孫 慧，吳中能，苗婷婷，劉俊龍，蘇曉華，丁昌俊，曹志華，閆彩霞，王 濤

（1安徽省林業(yè)科學研究院，合肥 230088；2中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3亳州市林業(yè)科學研究所，安徽亳州 233600）

0 引言

長期栽植楊樹純林會導致嚴重的地力衰退，會使土壤氮、磷及有機質(zhì)含量降低，林地生產(chǎn)力急劇下降[1-3]。姜嘯虹等[4]指出合理輪作、適當混交、農(nóng)林復合、科學施肥等均能改善楊樹林地土壤退化。其中，施肥是提高林地生產(chǎn)力的重要措施之一[5-6]。不同種類的肥料，如：無機肥、有機肥、生物炭及生物菌肥等，對于改善土壤肥力、酶活性及微生物群落組成的作用不同[7-10]。土壤細菌和真菌是生態(tài)系統(tǒng)中重要的消費者和分解者，與土壤相互作用形成動態(tài)系統(tǒng)，不僅在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著關鍵作用，還與土壤質(zhì)量息息相關[11-14]。有研究指出，使用不同的施肥處理均不同程度地影響楊樹林地土壤微生物的組成[15-18]。盧偉偉等[19]得出300℃和500℃制備生物炭對土壤微生物影響的方向一致同時制備溫度越高影響程度越大。也有研究表明，施用有機肥會增加土壤微生物功能多樣性，比施用無機肥更能促進微生物的繁殖，同時能提高土壤微生物生物量和碳源利用率，促進植物營養(yǎng)的吸收[20-23]。王國兵等[24]指出施用有機肥+生物炭最有利于提高楊樹人工林土壤微生物碳氮磷的含量。但是，針對施用不同配比的氮肥、磷肥、鉀肥、有機肥和土壤改良生物菌肥對楊樹林地的影響還未有相關的研究，故筆者以安徽北方5年生楊樹二代林為研究對象，探討不同施肥處理對楊樹林地土壤微生物群落組成及多樣性的影響，旨在找出合適的肥料配比方案，為提高土壤質(zhì)量及微生物多樣性和土壤可持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于渦陽縣曹市鎮(zhèn)徐樓村(33°20′—33°47′N，115°53′—116°33′E)，屬暖溫帶半濕潤季風氣候。該區(qū)域氣候溫和，雨量適中，年平均氣溫15.1℃，歷年平均日照時數(shù)為2015.7 h，年平均降雨量為809.8 mm。

1.2 樣品采集

2016年選取品種、立地及生長狀況基本一致的楊樹二代林（2025楊）作為試驗地。按正交試驗法設計，采用L16(45)正交設計，3次重復，每個處理小區(qū)為15株，株行距為3 m×4 m。肥料種類為氮肥（尿素）、磷肥（過磷酸鈣）、鉀肥（硫酸鉀）、有機肥和土壤改良生物菌肥，每種肥料采用4個水平，同時設3個對照，分別為：間作不施肥、只施復合肥和只施土壤改良生物菌肥，共計57個小區(qū)，19種處理及對照。通過連續(xù)4年的施肥試驗，于2019年10月，根據(jù)林木長勢情況，選取正交試驗中部分代表性處理號開展了土壤理化性質(zhì)和微生物檢測，處理號共有7個，分別為：1號（對照），13號（年均胸徑增長量最高），8號、11號、7號（位列2～4位），14號（超出年均胸徑生長量平均值、位列第9），12號（年均胸徑增長量最低）（施肥處理詳見表1）。分別在小區(qū)內(nèi)劃分對角線，于對角線0、兩邊各1/2處，共3個采樣點采集土樣，分0～20、20～40、40～60 cm土層采取土樣。采集的土樣一部分置于泡沫箱保存，里面放上干冰，帶回實驗室置于-80℃冰箱保存，用于分析土壤微生物細菌及真菌群落組成；另一部經(jīng)風干后研磨過篩，用于土壤酶活性及土壤理化性質(zhì)的測定。

