楊黎 張茹 黃建敏 宋亞東 張志新 張毅

根據(jù)2019 年世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，癌癥作為目前全球主要死因之一，肺癌、食管癌是發(fā)病率和死亡率均較高的主要惡性腫瘤[1]。繼常規(guī)治療（手術、放療、化療）、靶向治療之后，免疫療法已成為癌癥治療的第四大支柱[2]，且具有效果好、不良反應小和防止復發(fā)等優(yōu)點。T 細胞在病原體清除和腫瘤監(jiān)測中起著核心作用，且已被證實具有殺傷惡性細胞的能力[3]。因此，目前腫瘤免疫治療以T 細胞為中心，主要集中于增強T 細胞特異性反應，增強抗腫瘤免疫反應[4]。

T 細胞是獲得性免疫系統(tǒng)的主要組成部分。T 細胞表達細胞表面的抗原受體，即T 細胞受體（TCR），識別抗原提呈細胞提呈的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子結合的多肽?？寺⌒蚑CR 為α 鏈和β 鏈組成的異二聚體[5]。α 鏈和β 鏈由恒定區(qū)（C 區(qū)）、可變區(qū)（V 區(qū)）、跨膜區(qū)及胞質區(qū)等組成；V 區(qū)，又稱互補決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR），是特異性識別抗原肽/組織相容性抗原復合物的關鍵部位[6]。CDR3 代表可變區(qū)域中最多樣化和最復雜的部分。因此，可以通過CDR3 序列的多樣性來衡量TCR 的多樣性[7-9]。TCR測序已成為分析宿主-腫瘤相互作用的一種強有力的新技術。

本研究旨在通過對健康人、惡性腫瘤患者外周血以及腫瘤組織進行TCR 測序，闡述惡性腫瘤患者TCR 譜的特點，為未來腫瘤的診斷和治療提供潛在的生物標志物，具有重要的臨床指導意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019 年4 月至2021 年5 月鄭州大學第一附屬醫(yī)院8 例食管癌和8 例肺癌患者的外周血標本，以及1 例食管癌患者腫瘤切除標本，病理診斷均明確，具有完整的臨床病理資料（表1），其中男性13 例，女性3 例，年齡50～71 歲。所有患者均未行放、化療，并排除嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病以及近期使用免疫抑制劑治療史情況。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第8 版食管癌及肺癌TNM 分期體系進行腫瘤分期。以17 例健康人外周血作為對照組，排除惡性腫瘤、嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病以及近期使用免疫抑制劑治療史情況，其中男性4 例，女性13 例，年齡20～19 歲5 例，30～39 歲3 例，50～59歲6 例，60～69 歲2 例，70～79 歲1 例。

表1 16 例腫瘤患者臨床資料

主要試劑：Trizol（購自美國Ambion 公司，貨號15596026），QIAGE 一步RT-PCR 試劑盒（購自美國QIAGEN 公司，貨號210212），Golden Taq DNA 聚合酶（購自上海Toneker Biotech 公司，貨號TK10002），DNA 片段純化試劑盒（購自無錫BioMagbeads 公司，貨號BMSX），IonPlus Fragment Library Kit（購自美國Thermal-Fisher 公司，貨號4471252）、Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit（購自美國Thermal-Fisher 公司，貨號4471250）、AgencourtAMPure XP（購自美國Thermal-Fisher 公司，貨號A63881），Ion 520/530 ExTChef-4rxns&4Init NEW-For600bp（購自美國Thermal-Fisher 公司，貨號A30670），Ion 530 Chip Kit（購自美國Thermal-Fisher 公司，貨號A27764 ）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 外周血標本：使用EDTA 抗凝管靜脈采集外周血5～15 mL，采血后4 h 內4℃分離外周血淋巴細胞，加入Trizol 1 mL 及時放至?80℃臨時保存；腫瘤組織：術中留取腫瘤標本約1 cm3，4℃加入Trizol 1 mL 及時?80℃臨時保存。標本保存時間保證樣品及時有效的檢測。本研究得到鄭州大學第一附屬醫(yī)院科研項目倫理審查委員會批準，獲得研究對象或其家屬知情同意。

