDSC陰性組患者比較，F(xiàn)n+MDSC陽性組患者中位生存期縮短。

2.6 ESCC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果見表4。以ESCC患者的生存時(shí)間為因變量，以Fn+MDSC(陽性=1，陰性=0)，性別(男=1，女=0)、年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、吸煙(有=1，無=0)、飲酒(有=1，無=0)、分化程度(低分化=1，中、高分化=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、浸潤深度(侵及外膜=1，未侵及外膜=0)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)為自變量，進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示Fn+MDSC陽性是影響ESCC預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

表3 Fn+MDSC陽性組與 陰性組ESCC患者臨床病理特征比較 例(%)

圖4 Fn+MDSC陽性組與陰性組ESCC患者生存曲線

表4 ESCC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

ESCC預(yù)后極差，早期診斷困難，中晚期患者5 a生存率極低[12]。Fn為革蘭陰性厭氧菌，廣泛定植于口腔和消化道，近年來被認(rèn)定為具有毒性的條件致病菌，其內(nèi)毒素能抑制免疫應(yīng)答[13]。有研究[2]表明ESCC組織中Fn的DNA含量高于癌旁組織，且Fn與ESCC臨床分期和不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示Fn成功感染ESCC細(xì)胞，并定植于細(xì)胞質(zhì)，提示Fn在ESCC惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但其致病機(jī)制尚未完全闡明。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)[14]。MDSC為腫瘤微環(huán)境中的重要免疫抑制細(xì)胞，是一類骨髓來源的具有免疫抑制功能的HLA-DR-CD11b+CD33+細(xì)胞群，在維持機(jī)體自身耐受和調(diào)控免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，是腫瘤免疫治療的主要障礙[4-5]。MDSC的富集與多種腫瘤的臨床分期、總生存期、血管生成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。中晚期胃癌患者癌組織中MDSC浸潤程度高于早期患者，且浸潤程度越高，預(yù)后越差[15]。結(jié)直腸癌和宮頸癌患者外周血MDSC水平的高低與腫瘤分期和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[16-17]。前列腺癌患者外周血及癌組織中MDSC百分比升高可引起化療抵抗且縮短患者生存期[18]。多種病原微生物均可通過富集MDSC、調(diào)控細(xì)胞間抑制機(jī)制以及分泌免疫抑制分子，重塑腫瘤微環(huán)境，削弱機(jī)體免疫反應(yīng)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。乙型肝炎病毒及幽門螺桿菌均可誘導(dǎo)癌組織中MDSC富集，引起CD4+CD8+T細(xì)胞亞群比例失調(diào)，使機(jī)體抗腫瘤免疫失能，導(dǎo)致癌細(xì)胞惡性增殖[19-20]。本研究通過建立人外周血PBMC與KYSE150細(xì)胞共培養(yǎng)體系，模擬腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)與KYSE150細(xì)胞共培養(yǎng)或Fn感染均可升高PBMC中MDSC百分比，且兩者存在協(xié)同作用，提示ESCC免疫微環(huán)境和Fn感染的微環(huán)境均可富集MDSC，且兩者共同作用對MDSC富集效應(yīng)更顯著。

有研究[21]顯示Fn可通過富集MDSC招募Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、抑制CD4+T細(xì)胞，增加腫瘤負(fù)荷。Fn還可通過激活Toll樣受體4依賴的IL-6/p-STAT3/c-MYC信號通路促進(jìn)微環(huán)境內(nèi)MDSC極化和腫瘤生長[22]。本研究結(jié)果顯示ESCC組織中Fn感染與MDSC富集高度一致，說明Fn定植的ESCC組織中MDSC大量富集。與Fn+MDSC陰性組比較，F(xiàn)n+MDSC陽性組中男性、有吸煙及飲酒史者居多，表明長期吸煙和飲酒可導(dǎo)致口腔環(huán)境惡劣，F(xiàn)n更容易感染并定植，進(jìn)而富集大量MDSC；腫瘤多為低分化，提示Fn對MDSC的富集與腫瘤的惡性程度有關(guān)；多為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及外膜，臨床分期多為Ⅲ、Ⅳ期，提示Fn對MDSC的富集可能促進(jìn)了ESCC的惡性進(jìn)展。本研究結(jié)果亦顯示低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及外膜、臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期及Fn+MDSC陽性是影響ESCC預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示有效清除Fn并抑制MDSC富集可能延長ESCC患者生存時(shí)間。

總之，打破Fn在宿主體內(nèi)持久定植的現(xiàn)狀并抑制MDSC富集，對于積極有效延緩ESCC惡性進(jìn)展并延長患者生存時(shí)間具有非常重要的意義。