賈麗，武英豪，李燕，張建偉，彭清潔，鑫婷，張廣智，馬玉忠，丁家波*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3. 北京市畜牧總站，北京 100193；4. 安琪酵母股份有限公司生物農(nóng)業(yè)技術(shù)中心，湖北 宜昌 443000；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

感染性腹瀉是由病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等病原所致。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，牛冠狀病毒(BCoV)、牛輪狀病毒(BoRVA)、大腸桿菌(E.coli)和隱孢子蟲(chóng)是引起犢牛腹瀉的主要病原[1]。犢牛感染性腹瀉發(fā)病率在80%左右，臨床可見(jiàn)患病犢牛排出白色腹瀉物或黃色稀便。如何有效防控犢牛感染性腹瀉是目前亟待解決的問(wèn)題。本文就犢牛感染性腹瀉的病原、流行特點(diǎn)、檢測(cè)、預(yù)防和治療等方面論述，旨在為該病的綜合防控提供參考。

1 病毒性病原

1.1 牛輪狀病毒A

本病毒易感染30日齡及以下的犢牛，病死率高達(dá)100%[2]。輪狀病毒的外衣殼由VP7和VP4蛋白組成，這兩種蛋白分別含有G、P基因型。數(shù)據(jù)表明，目前至少有41種G基因型和57種P基因型出現(xiàn)，G6、G8、G10與P[1]、P[5]、P[11]，G6P[5]、G6P[11]、G10P[11]較為流行，其中，我國(guó)大部分地區(qū)主要流行的病毒優(yōu)勢(shì)變異基因型為G6P[1][3]。目前，針對(duì)牛輪狀病毒研究出一種即用型液體牛-人重組五價(jià)輪狀病毒疫苗已經(jīng)在印度獲得了使用許可，并在2018與2019年分別在印度通過(guò)了成人和嬰兒的安全性與耐受性試驗(yàn)[4]。全基因組測(cè)序常用來(lái)作為研究BoRVA發(fā)病機(jī)制而被使用。在BoRVA感染MA104細(xì)胞后，通過(guò)使用Illumina RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)在發(fā)生變化的160個(gè)差異表達(dá)基因中有28個(gè)靶向mRNA參與相應(yīng)靶細(xì)胞機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)途徑，利用這種方法能夠更加全面地探究與病毒感染機(jī)制相關(guān)的基因，為抗病毒研究提供條件[5]。近期，依據(jù)雙抗體夾心原理研發(fā)了一種用于鑒定BoRVA的膠體金免疫層析試紙，以膠體金標(biāo)記的純化單克隆抗體作為檢測(cè)線，將山羊抗小鼠抗體和純化的多克隆抗體分別包被在硝酸纖維素膜上作為對(duì)照線和測(cè)試線，通過(guò)優(yōu)化各種條件，能更加高效準(zhǔn)確進(jìn)行BoRVA檢測(cè)[6]。

1.2 牛冠狀病毒

犢牛通常在冬季和較為寒冷地區(qū)最易受到BCoV侵襲，但近些年在溫暖季節(jié)或熱帶地區(qū)BCoV導(dǎo)致?tīng)倥８篂a流行的情況同樣嚴(yán)重，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與分離株中的受體破壞酶(RDE)相關(guān)[7]。本病毒流行范圍廣，在養(yǎng)殖規(guī)模較大的國(guó)家檢出率較高[8]；國(guó)內(nèi)感染主要集中在西南地區(qū)[9]。α和β冠狀病毒主要感染哺乳動(dòng)物，牛冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-OC43、HECoV-44同屬于β冠狀病毒，且由于同一親本在多次基因重組和種間傳播后發(fā)生突變導(dǎo)致感染哺乳動(dòng)物的同屬病毒之間具有密切的遺傳相關(guān)性[10]。研究表明，BCoV會(huì)根據(jù)自身嗜性在免疫環(huán)境產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性壓力下進(jìn)行不斷變異，而這種嗜性又與氨基酸不斷變化相關(guān)，不同重組毒株會(huì)出現(xiàn)相同的氨基酸突變體[11]。在檢測(cè)方面，Geng等[12]研究出一種比傳統(tǒng)PCR具有高特異性和靈敏性的三重qRT-PCR，通過(guò)使用三重特異性探針，設(shè)定最佳退火溫度，在同步檢測(cè)BPV、BCoV和BPIV方面體現(xiàn)了更加優(yōu)越的靈敏度。另外，據(jù)報(bào)道新冠肺炎病原SARS-CoV2與BCoV親緣關(guān)系相近且兩者存在共同表位，使用抗牛冠狀病毒免疫乳進(jìn)行免疫可以降低SARS-CoV2感染[13]。

