郭文娜，姚亞麗，張彥婷，關(guān)方霞

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

黑色素瘤是一種源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升[1-4]。在中國(guó)，黑色素瘤每年增加約2萬例[5-7]。黑色素瘤臨床發(fā)現(xiàn)較晚，惡性程度高，具有高度的侵襲性，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響人類健康[8]。闡明黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探究有效的治療分子靶點(diǎn)具有重要意義。Kelch樣(Kelch-like，KLHL)家族基因突變可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多種疾?。喝鏚LHL6基因突變可導(dǎo)致慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生[9]；KLHL5 mRNA在胃癌中表達(dá)上調(diào)，與患者淋巴結(jié)分期、浸潤(rùn)水平和預(yù)后較差相關(guān)[10]；KLHL13是肺癌惡性進(jìn)展的重要因素[11]；KLHL19基因突變與肝癌、膽囊癌[12]以及非小細(xì)胞肺癌[13]的發(fā)生密切相關(guān)。KLHL21與Cullin3的相互作用對(duì)HeLa細(xì)胞的有絲分裂具有調(diào)節(jié)作用，與其他家族成員不同的是，KLHL21在細(xì)胞分裂后期開始時(shí)調(diào)控染色體乘客復(fù)合體易位，這是完成細(xì)胞分裂所必需的[14]；KLHL21在肝癌的發(fā)生及進(jìn)展中至關(guān)重要，下調(diào)KLHL21可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15-16]；我們的前期研究[17]發(fā)現(xiàn)KLHL21 cg06778853(chr1:6612560)位點(diǎn)的甲基化與黑色素瘤預(yù)后顯著相關(guān)，然而，KLHL21在黑色素瘤中的生物學(xué)功能尚不明確。為此，作者進(jìn)行了如下研究，探究KLHL21在黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及免疫浸潤(rùn)中的作用及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人黑色素瘤A375細(xì)胞系購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，正常人永生角質(zhì)形成細(xì)胞Hacat購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。傳代3次后，將細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、siNC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和siKLHL21組(轉(zhuǎn)染KLHL21特異性siRNA)。KLHL21特異性siRNA由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列為5’-CGUCCAUGAAUCAGGUACATT-3’。將細(xì)胞接種在6孔板中過夜，通過Lipofectamine 2000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)將siRNA(濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞中KLHL21 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)使用TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)試劑從A375、Hacat及3組A375細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]合成cDNA。在LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)PCR系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)上使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa生物技術(shù)公司)進(jìn)行qRT-PCR。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞中KLHL21 蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)根據(jù)組織蛋白提取試劑盒說明書使用RIPA裂解緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)提取A375、Hacat及3組A375細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行Western blot檢測(cè)。KLHL21 抗體為兔抗人多克隆抗體(英國(guó) Abcam公司，按稀1∶1 000釋度) ，內(nèi)參為β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。采用 Image J進(jìn)行條帶灰度分析，以目的蛋白與 β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞增殖活性的CCK-8法和EdU法檢測(cè)

① 3組細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約3 500個(gè)，分別在37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48和72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在微孔板讀取器上測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=[(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A陰性對(duì)照-A空白孔)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

② 參照EdU檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)說明書將細(xì)胞在含有50 μmol/L EdU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并使用倒置熒光顯微鏡采集左上、左下、右上、右下及中間5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞(紅色)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=EdU陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞遷移能力的Transwell小室檢測(cè)將Transwell小室放置于24 孔板中，下室加600 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為 3×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入上室。培養(yǎng)36 h，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞后，使用40 g/L多聚甲醛將小室底部細(xì)胞固定15 min，結(jié)晶紫溶液避光染色15 min，室溫下干燥，最后在倒置顯微鏡下拍攝圖像，選取5個(gè)視野(×400)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(取5個(gè)視野的均數(shù))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 KLHL21表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性分析從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載458例黑色素瘤患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，利用TIME分析黑色素瘤患者中KLHL21表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18-21]，選擇黑色素瘤治療中常用的8個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因，應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析其與KLHL21表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 R 4.0.3和GraphPad Prism 8.01進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用t檢驗(yàn)分析A375和Hacat細(xì)胞中KLHL21 mRNA和蛋白表達(dá)的差異。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組A375細(xì)胞中KLHL21 mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移數(shù)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤細(xì)胞中KLHL21 mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1。由圖1可知，A375細(xì)胞中KLHL21 mRNA和蛋白的表達(dá)量[(4.18±0.30)、(2.92±0.07)]高于正常細(xì)胞Hacat[(1.00±0.01)和(1.00±0.01)](t=15.840和50.260，P<0.001)。