1.2.2 RNA 提取 將加入1 mL Trizol 的細胞或組織裂解液于冰上融解，加入500 μL 氯仿，上下顛倒搖勻，靜置 5 min 后，12 000 rpm，4℃，離心15 min。將透明水相層小心轉移到1 個新的1.5 mL 離心管，與等體積異丙醇混合，冰上靜置10 min 后，12 000 rpm，4℃，離心10 min。棄上清，用1 mL 預冷75%乙醇清洗（用無水乙醇及DEPC 水配制）清洗2 次，12 000 rpm，4℃，離心5 min。吸干乙醇，室溫下風干5 min。將RNA 溶于30 μL DEPC 水中，?80℃保存。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應 擴增TCRβ 基因以提取的RNA 作為模板，用QIAGE 一步逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒進行TCRβ 基因的第一輪PCR擴增。RT-PCR含有：1 μg RNA模板，TRTmix 引物和Vβmix引物各0.5 μM，0.4 μM 的dNTP，1 μL OneStep RT-PCR酶混合物，1×OneStep RTPCR 緩沖液和5 單位RNA 酶抑制劑于25 μL 的體積中。TRTmix 引物是基于功能性人類TRBC 等位基因設計的4 個引物的1∶1 混合物（表2），而Vβmix引物是基于功能性人類TRBV 等位基因設計的36 個引物的1∶1 混合物（表3）。RT-PCR 條件：逆轉錄，50℃，30 min；PCR 激活，95℃，15 min，然后20 個反應周期，95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s。

表3 Vβmix 引物序列

表3 Vβmix 引物序列（續(xù)表3）

1.2.4 TCRβ 基因的PCR 擴增 以第1 輪RT-PCR產(chǎn)物為模板，對TCRβ 基因進行第2 輪PCR 擴增。PCR 體系含有：7.5 μL 第1 輪RT-PCR 產(chǎn)物，0.5 μM的 hTCRCbBCX 引物和Vβmix 引物，0.4 μM 的dNTP，1×Gold Taq PCR 緩沖液，3 μL Golden Taq DNA 聚合酶以及2 mM 的MgCl2在50 μL 的體積中。Vβmix引物是用于RT-PCR 反應的相同混合物，而hTCRCb-BCx 引物含有barcodes（表4，大寫堿基對表示barcodes）。PCR 條件：活化，95℃，10 min，20 個反應周期，95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 片段純化試劑盒純化。

表4 hTCRCbBCx 引物序列

1.2.5 TCR 測序 根據(jù)說明書，使用Thermal-Fisher Ion Plus Fragment Library Kit、Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit、Agencourt AMPure XP 制備測序文庫。使用 Ion 520/530 ExT-Chef-4rxns&4Init NEW-For600 bp 在Thermal-Fisher Ion Chef 系統(tǒng)上進行自動模板制備和芯片加載。然后，使用Ion 530 Chip Kit 在Thermal-Fisher Ion S5 系統(tǒng)上進行 TCRβ 可變區(qū)測序。由成都益安博生物技術公司進行測序。

1.2.6 TCR 測序數(shù)據(jù)分析 測序結果根據(jù)barcodes導出至每個樣品分離的FASTA 文件中。使用默認參數(shù)通過IgBLAST 程序分析Fasta 文件，確定每個TCRβ 序列使用的種系Vβ、Jβ 基因、CDR3 區(qū)域、CDR3 氨基酸序列。其V-D-J 連接產(chǎn)生具有非空CDR3 區(qū)域的TCRβ 肽的生產(chǎn)性翻譯的TCRβ 序列被定義為“功能性”。為了進行比較研究，從每個樣本中隨機選擇30 000 個功能性TCRβ 序列。

外周血TCR 的多樣性由D50值確定，并以此評估受試者的免疫力健康水平[10-11]。根據(jù)測得的TCR 可變區(qū)序列信息，將所有功能性基因可變區(qū)CDR3 序列總數(shù)記為N，不同克隆的CDR3 類型記為C，每一種克隆的拷貝數(shù)即為N1、N2……NC，并且按照從多至少排序（N1≥N2≥……NC-1≥NC），拷貝數(shù)和占CDR3 序列總數(shù)50% 的克隆類型數(shù)記為H，H 與C 的比值為D50；D50的數(shù)學公式定義：當（N1+N2+…+NH-1）≤0.5×N 且（N1+N2+…+NH）≥0.5×N，D50=H/C。