1.3 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)

目前發(fā)現(xiàn)BVDV有21種A亞型(BVDV 1a～u)、4種B亞型(BVDV 2a～d)和4種H亞型(BVDV 3a～d)。A亞型流行范圍廣，印度尼西亞和中國(guó)西部流行1a和1c；B亞型主要分布在美洲、部分歐洲國(guó)家和亞洲。在日本，除1b亞型外，2a亞型感染情況較嚴(yán)重，占27.7%。我國(guó)福建省BVDV檢出率最高，可達(dá)90.0%[14-15]。BVDV在妊娠早期穿過(guò)胎盤(pán)進(jìn)行感染，出生犢牛轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)感染(PI)牛，PI牛難以?xún)艋?，終生帶毒與排毒，最終成為BVDV的主要傳染源[17]。目前，許多國(guó)家為控制傳染主要依靠篩查和消滅PI牛。應(yīng)用標(biāo)記或DIVA疫苗有助于推動(dòng)流行地區(qū)根除計(jì)劃[18]。研究人員通過(guò)組裝二聚化E2和Erns蛋白制備了BVDV病毒樣顆粒(BVDV-VLPs)，這種VLPs可以顯著升高免疫細(xì)胞表達(dá)水平，增加機(jī)體對(duì)抗病毒的能力[19]。一般來(lái)說(shuō)通過(guò)傳統(tǒng)遺傳表征的方法無(wú)法準(zhǔn)確分析病毒間的遺傳關(guān)系，利用多變量分析可視化中和測(cè)定結(jié)果能更好地表征具有較小抗原差異的同種分離株之間的抗原關(guān)系[20]，為研究病毒的遺傳多樣性提供了更可靠的方法。

2 細(xì)菌性病原

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌包含6種致瀉型菌株，其中產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)最常見(jiàn)，且攜帶志賀毒素基因stx1和stx2、腸毒素基因lt和sta、毒力基因eaeA和f41的大腸桿菌具有更強(qiáng)的感染能力[21]。研究發(fā)現(xiàn)，致?tīng)倥８篂a的STEC O80：H2型大腸桿菌對(duì)人類(lèi)致病能力輕微，但兩者攜帶的基因型相近，感染能力的差異可能與機(jī)體本身的抗感染能力有關(guān)[22]。Bashir等[23]使用使用銀納米粒子(Ag NPs)為表面增強(qiáng)拉曼光譜散射(SERS)底物，通過(guò)比較特定菌株的SERS光譜，對(duì)鑒別大腸桿菌碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株能達(dá)到100%的特異性和準(zhǔn)確性。為了在初乳中獲得最大水平的母源抗體，在母牛分娩前至少8周進(jìn)行最后一次接種并在出生最初幾周連續(xù)給予母乳或免疫乳，可提高犢牛局部腸道免疫能力以預(yù)防腹瀉[24]。研究顯示，在犢牛斷奶后聯(lián)合補(bǔ)充HNa和谷氨酰胺(Gln)可有效改善犢牛的免疫抗氧化能力，增加腸道菌群豐度，緩解因腹瀉帶來(lái)的腸道菌群紊亂與致病菌大量增殖的可能[25]。如今，菌株耐藥能力加強(qiáng)，替抗產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)變得十分關(guān)鍵。He等[26]發(fā)現(xiàn)，熊去氧膽酸(UDCA)能通過(guò)TGR5-NF-κB軸在體外和體內(nèi)阻斷細(xì)菌生長(zhǎng)和侵襲，增強(qiáng)新生奶牛對(duì)腹瀉的抵抗力，起到緩解結(jié)腸炎的作用。

