水坤春， 張思雨， 劉志發(fā)， 朱永亨， 龔粵寧， 趙健

（1.廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，廣東乳源512727； 2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510275；3.深圳市雙花木生物科技有限公司，廣東深圳518052）

張樹蛙屬Zhangixalus是Jiang等（2019）從廣義樹蛙屬Rhacophorussensu lato劃分出來而創(chuàng)建的新屬，目前已知40種（Frost，2022），廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)已記錄2種——大樹蛙Z. dennysi和白線樹蛙Z. leucofasciatus（鄒發(fā)生等，2018；丁向運(yùn)等，2019），2021—2022年的保護(hù)區(qū)兩棲動(dòng)物調(diào)查又記錄到另外2個(gè)物種，體型較大者在形態(tài)上與峨眉樹蛙Z. omeimontis和藍(lán)面樹蛙Z. duboisi相似，體型較小者在形態(tài)和生態(tài)方面與侏樹蛙Z. minimus相似，但也存在一些顯著差異。為此，采用形態(tài)特征結(jié)合分子證據(jù)的分類手段對(duì)以上張樹蛙屬物種進(jìn)行鑒定，并依據(jù)采集到的大樹蛙幼體形態(tài)特征，對(duì)白線樹蛙在廣東省的分布記錄進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料

5號(hào)張樹蛙屬未鑒定標(biāo)本均為2021—2022年在廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的野外調(diào)查過程中采集。剪取樣品的大腿肌肉，95%乙醇保存；標(biāo)本經(jīng)5%甲醛溶液固定后，75%乙醇保存。

1.2 分子系統(tǒng)發(fā)育研究

參照Lyu等（2017）使用線粒體16S1和16S2基因片段對(duì)肌肉樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。選擇張樹蛙屬包括大樹蛙、峨眉樹蛙、藍(lán)面樹蛙、侏樹蛙、利川樹蛙Z. wui、洪佛樹蛙Z. hungfuensis、巫溪樹蛙Z. hongchibaensis、寶興樹蛙Z. dugritei的30個(gè)樣品和樹蛙屬Rhacophorus的黑掌樹蛙R.nigropalmatus和橫紋樹蛙R. translineatus2個(gè)外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（表1）。

將所用37條樣品序列用MEGA 6比對(duì)后，使用MrBayes 3.2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，種間及種內(nèi)遺傳距離使用MEGA 6計(jì)算。

1.3 形態(tài)測(cè)量

對(duì)南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的樹蛙樣品的形態(tài)特征進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量工具為數(shù)顯游標(biāo)卡尺（Neiko 01407A，美國(guó)），精度0.1 mm。外形測(cè)量和外部形態(tài)特征及縮寫依據(jù)《中國(guó)動(dòng)物志 兩棲綱（中卷）》（費(fèi)梁等，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，來自中國(guó)的張樹蛙屬物種聚為A、B、C三大支，而采集于廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的5號(hào)標(biāo)本聚為兩小支，其中，2號(hào)嵌在B支中，與廣西的侏樹蛙樣本聚為姊妹支，另3號(hào)落在C支，與云南、湖南等地被鑒定為藍(lán)面樹蛙的樣本聚為姊妹支（圖1）。在B支，采集于南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)太平洞的標(biāo)本與來自廣西大瑤山和花坪自然保護(hù)區(qū)的侏樹蛙聚為一支，最大遺傳距離為0.72%，結(jié)合形態(tài)特征鑒定為侏樹蛙，是廣東省的物種新分布記錄。

圖1 基于線粒體16S基因片段構(gòu)建的部分張樹蛙屬Zhangixalus物種貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Bayesian inference phylogeny tree of partial Zhangixalus species based on mitochondrial 16S gene

鑒定為藍(lán)面樹蛙的序列分成2支，來自越南老街省沙巴的序列LC010581和LC010582落在B支內(nèi)，而同樣來自越南老街省沙巴的JX219414和云南屏邊的EU215536則嵌在C支，遺傳距離為5.26%，代表了2個(gè)不同物種。C支中被鑒定為藍(lán)面樹蛙的序列與峨眉樹蛙構(gòu)成姊妹支，遺傳距離為0.85%；B支中被鑒定為藍(lán)面樹蛙的序列與普洱樹蛙構(gòu)成姊妹支（遺傳距離為2.69%），與利川樹蛙、洪佛樹蛙、侏樹蛙、巫溪樹蛙、寶興樹蛙等共同組成B支（表2）。