表1 不同處理施肥劑量統(tǒng)計表

1.3 指標測定

晾干的土壤過篩后測定土壤過氧化氫酶(CAT)、脲酶(Urease)、堿性磷酸酶(ALP)、pH、有機質(zhì)(SOM)、全氮(TN)、速效氮(AN)、全磷(TP)、速效磷(AP)、全鉀(TK)及速效鉀(AK)等土壤酶及土壤理化指標。

從冰箱中取出土壤樣品解凍，使用DNA提取試劑盒進行DNA的提取。對16S RNA基因的V3～V4高可變區(qū)片段和ITS rDNA基因序列的ITS1～ITS2片段進行PCR擴增，每個樣本3個重復，同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。后續(xù)PCR產(chǎn)物送廣州基迪奧公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2013、SPSS 20.0、R for Window 3.5.1、MEV 2.0、CANOCO 5.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用聚類分析方法對微生物物種關系進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物多樣性特性

2.1.1 不同施肥處理土壤細菌多樣性 由表2中α多樣性指數(shù)可知，11號樣地0～20 cm土層細菌Sobs值最大，為3552.33，表征其檢測到的OUT個數(shù)最多；7號樣地0～20 cm土層細菌Shannon值較高，為9.88，代表其物種分布較均勻，多樣性較高；11號樣地0～20 cm土層細菌Chao1和Ace值均最大，分別為4280.66和4289.15，表示它們預測的OTU個數(shù)最多；13號樣地40～60 cm土層土壤細菌Goods_coverage值較高，為0.9885，反映了其測序飽和度較高。

表2 不同施肥處理土壤細菌α多樣性指數(shù)

Rank豐度曲線可直觀的反應樣品中包含的分類豐富度和均勻度，由圖1可知，11號樣地20～40 cm土壤細菌Rank豐度曲線在橫軸上的跨度最大，其分類的豐富度越高；在垂直方向上，13號樣地40～60 cm土壤細菌Rank豐度曲線較平緩，反映了樣品中物種分布較均勻。

圖1 不同施肥處理土壤細菌Rank豐度曲線

2.1.2 不同施肥處理土壤真菌多樣性 根據(jù)不同施肥處理土壤真菌α多樣性指數(shù)可知（見表3），13號樣地0～20 cm土層真菌Sobs值最大，為685.00，表征其檢測到的OUT個數(shù)最多；12號樣地0～20 cm土層真菌Shannon值較高，為5.56，代表其物種分布較均勻，多樣性較高；13號樣地40～60 cm土層真菌Chao1值最大，為1029.11，12號樣地40～60 cm土層真菌Ace值最大，為1065.36，表示它們預測的OTU個數(shù)最多；CK樣地40～60 cm土層土壤真菌Goods_coverage值較高，為0.9882，反映了其測序飽和度較高。

表3 不同施肥處理土壤真菌α多樣性指數(shù)

根據(jù)圖2可得，13號樣地0～20 cm土壤真菌Rank豐度曲線在橫軸上的跨度最大，其分類的豐富度越高；在垂直方向上，12號樣地0～20 cm土壤真菌Rank豐度曲線較平緩，反映了樣品中物種分布較均勻。

圖2 不同施肥處理土壤真菌Rank豐度曲線

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 不同施肥處理土壤細菌群落結(jié)構(gòu) 從試驗結(jié)果中挑選所有樣本中的豐度均值排名Top10的物種詳細展現(xiàn)，其他已知物種歸為Others，未知物種標記為Unclassified。圖3中不同施肥處理土壤細菌群落分布前十的菌屬分別為MND1、Gaiella、小梨形菌屬(Pirellula)專性好氧菌、RB41、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、放線菌綱酸微菌目 Iamia、Dongia、Haliangium、溶桿菌屬(Lysobacter)及Subgroup_10。其中MND1在CK樣地20～40 cm土層所占比例最大，為3.28%；Gaiella在7號樣地20～40 cm土層所占比例最大，為3.34%；小梨形菌屬(Pirellula)在11號樣地40～60 cm土層所占比例最大，為3.19%。RB41在8號樣地40～60 cm土層所占比例最大，為3.28%。