外周血TCR CDR3 序列最大克隆頻率定義為占CDR3 序列總數(shù)的最多拷貝數(shù)的克隆類型的序列總數(shù)的百分比，其數(shù)學表達式為：CDR3 拷貝數(shù)最多克隆類型的序列總數(shù)/CDR3 序列的總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 19.0 軟件用于統(tǒng)計學分析和圖表構建。定量數(shù)據(jù)表述為。通過Pearson 相關性檢驗評估兩個連續(xù)變量之間的關聯(lián)性。影響因素分析應用多因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健康人與腫瘤患者外周血TCR 多樣性比較

通過多因素方差分析，評估性別、年齡以及是否為腫瘤對外周血TCR CDR3 序列D50值的主效應。結果顯示，修正模型的顯著性數(shù)值P<0.05，表明主體間效應具有顯著性。由性別、年齡以及是否為腫瘤的顯著性數(shù)值提示，腫瘤對D50值的主效應顯著（P<0.05），性別、年齡對D50無顯著性影響（表5）。排除年齡、性別的干擾因素，比較健康人與食管癌、肺癌患者的外周血TCR 序列的D50值，結果表明，食管癌（0.031±0.028，P<0.000 1，圖1A）及肺癌患者（0.077±0.034，P=0.005 3，圖1B）的D50明顯低于健康人（0.145±0.057）的D50值。D50值的結果變化同時表明，相比于健康人，食管癌和肺癌患者的總體免疫力較差。TCR CDR3 Vβ 和Jβ 基因的三維柱狀圖（圖1C）顯示，相比于健康人，食管癌與肺癌患者Vβ 和Jβ 基因組合使用減少，存在明顯的單一性。上述數(shù)據(jù)表明，腫瘤患者外周血TCR 多樣性減少，免疫水平降低。

圖1 食管癌、肺癌患者以及健康人外周血TCR 多樣性分析

表5 影響外周血TCR CDR3 序列D50 值的多因素方差分析

2.2 健康人與腫瘤患者外周血中TCR CDR3 序列克隆特征

通過比較健康人與腫瘤患者外周血TCR CDR3序列最大克隆頻率，發(fā)現(xiàn)健康人的最大克隆型頻率（4.070±2.341）%明顯低于食管癌[（10.640±7.640）%，P=0.003 1]、肺癌[（8.334±5.575）%，P=0.011 9]患者（圖2A）。同時，TCR 多克隆比例分布圖也顯示，相比于健康人TCR 克隆均勻分布，食管癌、肺癌患者單個或多個TCR 克隆占比明顯增高（圖2B），表明腫瘤患者體內異常T 細胞克隆增生。此外，TCR 序列的D50值與最大顯性克隆出現(xiàn)的頻率呈負相關（圖2C），表明TCR 譜系多樣性的減少可以通過高度擴增的克隆出現(xiàn)進行反映。同時，在腫瘤抗原的刺激下，不同個體的最大CDR3 序列不同，不同腫瘤類型也各不相同（表6）。

表6 食管癌、肺癌患者外周血TCRCDR3 序列中最大克隆頻率的氨基酸序列

圖2 食管癌、肺癌患者與健康人外周血TCR CDR3 克隆性分布

2.3 食管癌患者外周血TCR 多樣性與臨床特征的關系

進一步分析食管癌患者的臨床分期、病理分化程度對外周血TCR 多樣性的影響，結果顯示：晚期食管癌患者外周血TCR 的CDR3 獨特的氨基酸序列數(shù)量（7 812±3 836，P=0.015，圖3A)及D50值（0.015±0.014，P=0.028 5，圖3B）明顯低于早期食管癌患者（21 454±7 896；0.057±0.028），表明隨著腫瘤進展，外周血TCR多樣性降低。然而，TCR 多樣性在不同分化程度[（0.020±0.017）vs.（0.037±0.034），P=0.454] 之間無顯著性差異（圖3C）。