表2 基于線粒體16S基因的張樹蛙屬和外群的種間遺傳距離Table 2 Genetic distance among Zhangixalus species based on mitochondrial 16S gene

基于此，來自廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、湖南壺瓶山、廣西龍勝花坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、云南紅河黃連山自然保護(hù)區(qū)的樣本均為峨眉樹蛙，其中廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（天井山和八寶山）的峨眉樹蛙是廣東省的物種新分布記錄。

2.2 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)峨眉樹蛙和侏樹蛙的形態(tài)描述

2.2.1 峨眉樹蛙共檢視3號(hào)標(biāo)本（圖2）。其中，雌性亞成體（SYS a008609）2021年3月25日采于保護(hù)區(qū)天井山生態(tài)長(zhǎng)廊；雌性亞成體（SYS a008610）和雌性成體（SYS a008611）2021年3月30日采于保護(hù)區(qū)。

圖2 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的峨眉樹蛙標(biāo)本（A. 背面觀， B. 腹面觀）（張思雨 攝）Fig. 2 Specimens of Zhangixalus omeimontis from the Guangdong Nanling National Nature Reserve（A. dorsal view， B. ventral view）（Photoed by Zhang Siyu）

雌性成體頭體長(zhǎng)80.6 mm；頭長(zhǎng)相對(duì)較小，頭長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的32%；頭寬略大于頭長(zhǎng)，頭寬/頭長(zhǎng)=1.04；吻端尖斜，突出于下唇；吻棱明顯，頰部?jī)A斜；鼻孔近吻端，鼻間距顯著小于眶間距，鼻間距/眶間距=0.70；鼓膜大而清晰，鼓膜徑/眼徑=0.68；犁骨齒強(qiáng)壯，舌后端具深缺刻（表3）。

表3 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)峨眉樹蛙各部測(cè)量及主要部位比例Table 3 Measurements of Zhangixalus omeimontis from the Guangdong Nanling National Nature Reserve

四肢相對(duì)較長(zhǎng)而強(qiáng)壯；指趾端吸盤發(fā)達(dá)，指吸盤大于趾吸盤；吸盤橫徑顯著大于縱徑，背面可見“Y”型末節(jié)指（趾）骨形跡，腹面有邊緣溝和發(fā)達(dá)肉質(zhì)墊；指序?yàn)棰螅劲簦劲颍劲?，關(guān)節(jié)下瘤和指基下瘤明顯；指間有蹼，較發(fā)達(dá)，均為半蹼。后肢長(zhǎng)，后肢貼體前伸時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼部，股骨與體軸垂直時(shí)，左右跟部重疊較多；雌性成體脛長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的45%；跗足長(zhǎng)約為頭體長(zhǎng)的66%；趾間蹼發(fā)達(dá)，第四趾以緣膜達(dá)趾端，其余均為全蹼；內(nèi)蹠突發(fā)達(dá)，無外蹠突。

背面皮膚粗糙，滿布痣粒，身體腹面、肛周和四肢內(nèi)側(cè)滿布密集疣粒；顳褶清晰，無背側(cè)褶。

生活時(shí)頭體背部為綠色，與棕色或深棕色斑紋交織而成網(wǎng)狀，吻端、吻棱、上眼瞼和顳褶均為棕色，形成連續(xù)的棕色區(qū)域。腹面乳白色，有大小不等灰黑色雜斑。

棲息于保護(hù)區(qū)海拔1 000～1 200 m的山谷溪流附近。

國(guó)內(nèi)目前已知分布區(qū)包括四川、貴州、云南、廣西、廣東、湖南等地，國(guó)外分布于越南北部的黃連山。

2.2.2 侏樹蛙SYS a008917（圖 3：A、B）、SYS a008918（圖 3：F）、SYS a008919、SYS a008920（圖3：E）、SYS a008921（圖3：C、D）均為雄性成體，2022年3月30日采集于保護(hù)區(qū)。

圖3 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)侏樹蛙（朱永亨 攝）Fig. 3 Zhangixalus minimus from the Guangdong Nanling National Nature Reserve （photoed by Zhu Yongheng）