圖3 不同施肥處理土壤細菌群落屬水平上的分布特征

2.2.2 不同施肥處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu) 根據(jù)圖4可知，不同施肥處理土壤真菌分布前十的菌屬分別為蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、鐮刀菌屬 (Fusarium)、Populus、鏈 格 孢 屬 (Alternaria)、Clonostachys、毛 殼 菌 屬 (Chaetomium)、籃 狀 菌 屬(Talaromyces)、曲 霉 屬 (Aspergillus)及 蕓 苔 屬(Brassica)。其中蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)及鐮刀菌屬(Fusarium)3種菌屬為優(yōu)勢菌屬，蠟蚧菌屬(Lecanicillium)在14號樣地0～20 cm土層所占比例最大，為27.09%；被孢霉屬(Mortierella)在14號樣地20～40 cm土層所占比例最大，為25.92%；鐮刀菌屬(Fusarium)在11號樣地20～40 cm土層所占比例最大，為28.53%。

圖4 不同施肥處理土壤真菌群落屬水平上的分布特征

2.3 不同施肥處理土壤微生物物種聚類分析

2.3.1 不同施肥處理土壤細菌聚類分析 微生物物種豐度熱圖可以反映樣品之間的物種組成和差異，也可以對物種和樣本進行聚類分析。由圖5屬水平上的物種豐度熱圖可知，7號樣地40～60 cm和20～40 cm土層在物種組成上較為相似；11號樣地和12號樣地0～20 cm土層在物種組成上較為相似。CK樣地0～20 cm土層與8號、11號、12號及13號樣地0～20 cm土層物種組成上具有較大的差異，CK樣地0～20 cm土層內(nèi)MND1、Ellin6067及出芽菌屬(Gemmata)菌屬組成比例較大，而8號、11號、12號及13號樣地0～20 cm土層則較小。

圖5 不同施肥處理土壤細菌群落屬水平上的物種豐度熱圖

2.3.2 不同施肥處理土壤真菌聚類分析 如圖6所示，在屬的分類水平上，對總豐度前20的物種進行熱圖分析表明，8號樣地0～20 cm土層和12號樣地20～40 cm土層在物種組成上較為相似。各樣地各土層的優(yōu)勢菌屬均有較大的差異，說明真菌群落在土層中分布相關性較小。

圖6 不同施肥處理土壤真菌群落屬水平上的物種豐度熱圖

2.4 土壤微生物與土壤環(huán)境因子RDA分析

2.4.1 細菌群落與土壤環(huán)境因子RDA分析 RDA排序圖中，分別以細菌和真菌菌屬組成作為研究對象（藍色小圓點表示），以CAT、Urease、ALP、pH、SOM、TN、AN、TP、AP、TK及AK作為土壤環(huán)境變量（紅色箭頭符號表示）。由圖7可知，只有pH在第一象限，其他環(huán)境因子集中在第三、四象限內(nèi)。其中脲酶和堿性磷酸酶的射線較長，說明它們對細菌菌屬群落組成影響較大，而過氧化氫酶的射線較短，表明其對細菌菌屬群落組成影響較小。細菌菌屬在RDA排序圖中以散射狀分布在圓點附近，個別菌屬分布較遠。

圖7 細菌群落與土壤環(huán)境因子RDA排序

2.4.2 真菌群落與土壤環(huán)境因子RDA分析 由圖8可知，環(huán)境因子主要分布在第一、二及三象限內(nèi)，脲酶的射線較長，說明其對真菌菌屬群落組成影響較大；而堿性磷酸酶、pH和速效鉀的射線較短，表明它們對真菌菌屬群落組成影響較小。真菌菌屬在RDA排序圖中主要集中在圓點附近，不同施肥處理樣地土層真菌群落分布也較分散，說明它們的組成差異較大。