圖3 食管癌患者外周血TCR 多樣性分析

2.4 TCR CDR3 序列TRBV、TRBJ 基因在食管癌中的頻度分布

統(tǒng)計8 例食管癌患者外周血TCR CDR3 序列TRBV 和TRBJ 基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)食管癌患者外周血中共45 個TRBV 基因和13 個TRBJ 基因，可產(chǎn)生585個基因重組，其 中TRBV2、TRBV11-2 和TRBV11-3 在TRBV 譜系中被大量使用（圖4A）。同時，TRBJ 基因之間也存在較大差異，相比于TRBJ1-1、TRBJ2-1、TRBJ2-3、TRBJ2-7 基因的高表達，TRBJ1-3、TRBJ1-4、TRBJ1-6、TRBJ2-2、TRBJ2-4、TRBJ2-6 表達水平明顯下降（圖4B）。早期、晚期食管癌患者外周血TCR CDR3 TRB 基因的使用情況比較分析，發(fā)現(xiàn)晚期食管癌患者中Vβ 和Jβ 基因組合使用減少，存在明顯的單一性（圖4C）。

圖4 TRBV 和TRBJ 在8 例食管癌患者中的使用頻率

2.5 早期、晚期食管癌患者外周血TCR CDR3 克隆特征

對早期、晚期食管癌患者外周血TCR CDR3 AA長度峰值以及克隆性進行差異分析，CDR3 氨基酸序列長度峰值在不同臨床分期之間無顯著性差異（P=0.725，圖5A）。但是，相比于早期食管癌患者，晚期食管癌TCRCDR3 序列單個或多個TCR 克隆占比明顯高于早期食管癌（圖5B）；最大克隆頻率在晚期食管癌患者中也較早期有升高趨勢[（12.74±8.75）%vs.（7.15±4.69）%，P=0.355]，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5C）。除此之外，晚期食管癌患者外周血TCR CDR3 序列中克隆數(shù)大于1 000 的比例（圖5D）以及前100 位總克隆頻率[（30.07±8.56）%vs.（63.69±23.52）%，P=0.059]均較早期食管癌明顯升高，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5E）。提示隨著腫瘤進展，TCR 的均勻性降低、異?？寺≡黾?。

圖5 不同臨床分期的食管癌患者外周血TCR CDR3 長度分析及克隆性分布

2.6 早期、晚期肺癌患者外周血TCR CDR3 多樣性及克隆分析

進一步對8 例肺癌患者外周血TCR 測序結果進行分析。在早期肺癌患者中，TCR 可變區(qū)序列的D50值明顯高于晚期肺癌患者[（0.106±0.007）vs.（0.059±0.030），P=0.041 7（圖6A）]；同時，在晚期肺癌患者中TCR CDR3 的TRBV 和TRBJ 基因組合使用頻率減少（圖6B）。以上結果表明，隨著腫瘤進展，肺癌患者TCR 的多樣性降低，免疫力下降。除此之外，晚期肺癌患者外周血TCR CDR3 序列中最大克隆比例[（4.753±3.734）%vs.（10.48±5.659）%，P=0.174 9]、前10 位總克隆頻率[（13.27±6.775）%vs.（24.44±9.077）%，P=0.117 6]均較早期患者有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（圖6C，6D）；且晚期肺癌患者外周血TCR CDR3序列單個或多個TCR 克隆占比亦明顯升高（圖6E）。以上結果均與食管癌患者結果一致。

圖6 早期、晚期肺癌患者外周血TCR 多樣性及CDR3 序列的克隆特征

3 討論

在T 細胞發(fā)育過程中，TCR 的CDR3 經(jīng)歷基因重組和不同基因片段的連接，產(chǎn)生大量的T 細胞克隆，每個克隆均有一個獨特的TCR 賦予抗原特異性[12]。TCR 對外來抗原的效應反應中起著重要作用，TCR 的多樣性是建立正常免疫功能的基礎。