體較扁平；體小而纖長(zhǎng)，雄性頭體長(zhǎng)28.7～32.7 mm，頭長(zhǎng)相對(duì)較大，頭長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的37%～39%，頭寬小于頭長(zhǎng)，頭寬/頭長(zhǎng)為0.91～0.98；吻端較尖，略突出于下唇，鼻間距顯著小于眶間距（鼻間距/眶間距為 0.83～0.95）；吻棱顯著，銳利；顳褶直，或略彎曲；鼓膜距后眼角很近，大而清晰，鼓膜徑約為眼徑的一半（42%～54%）；犁骨齒為二斜列，位于內(nèi)鼻孔之間；舌2/3游離，后端具缺刻。前肢相對(duì)較短，略顯纖細(xì)；指吸盤大于趾吸盤，吸盤背面可見“Y”型末節(jié)指（趾）骨形跡，腹面有邊緣溝和發(fā)達(dá)肉質(zhì)墊；指序?yàn)棰螅劲簦劲颍劲?，有關(guān)節(jié)下瘤和指基下瘤；僅指基有蹼。后肢相對(duì)較短，前伸貼體時(shí)經(jīng)跗關(guān)節(jié)達(dá)鼓眼之間，左右跟部不相遇。脛長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的39%～41%；跗足長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的61%～66%；趾間1/3蹼，以緣膜達(dá)趾端；內(nèi)蹠突發(fā)達(dá)，無外蹠突（表4）。

表4 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)侏樹蛙各部測(cè)量及主要部位比例Table 4 Measurements of Zhangixalus minimus from the Guangdong Nanling National Nature Reserve

背面皮膚光滑；自口角至體側(cè)具疣粒，以口角處較密集；四肢背面光滑，前臂和跗足外側(cè)具疣粒，排列成行，呈鋸齒狀；腹部和股部腹面布滿扁平疣；泄殖孔下緣具密集大疣粒。

在自然環(huán)境中，背面翠綠色、黃綠色、棕色，頭頂兩眼間有清晰的白色或淺綠色松果眼點(diǎn)，棕色個(gè)體有時(shí)有綠色侵染；上頜基部至吻端粉紅色，有黑色云斑和少量白色點(diǎn)斑；手、跗足背面粉紅色，有黑色云斑和白色點(diǎn)斑；背腹在體側(cè)界限分明，有黑斑和白色點(diǎn)斑；喉部黑色，胸腹乳黃色，后腹部和股內(nèi)側(cè)粉紅色。飼養(yǎng)狀態(tài)下，背棕色變成綠色或墨綠色，有劃痕狀黑色雜斑，有的個(gè)體上頜至體側(cè)有白色線，其上有污黑色的點(diǎn)斑。浸泡標(biāo)本背面均為藍(lán)灰色，腹面白色。

雄性有單咽下外聲囊，繁殖季節(jié)第一指基部具乳白色婚墊。

棲息于保護(hù)區(qū)海拔1 630 m的近山頂矮竹林灌叢，灌叢地面多沼澤，落葉層較厚。侏樹蛙棲息在沼澤落葉層，雄性多躲在枯葉下鳴叫，非常隱蔽而不易見到；未能見到雌蛙。3月底、4月初，該蛙處于繁殖盛期，白天夜晚皆鳴叫，鳴聲持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，多變而獨(dú)特。推測(cè)其產(chǎn)卵于枯葉間，因此并未見到其卵塊。

目前已知分布點(diǎn)共有4個(gè)，即該種的模式產(chǎn)地廣西大瑤山、廣西花坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、湖南莽山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。

廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)侏樹蛙種群與廣西大瑤山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、花坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的形態(tài)特征基本一致，但也存在如下顯著區(qū)別：頭寬顯著小于頭長(zhǎng)，兩眼間有淺色松果眼點(diǎn)。整合南嶺保護(hù)區(qū)及其他已知的地理種群的形態(tài)特征，將侏樹蛙的鑒定特征修訂如下：

（1）雄性頭體長(zhǎng) 28.0～33.0 mm，雌性頭體長(zhǎng)32.0～38.0 mm；（2）自然狀態(tài)下兩眼間有淺色松果眼點(diǎn)；（3）背面翠綠色、黃綠色、棕色，常有稀疏不規(guī)則黑色斑點(diǎn)，上唇經(jīng)顳部下方和體側(cè)至胯部有黑白混雜的帶紋；（4）指間具微蹼；（5）指序?yàn)棰螅劲簦劲颍劲?；?）后肢前伸貼體時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼后方，左右跟部不相遇；（7）雄性至少第一指基部有乳白色婚墊，有單咽下外聲囊。

