湯 雯，許 勇，尚莉麗

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

小兒急性上呼吸道感染(acute upper respiratory infection in children，AURIC)系由各種病原體引起的上呼吸道的急性感染，是小兒常見(jiàn)的急性感染性疾病，冬春時(shí)節(jié)發(fā)病率高[1-2]。西醫(yī)主要采用解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰等對(duì)癥治療，中醫(yī)藥治療本病具有病程短、療效快，安全性高和不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)[3]。AURIC相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“感冒”，病因病機(jī)為感受風(fēng)邪，導(dǎo)致衛(wèi)表失和、肺氣失宣。臨床上主要辨證為風(fēng)寒、風(fēng)熱、暑邪及時(shí)邪等，并且具有夾痰、夾滯、夾驚等兼證。總的治療方法為疏風(fēng)解表[4]。小兒病毒性心肌炎(viral myocarditis in children，VMC)是以局限性或彌漫性心肌炎癥病變?yōu)椴±砀淖兊男难芗膊?，通常為病毒侵犯心肌所致[1]。VMC在中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有特定的病名，可將其歸于“心悸”“怔忡”“風(fēng)溫”等范疇[5]。風(fēng)熱犯心、濕熱侵心、氣陰虧損、心陽(yáng)虛衰、痰瘀阻絡(luò)等為其主要中醫(yī)辨證分型[4]?？滤_奇病毒、?？刹《尽⑷傺撞《炯傲餍行愿忻安《镜?0種病毒既可導(dǎo)致上呼吸道感染又可引起VMC[6]。

金銀花、連翹、荊芥穗、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、竹葉、甘草、薄荷、蘆根等組成的銀翹散出自清代吳鞠通的《溫病條辨》，該方具有疏風(fēng)散熱、辛涼透表、清熱解毒之功效[7]?！吨嗅t(yī)兒科學(xué)》[4]首選銀翹散加減治療風(fēng)熱型小兒AURIC及風(fēng)熱犯心型小兒VMC。錢(qián)厚聰[8]研究發(fā)現(xiàn)，銀翹散配合西藥治療能提高小兒AURIC的療效；代雪麗等[9]運(yùn)用Meta分析方法對(duì)銀翹散聯(lián)合常規(guī)西藥治療VMC患者的臨床療效進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)銀翹散聯(lián)合常規(guī)西藥的療效較常規(guī)西藥更好。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討銀翹散“異病同治”治療AURIC、VMC的機(jī)制，并驗(yàn)證中醫(yī)辨證論治思想“異病同治”的現(xiàn)代科學(xué)性。

1 資料與方法

1.1 銀翹散活性成分篩選及其靶點(diǎn)獲取 依次將銀翹散的組方藥物金銀花、桔梗、薄荷、淡豆豉、連翹、牛蒡子、荊芥穗、甘草、蘆根、竹葉10味中藥輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)并運(yùn)用CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)核查，再根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類(lèi)藥性指數(shù)(drug likeness，DL)≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)篩選確定復(fù)方活性成分。最后利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)規(guī)范靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)獲取 以“Acute upper respiratory infection in children”“Viral myocarditis in children”為關(guān)鍵詞，分別輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org)檢索AURIC及VMC的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，使用Venny在線分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)獲得銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)。

1.3 “銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)同活性成分輸入Cytoscape 3.9.1軟件，利用Analyze Network功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算度值及介數(shù)中心性，并以節(jié)點(diǎn)度值大小為主要依據(jù)構(gòu)建“銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 銀翹散與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 將銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，利用Analyze Network功能對(duì)靶基因進(jìn)行拓?fù)浞治?，然后使用其CytoHubba插件，篩選度值排名前5的靶點(diǎn)，作為潛在作用靶點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行GO功能富集及KEGG通路富集分析。將分析結(jié)果按照P值由小到大進(jìn)行排列，最后進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位的潛在作用靶點(diǎn)作為受體大蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)找其對(duì)應(yīng)靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)模式；取“銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中重點(diǎn)活性成分作為配體小分子，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中下載其結(jié)構(gòu)模式。利用PyMOL軟件對(duì)受體大蛋白進(jìn)行去水、去小分子配體等操作，使用AutoDock 4.4.6軟件計(jì)算受體蛋白和配體小分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的電荷，搜索配體分子的可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵等操作，設(shè)定合適的對(duì)接盒子及對(duì)接參數(shù)，設(shè)定對(duì)接形式為半柔性對(duì)接，配體分子設(shè)置為柔性，依次進(jìn)行分子對(duì)接；最后利用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 銀翹散活性成分篩選及其靶點(diǎn)獲取 參照TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)，再依據(jù)OB值及DL值進(jìn)行篩選，最終確定金銀花活性成分23個(gè)、桔?；钚猿煞?個(gè)、薄荷活性成分10個(gè)、淡豆豉活性成分2個(gè)、連翹活性成分23個(gè)、牛蒡子活性成分8個(gè)、荊芥穗活性成分8個(gè)、甘草活性成分92個(gè)、蘆根活性成分1個(gè)、竹葉活性成分2個(gè)，刪除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分及重復(fù)項(xiàng)，最終獲得銀翹散活性成分129個(gè)，OB值前30位活性成分見(jiàn)表1。去除重復(fù)并校對(duì)后得到264個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 銀翹散OB值前30位活性成分