圖8 真菌群落與土壤環(huán)境因子RDA排序

3 討論與結(jié)論

楊樹人工林土壤退化的原因主要是多代連作、不科學的施肥方式、泛濫的使用農(nóng)藥及不合理的集材方式等，其中科學施肥是有效改善土壤退化的方式之一[4]。本研究旨在通過對連續(xù)施用不同肥料的楊樹二代林土壤理化性質(zhì)、酶活性及微生物群落變化地分析，找出適宜改善林地土壤狀況的科學施肥配比。任嘉紅等[25]指出微生物群落結(jié)構(gòu)的變化會直接影響土壤的質(zhì)量和健康狀況，土壤微生物細菌及真菌多樣性指數(shù)越高，其微生物多樣性越豐富，土壤微生態(tài)系統(tǒng)越復雜，功能就越穩(wěn)定。本研究表明：11號樣地施用了250N、500P、500有機肥及200土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層細菌Sobs、Chao1及Ace值均最大；同時7號樣地施用了125N、500P、75K及100土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層細菌Shannon值較高，表層土壤的細菌分布較均勻且多樣性較高，這兩種施肥方案適合改善林地表層土壤細菌群落多樣性。13號樣地施用了500N、75K、500有機肥及150土壤改良生物菌肥，其40～60 cm土層真菌Chao1值最大，表征其檢測到的OUT個數(shù)最多；12號樣地施用了250N、750P、25K、150土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層真菌Shannon值最大且40～60 cm土層真菌Ace值最大，反映了此樣地真菌的物種分布較均勻且多樣性較高，這2種施肥方案適合改善林地深層土壤真菌群落多樣性。因此，今后可考慮這些配方復合菌肥的開發(fā)與推廣應用，以達到有效地解決楊樹林地力衰退問題。

土壤中的溶桿菌屬(Lysobacter)不僅在多種植物根際周圍具有較好的定殖能力，還能夠分泌多種抗生素、生物表面活性物質(zhì)和胞外水解酶來抑制病菌的生長，控制植物病害的發(fā)生[26]。其中，12號樣地20～40 cm土層中溶桿菌屬(Lysobacter)所占比例最高，為1.69%，說明溶桿菌屬(Lysobacter)在此土層中定殖的活性較大。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)憑借自身的高代謝能力、多功能的生理特性、無污染等特點，可在高度貧氧和惡劣條件下生長，能夠用于芳香化合物的生物降解，其在環(huán)境保護和工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大的應用潛力[27]。其中，7號樣地0～20 cm土層鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)所占比例最高，為2.75%，說明鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在此土層中分布較活躍。

真菌參與土壤中動植物殘體的分解，其在植物有機體分解的早期階段比細菌和放線菌更加活躍[20]。其中，蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)及鐮刀菌屬(Fusarium)3種菌屬為真菌優(yōu)勢菌屬。蠟蚧菌屬(Lecanicillium)真菌寄主范圍廣泛，即可以寄生蚜蟲、蚧、害螨等多種害蟲，還能寄生線蟲及銹病、白粉病菌等多種植物病原真菌[28]。所以，其是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中重要的生防真菌之一。14號樣地0～20 cm土層蠟蚧菌屬(Lecanicillium)所占比例最高，為27.09%，說明其在此土層中分布最多。

通過土壤微生物與土壤環(huán)境因子RDA分析表明，脲酶和堿性磷酸酶對細菌菌屬群落組成影響較大，而過氧化氫酶對細菌菌屬群落組成影響較小。脲酶對真菌菌屬群落組成影響較大；而堿性磷酸酶、pH和速效鉀對真菌菌屬群落組成影響較小。綜上所述，脲酶對土壤細菌及真菌菌屬群落組成影響均較大，是楊樹林地重要的土壤環(huán)境因子。