2.3 大樹蛙幼體、亞成體的形態(tài)特征

共檢視4號(hào)大樹蛙標(biāo)本，幼體（SYS a007007）2018年5月29日采于廣西壯族自治區(qū)賀州市昭平縣，幼體（SYS a007950；圖4）2019年7月15日采于廣東石門臺(tái)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，亞成體（SYS a009012）2022年3月6日采于廣東云開山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，幼體（SYS a009017）3月9日采于廣東黑石頂國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。

圖4 廣東石門臺(tái)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的大樹蛙幼體（王健 攝）Fig. 4 Juvenile Zhangixalus dennysi in the Guangdong Shimentai National Nature Reserve（photoed by Wang Jian）

頭體長(zhǎng)31.3～47.8 mm（n=4）；頭長(zhǎng)為頭體長(zhǎng)的35%～38%；頭寬略小于頭長(zhǎng)，頭寬/頭長(zhǎng)（HW/HL）=0.90～0.99；吻端鈍圓；吻棱明顯，頰部?jī)A斜；鼻孔近吻端，鼻間距顯著小于眶間距，鼻間距/眶間距（INS/IOS）=0.79～0.93；鼓膜大而清晰，鼓膜徑/眼徑（TD/ED）=0.42～0.68；犁骨齒呈兩斜列，舌后端具深缺刻（表5）。

表5 廣東、廣西大樹蛙幼體及亞成體各部測(cè)量及主要部位比例Table 5 Measurements of juvenile and subadult Zhangixalus dennysi from Guangdong and Guangxi

四肢相對(duì)較長(zhǎng)而強(qiáng)壯；指趾端吸盤發(fā)達(dá)，指吸盤大于趾吸盤；吸盤橫徑顯著大于縱徑，背面可見“Y”型末節(jié)指（趾）骨形跡，腹面有邊緣溝和發(fā)達(dá)肉質(zhì)墊；指序?yàn)棰螅劲簦劲颍劲?，關(guān)節(jié)下瘤和指基下瘤明顯；指間有蹼，較發(fā)達(dá)，外側(cè)兩指間具全蹼。后肢長(zhǎng)，后肢貼體前伸時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼前角，股骨與體軸垂直時(shí)，左右跟部相遇或略重疊；趾間蹼發(fā)達(dá)，均為全蹼；內(nèi)蹠突發(fā)達(dá)，無外蹠突。

背面皮膚較光滑，滿布小痣粒，身體腹面、肛周和四肢內(nèi)側(cè)滿布扁平小疣粒；顳褶清晰，無背側(cè)褶。

生活時(shí)頭體背部為綠色，SYS a007007和SYS a007950自上頜緣經(jīng)體側(cè)達(dá)腹股溝具1條乳白色縱帶紋，上臂外側(cè)，前臂外側(cè)至第4指外側(cè)，泄殖孔上方以及自經(jīng)跗關(guān)節(jié)經(jīng)附部至第5趾外側(cè)均有乳白色帶紋；SYS a009017與前2號(hào)標(biāo)本體色大致相同，區(qū)別僅為體側(cè)縱帶紋自上頜緣延伸至腋下，其后多個(gè)乳白色斑點(diǎn)連綴成帶紋；SYS a009012體側(cè)縱帶紋自上頜緣延伸至腋下，上臂及前臂無乳白色縱帶紋。腹面乳黃色，無任何雜斑。

3 討論

3.1 增加峨眉樹蛙為廣東省新記錄，移除藍(lán)面樹蛙的中國(guó)分布記錄

根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育分析和形態(tài)比較，本研究確定于廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)的體型較大的樹蛙新記錄為峨眉樹蛙而非藍(lán)面樹蛙。本研究與Nguyen等（2014）的結(jié)果高度一致，結(jié)合費(fèi)梁等（2009）、Li等（2012a）的結(jié)論，我們認(rèn)為峨眉樹蛙與藍(lán)面樹蛙在越南老街省沙巴均有分布。其中與普洱樹蛙互為姊妹種的一支為真正的藍(lán)面樹蛙，在其他支系上被鑒定為藍(lán)面樹蛙的個(gè)體則應(yīng)為峨眉樹蛙的誤訂。因此，在沒有新的分布證據(jù)之前，應(yīng)暫時(shí)將藍(lán)面樹蛙從中國(guó)兩棲動(dòng)物名錄中移除。