2.2 銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)獲取 通過(guò)對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，獲得小兒AURIC 8 652個(gè)靶點(diǎn)、小兒VMC 3 748個(gè)靶點(diǎn)，使用Venny在線分析工具，獲得銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)119個(gè)，見(jiàn)圖1、表2。

表2 銀翹散與AURIC、VMC的交集靶點(diǎn)

圖1 銀翹散與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)“2.1”“2.2”結(jié)果，將銀翹散藥物、活性成分與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)構(gòu)建“銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果包括154個(gè)節(jié)點(diǎn)和483條邊，節(jié)點(diǎn)分別為119個(gè)交集靶點(diǎn)、10種藥物和25種活性成分。關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)前5位活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇；其中槲皮素關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)最多，為33個(gè)。“銀翹散—成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2，前5位活性成分見(jiàn)表3。

表3 前5位活性成分

2.4 銀翹散與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置蛋白相互作用可信度≥0.900，獲得包含119個(gè)節(jié)點(diǎn)和466條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)，其中孤立靶點(diǎn)11個(gè)。將該網(wǎng)絡(luò)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行拓?fù)浞治龊螳@得一個(gè)具有103個(gè)節(jié)點(diǎn)、463條邊的核心網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)。

圖2 銀翹散—成分—靶點(diǎn)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用Analyze Network功能計(jì)算各靶點(diǎn)度值，得到排在前5位的靶點(diǎn)分別是STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1。度值前25位的靶點(diǎn)及其拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見(jiàn)圖4、表4。

注：節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺、透明度代表度值大小，邊粗細(xì)及透明度代表靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性強(qiáng)弱

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO功能富集分析 對(duì)銀翹散與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果提示共同靶點(diǎn)GO富集分析涉及684條(P<0.05)，其中主要影響生物過(guò)程的有533條，主要包括基因表達(dá)的調(diào)控、凋亡過(guò)程的調(diào)控、激素的調(diào)控、代謝產(chǎn)物的調(diào)控、衰老等生物過(guò)程；細(xì)胞的組成有57條，主要包括細(xì)胞外空間、大分子絡(luò)合物、血小板α顆粒腔、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞外基質(zhì)等；分子功能有94條，主要包括酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、整合素結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結(jié)合等。根據(jù)P值，分別取排名前20位繪制結(jié)果圖，見(jiàn)圖5。

圖5 GO功能富集柱狀圖

2.5.2 KEGG通路分析 對(duì)銀翹散與AURIC、VMC交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果示共同靶點(diǎn)所富集的通路為144條(P<0.05)，包括癌癥信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、AGE/RAGE信號(hào)、IL-17信號(hào)通路等，根據(jù)P值，取排名前50的通路繪制結(jié)果圖，見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG通路富集結(jié)果分類(lèi)圖

2.6 分子對(duì)接 由“2.3”分析結(jié)果可知，排名前5的重要成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇；由“2.4”分析結(jié)果可知，度值前5位的核心靶蛋白分別為STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1。運(yùn)用AutoDock 4.4.6軟件對(duì)核心靶點(diǎn)與重點(diǎn)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果各靶點(diǎn)與活性成分的對(duì)接結(jié)合能均小于0 kcal/mol，分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表5。利用PyMOL軟件對(duì)STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1與槲皮素進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

注:A.AKT1-槲皮素;B.MAPK3-槲皮素;C.RELA-槲皮素;D.STAT3-槲皮素;E.TNF-槲皮素

表5 分子對(duì)接結(jié)合能

3 討論

“異病同治”作為中醫(yī)辨證論治的重要思想之一，在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有體現(xiàn)，在張仲景的《傷寒論》中更有充分體現(xiàn)[10]。陳士鐸《石室秘錄》首次提出“異病同治”這一概念[11]?！爱惒⊥巍毕挡煌膊≡诓煌A段出現(xiàn)相同的病機(jī)變化，即出現(xiàn)相同的證候表現(xiàn)時(shí)，采用相同的治療方法，為中醫(yī)“辨病”“辨證”核心思想的體現(xiàn)，是中醫(yī)學(xué)的重要治療原則[12]。AURIC、VMC從中醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，二者均為感受外邪，同時(shí)可夾有寒、熱、濕、毒等。小兒肺常不足，外感邪氣之后，首犯肺衛(wèi)導(dǎo)致衛(wèi)表失和、肺氣失宣，導(dǎo)致AURIC；若外邪入里，可致心脈痹阻、心血不暢，導(dǎo)致小兒VMC。銀翹散具有辛涼解表、疏風(fēng)清熱、清熱解毒之功，可治風(fēng)熱之AURIC、風(fēng)熱動(dòng)風(fēng)之VMC。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，從銀翹散治療AURIC、VMC的共同靶點(diǎn)出發(fā)，分析其核心靶點(diǎn)及通路，并以此驗(yàn)證“異病同治”的科學(xué)性。