正常個體在無抗原刺激的情況下，TCR 基因重排是隨機的，T 細胞呈多家族、多克隆性特點；在腫瘤抗原的刺激下，機體的T 細胞會產(chǎn)生克隆增殖。已有研究報道TCR 多樣性指數(shù)D50可以作為一種簡單的方法評估不同人群免疫水平或者追蹤同一人群免疫狀態(tài)的變化[11]。基于此研究，本研究通過比較健康人與腫瘤患者以及腫瘤患者之間外周血的TCR 譜特點，結果顯示：1）在食管癌和肺癌患者中，外周血TCR 多樣性降低、克隆性增高；且發(fā)現(xiàn)在 TCR 克隆性低的樣本中，多樣性升高，兩者呈負相關關系；2）在食管癌和肺癌患者中，早期腫瘤患者外周血TCR 的多樣性明顯高于晚期患者，且出現(xiàn)明顯異?？寺≡錾＞C上所述，TCR 不僅可以作為一種潛在的免疫監(jiān)測指標，還為腫瘤的診斷提供了潛在的生物標志物。

本項研究同時比較了同1 例食管癌患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）與腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrated lymphocyte，TIL）的TCR 測序結果，初步探究了腫瘤微環(huán)境中T細胞與外周血循環(huán)T 細胞之間的TCR 差異。結果表明，TIL 的TCR CDR3 中獨特的氨基酸序列數(shù)量、D50值明顯低于PBMC，及TIL 的CDR3 Vβ 和Jβ 基因使用明顯減少；相比于PBMC，TIL 中TCR CDR3序列單個或多個TCR 克隆所占比、最大克隆比例以及前100 位總克隆頻率均明顯升高。上述結果初步提示，外周血T 細胞的TCR 多樣性高于腫瘤微環(huán)境中T 細胞，克隆性增殖T 細胞較少，推測腫瘤浸潤淋巴細胞經(jīng)過腫瘤相關抗原刺激呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢擴增。在腫瘤微環(huán)境中T 細胞接受腫瘤抗原的刺激經(jīng)歷克隆性增殖，TCR 呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢擴增、定向趨化；而食管癌患者外周血和腫瘤組織TCR 的差異變化，可能是腫瘤內擴增的T 細胞克隆進入血液循環(huán)后被更多樣化和豐富的外周血克隆庫稀釋所致。因僅有1 例患者的結果對比分析，未來還需要進一步擴充樣本量說明問題。

除此之外，TCR 譜分析也可以為腫瘤的治療策略、治療療效以及預后提供潛在的指導意義。腫瘤的免疫療法是利用內源性免疫系統(tǒng)，或將免疫細胞過繼轉移到宿主體內，以消除腫瘤的治療方式[3]。Teng 等[13]研究確定了在腫瘤微環(huán)境中，同一腫瘤類型存在共享TCR CDR3 克隆型，然而不同腫瘤類型共享克隆型不同。共享TCRs 不僅可以作為腫瘤特異性生物標志物，而且可用于指導開發(fā)針對性強且更安全的腫瘤疫苗，提供潛在的治療策略。具有寡克隆性T 細胞浸潤的黑色素瘤對PD-1 單抗治療療效更好，可能是因為大部分的T 細胞克隆是腫瘤特異性的，并且易于用PD-1 單抗恢復活力[14]。有研究報道晚期黑色素瘤中，抗CTLA-4 治療與TCR 譜系多樣性增加相關，而抗PD-1/PD-L1 治療與寡克隆T 細胞增殖相關[15]。Cui 等[16]報道在宮頸癌中，前哨淋巴結TCR 譜系中克隆型與預后不良有關，克隆型越少，預后越差。

綜上所述，本研究闡明了食管癌和肺癌腫瘤中TCR 譜多樣性以及克隆特點，提供了腫瘤診斷、分期的潛在生物標志物。本研究為小樣本量研究，存在一定的局限性，有待進一步以大樣本量的研究分析；健康人年齡為50（19～70）歲，腫瘤患者年齡為63.5（50.0～70.0）歲，兩組年齡基線差異大；盡管多因素方差分析結果提示腫瘤是影響TCR 多樣性主因素，但仍需加大樣本量消除基線差異，進一步研究證實腫瘤與健康人TCR 譜差異。