3.2 增加侏樹蛙為廣東省新記錄

通過分子和形態(tài)分析，本文確定在南嶺記錄的體型較小的樹蛙為侏樹蛙。盡管南嶺的侏樹蛙種群與廣西大瑤山、廣西花坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的種群有一定遺傳分化，但分化較小（0.72%），應(yīng)被認(rèn)為是同一物種2個(gè)地理種群間的遺傳分化。此外，在形態(tài)上，南嶺種群與上述廣西兩地的種群亦有顯著區(qū)別，主要表現(xiàn)在頭長(zhǎng)顯著大于頭寬，頭頂兩眼間有顯著的松果眼點(diǎn)（SYS a008918有，但非常不顯著）等方面。

3.3 移除白線樹蛙在廣東的分布記錄

白線樹蛙是劉承釗和胡淑琴依據(jù)采自廣西金秀大瑤山的一號(hào)雄性標(biāo)本所描述，該標(biāo)本頭體長(zhǎng)48.2 mm，第二性征尚不明顯，可能尚未達(dá)到性成熟，此外文中還記載在四川秀山（今重慶秀山）也采集到一體型更小的雄性，特征與大瑤山所采個(gè)體基本相同。此后，他們?cè)谏钊胙芯亢笳J(rèn)為該新種的模式標(biāo)本實(shí)為大樹蛙的幼體，故而應(yīng)將其作為大樹蛙的同物異名，對(duì)此異名的正式說明見胡淑琴對(duì)Inger（1985）的私人通訊。該觀點(diǎn)在此后很長(zhǎng)一段時(shí)間里被廣泛接受（費(fèi)梁等，1990；Zhao &Adler，1993）。然而，費(fèi)梁等（2009）報(bào)道莫運(yùn)明2004年在廣西防城縣扶?。ㄊf大山）再次采集到白線樹蛙，經(jīng)由費(fèi)梁和葉昌媛對(duì)比白線樹蛙和大樹蛙的標(biāo)本，認(rèn)為已知白線樹蛙標(biāo)本具有統(tǒng)一的形態(tài)特征，并據(jù)此將白線樹蛙修訂為有效種。但該研究并未將其與大樹蛙幼體進(jìn)行對(duì)比，關(guān)于白線樹蛙的第二性征也僅表示為婚墊不明顯。隨后，張雷等（2010）、潘丹等（2018）、丁向運(yùn)等（2019）分別報(bào)道了白線樹蛙在貴州、湖南、廣東的分布記錄。在這些報(bào)道中，均提到“吻端經(jīng)上頜緣至體側(cè)有1條乳白色縱帶紋”“上臂背面白色”等特征。但應(yīng)注意的是，這些特征雖然不屬于大樹蛙的鑒別特征，但在大樹蛙發(fā)育階段的幼體（即剛完成變態(tài)不久的個(gè)體）和亞成體中是十分常見的。本研究所檢視的大樹蛙幼體標(biāo)本均與白線樹蛙的鑒定特征相吻合，除與丁向運(yùn)等（2019）在南嶺自然保護(hù)區(qū)所報(bào)道的標(biāo)本僅在體型大小和頭寬比例上略有差異外，其他形態(tài)特征均完全吻合。另有1號(hào)大樹蛙亞成體標(biāo)本的體側(cè)縱帶紋自上頜緣僅延伸至腋下，且上臂及前臂無乳白色縱帶紋，表明大樹蛙在生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能會(huì)出現(xiàn)個(gè)體發(fā)育變色的現(xiàn)象。

在未對(duì)模式標(biāo)本以及模式產(chǎn)地具有“白線”特征的樹蛙標(biāo)本進(jìn)行檢視和測(cè)序之前，尚不能完全否認(rèn)白線樹蛙的有效性。然而，高志偉等（2022）對(duì)潘丹等（2018）報(bào)道的湖南白線樹蛙新記錄憑證標(biāo)本及其他具有“白線”特征的樹蛙標(biāo)本進(jìn)行重新檢視和測(cè)序，結(jié)果表明這些標(biāo)本均為大樹蛙的亞成體，進(jìn)而移除了白線樹蛙在湖南省的分布記錄。而丁向運(yùn)等（2019）在廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)報(bào)道的白線樹蛙，該文僅描述了標(biāo)本的體色和量度，并未給出分子信息，其描述的形態(tài)特征與本次采集的大樹蛙幼體標(biāo)本并無差異。鑒于此，白線樹蛙在廣東省的分布記錄應(yīng)作為大樹蛙幼體的誤訂。

致謝：感謝錢天宇提供寶貴建議，感謝Darrel Frost提供文獻(xiàn)資料。