根據(jù)“銀翹散—活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)銀翹散與AURIC、VMC之間關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)最多的活性成分為槲皮素。槲皮素通常以槲皮素糖苷的形式存在，是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的多酚類(lèi)植物化學(xué)物質(zhì)；也是一種生物類(lèi)黃酮，具有抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血壓病、抗阿爾茨海默病、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)心血管等作用[13]。槲皮素作為抗病毒藥物的潛在用途，能夠在初期抑制病毒感染，與病毒復(fù)制的蛋白酶相互作用，并減少感染引起的炎癥[14]。杜麗娜等[15]發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗呼吸道系統(tǒng)病毒的作用，如抗流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒。韋迎娜等[16]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，槲皮素可減輕新生小鼠VMC氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。同時(shí)楊青麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以促進(jìn)神經(jīng)再生，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

通過(guò)分析交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，得出STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1等是銀翹散治療AURIC、VMC的潛在核心靶點(diǎn)。STAT3屬于STAT蛋白質(zhì)亞型之一，是JAK激酶的下游靶蛋白，在調(diào)節(jié)炎癥基因活性和細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用。研究[18]表明，STAT3活性增強(qiáng)可以促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，對(duì)治療小兒AURIC起到一定作用。TNF常指TNF-α，由內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞所分泌，具有雙重作用，適量的TNF具有抗感染、抗病毒等作用，過(guò)量的TNF則會(huì)增強(qiáng)微血管壁通透性，改變黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)凝血酶形成，形成局部微血栓；同時(shí)可活化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)IL-6細(xì)胞因子分泌[19]。TNF與VMC的心肌病變有關(guān)，對(duì)心肌造成損傷，同時(shí)通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子的釋放[20-21]。閆樹(shù)麗[22]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了銀翹散可降低TNF-α的表達(dá)水平從而抑制炎癥反應(yīng)。AKT是PI3K主要下游靶標(biāo)，由AKT1、AKT2和AKT3 3種亞型組成，其中AKT1含量最豐富，多在腦、心臟和肺等器官中，通過(guò)磷酸化激活或抑制其下游靶蛋白，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用[23]。同時(shí)其余靶點(diǎn)如IL-6，也是銀翹散對(duì)AURIC、VMC的作用靶點(diǎn)。

GO功能和KEGG通路分析顯示，銀翹散的功能主要涉及基因表達(dá)的調(diào)控、凋亡過(guò)程的調(diào)控、激素的調(diào)控、代謝產(chǎn)物的調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)等生物過(guò)程；通路主要富集在癌癥、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、AGE/RAGE信號(hào)、IL-17信號(hào)通路及Toll樣受體信號(hào)通路等。PI3K/AKT通路是重要的促增殖及抗凋亡信號(hào)通路之一，直接調(diào)控、影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性及抑制線粒體凋亡因子來(lái)抗細(xì)胞凋亡，可控制心肌細(xì)胞存活及功能，調(diào)控心肌細(xì)胞存活和程序性死亡，同時(shí)也可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[24-26]。TNF信號(hào)通路同樣參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[27-29]。AGE/RAGE信號(hào)通路通過(guò)激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生活性氧，來(lái)活化NF-κB，繼之釋放TNF-α、IL-1等炎癥因子及黏附因子，參與炎癥反應(yīng)[30]。IL-17信號(hào)通路是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的經(jīng)典促炎通路[31]，IL-17可以作用于VMC患者，從而提高心臟功能和免疫功能[32]。Toll樣受體是在樹(shù)突狀細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞上均有所表達(dá)的病原微生物的主要識(shí)別受體，通過(guò)刺激T淋巴細(xì)胞增殖，參與急性上呼吸道炎癥反應(yīng)的病理生理過(guò)程；同時(shí)激活NF-κB，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)[33-34]。

通過(guò)分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)，銀翹散與AURIC、VMC交集核心靶點(diǎn)STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1與重要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇均有較強(qiáng)的結(jié)合活性，表明銀翹散治療AURIC、VMC的核心靶點(diǎn)與重要活性成分也有良好的親和力，從一定程度上證實(shí)銀翹散“異病同治”的作用是通過(guò)這些核心靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)從蛋白與通路層面分析銀翹散“異病同治”AURIC、VMC的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)銀翹散通過(guò)槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇等活性成分，STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1等靶點(diǎn)以及癌癥信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及Toll樣受體信號(hào)通路等途徑對(duì)AURIC、VMC發(fā)揮作用，且分子對(duì)接可表明關(guān)鍵靶點(diǎn)與重點(diǎn)活性成分有良好的親和力。本研究?jī)H從生物信息學(xué)角度進(jìn)行剖析，今后可以從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證銀翹散“異病同治”AURIC、VMC的機(jī)制。