圖1 A375和Hacat細(xì)胞中 KLHL21蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

2.2 沉默KLHL21對(duì)A375細(xì)胞中KLHL21 mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和遷移的影響結(jié)果見表1。由表1可知，siKLHL21組KLHL21的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組及siNC組 (P<0.001)。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于siNC組，KLHL21表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致A375細(xì)胞在24、48和72 h的生長(zhǎng)水平降低(圖2)。

EdU分析顯示，相較于正常對(duì)照組，siNC組的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移量無明顯變化，而siKLHL21組的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移數(shù)降低(表2、圖3)。

表1 3組細(xì)胞中siRNA干擾效率的比較

圖2 3組A375細(xì)胞的增殖曲線(CCK-8法)

表2 3組細(xì)胞增殖率與遷移數(shù)的比較

2.3 KLHL21與黑色素瘤組織免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系Spearman相關(guān)性分析顯示：黑色素瘤中KLHL21與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CD8+T細(xì)胞、樹突細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)(P<0.001，圖4)，表明KLHL21和免疫環(huán)境之間存在潛在聯(lián)系。KLHL21與PD-1、PD-L2、CTLA4、CD4、CD8A和CD80等免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖5)。

圖4 KLHL21表達(dá)水平與黑色素瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

圖5 KLHL21表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因的相關(guān)性

3 討論

黑色素瘤是最致命的皮膚癌，通?；颊咴\斷時(shí)已是晚期，預(yù)后不佳[8]。盡管近年來對(duì)黑色素瘤進(jìn)行了數(shù)項(xiàng)研究，但其潛在的分子機(jī)制仍不清楚。KLHL 家族蛋白在癌癥發(fā)生發(fā)展中有著非常重要的功能[9]。KLHL21在肝癌[16]、乳腺癌[22]、膽管癌[23]等的發(fā)生進(jìn)展中起重要作用，但KLHL21在黑色素瘤中的生物學(xué)功能尚不明確。因此，本研究基于分子實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)分析探究了KLHL21在黑色素瘤細(xì)胞增殖和遷移中的作用及其與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)性以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因的相關(guān)性。

通過分子實(shí)驗(yàn)分析，本研究發(fā)現(xiàn)KLHL21在黑色素瘤A375細(xì)胞中高表達(dá)，特異性抑制其表達(dá)可以降低黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移，說明KLHL21可能在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

目前，免疫治療是晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的首選治療方法，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為首的免疫治療可顯著降低死亡及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)患者生存期[18]。本研究發(fā)現(xiàn)KLHL21表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞、樹突細(xì)胞呈正相關(guān)。CD4+T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中一種重要的免疫細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子參與免疫作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，是機(jī)體抗腫瘤機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。樹突細(xì)胞是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能有效激活初始T細(xì)胞，維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[24]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)KLHL21表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因PD-1、PD-L2、CTLA4、CD4、CD80等的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)?？筆D-1和抗CTLA4免疫治療能抑制腫瘤進(jìn)展，改善患者預(yù)后[25-26]。這些結(jié)果說明KLHL21可能在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展、免疫治療及靶向治療中起重要作用。

綜上所述，KLHL21在黑色素瘤細(xì)胞A375中顯著上調(diào)，抑制KLHL21表達(dá)可誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的增殖和遷移。KLHL21與免疫浸潤(rùn)性細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)基因相關(guān)。盡管KLHL21在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的具體作用及相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，但我們相信在完善相關(guān)基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)后，KLHL21將有望成為黑色素瘤治療的新靶點(diǎn)，改善黑色素瘤患者的預(yù)后。