2.2 沙門(mén)菌

沙門(mén)菌是一種無(wú)差別感染人和各種動(dòng)物的食源性病原體。蠅類(lèi)和野生動(dòng)物是沙門(mén)菌的重要攜帶和傳播者[27]。毒力因子能夠幫助細(xì)菌侵入細(xì)胞并逃避免疫系統(tǒng)的捕捉，本菌含有17個(gè)毒力島(SPI)，其中SPI-1～SPI-5主要存在于腸炎沙門(mén)菌中，其中inv、sip、hil與腸炎沙門(mén)菌的侵襲密切相關(guān)[28]。通過(guò)使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(ERIC-PCR)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行準(zhǔn)確基因分型，有利于變異菌株的正確識(shí)別與流行情況的監(jiān)管[29]。此外，在犢牛接種沙門(mén)菌疫苗期間使用“Roncoleukin”(一種免疫刺激劑)和蜂膠乳，可以使機(jī)體形成特異性主動(dòng)免疫反應(yīng)，增加動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度[30]。對(duì)于沙門(mén)菌引起的犢牛腹瀉，應(yīng)盡早使用敏感藥物進(jìn)行治療。使用抗生素治療可將死亡率降低到10%，而未經(jīng)治療的動(dòng)物的死亡率則為75%[31]。在益生菌的應(yīng)用方面，保加利亞德氏乳桿菌與長(zhǎng)雙歧桿菌BL-15955聯(lián)用能夠下調(diào)沙門(mén)菌毒力fanC、fim41a、estAde的表達(dá)，從而起到預(yù)防沙門(mén)菌感染造成犢牛腹瀉的作用[32]。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌根據(jù)毒素和致病力的差異可分為A～E型，毒性由其毒素和降解酶介導(dǎo)，主要包括：α(CPA)、 β(CPB)、 ε(ETX)、 I(CPI)、 β2(CPB2)和腸毒素(CPE)等[33]。一般單一菌株無(wú)法完全產(chǎn)生這些毒素，導(dǎo)致菌株之間存在致病力差異。犢牛是否被感染與年齡和性別無(wú)關(guān)[34]。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌以腸壞死和出血為特征，存在于正常的腸道微生物菌群中不易進(jìn)行診斷；B型主要含有β毒素，易被胰蛋白酶破壞，因此B型產(chǎn)氣莢膜梭菌通常僅引起新生反芻動(dòng)物發(fā)病；C型導(dǎo)致的急性出血性腹瀉主要與動(dòng)物攝入的大量可溶性碳水化合物和/或蛋白質(zhì)有關(guān)[35]；D型菌株在犢牛腹瀉病例中很少見(jiàn)，但會(huì)致?tīng)倥３霈F(xiàn)神經(jīng)癥狀，而腸道病變不顯著[36]?，F(xiàn)階段主要有天然產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素疫苗和甲醛滅活毒素疫苗，接種前者犢牛所獲抗體效價(jià)較高，接種后者免疫應(yīng)答較為多變。但使用任何一種疫苗制劑對(duì)犢牛進(jìn)行免疫都會(huì)引起抗體反應(yīng)[37]。由于傳統(tǒng)疫苗的局限性，Jiang等[38]通過(guò)將產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β和ε的無(wú)毒重組類(lèi)毒素rCPA247-370、rCPBrETxHP在大腸桿菌中表達(dá)研究出了一種重組類(lèi)毒素疫苗，這種疫苗能夠顯著提高IgG抗體水平，加強(qiáng)機(jī)體抗此菌感染的能力。

3 寄生蟲(chóng)性病原

3.1 球蟲(chóng)

我國(guó)有19種牛球蟲(chóng)，其中牛艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriabovis)和邱氏艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriazuernii)在犢牛腹瀉中較為普遍且致病能力強(qiáng)[39]。秋季多雨季節(jié)流行率較高，主要寄生在牛的腸道細(xì)胞內(nèi)，在土壤、植被或水中可以生存數(shù)月。我國(guó)牛艾美耳球蟲(chóng)感染率為40%左右，且在南方的患病率高，犢牛多因吸吮受糞便污染的乳房而感染并且飼養(yǎng)密度越大傳播速度越快[40]。觀察孢子囊數(shù)目和孢子體的分布是鑒別球蟲(chóng)感染公認(rèn)的方法。如今，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)艾美耳球蟲(chóng)特定ITS-1區(qū)的特殊變異序列進(jìn)行擴(kuò)增的PCR方法，不但可以區(qū)分艾美耳球蟲(chóng)，在鑒定高致病性艾美耳球蟲(chóng)方面同樣具有較高的靈敏性[41]。另外，通過(guò)使用納米技術(shù)對(duì)常山酮進(jìn)行封裝可以很好的提高藥物的生物效應(yīng)，從而在減少給藥劑量與毒性作用的同時(shí)，增強(qiáng)藥物內(nèi)化，減少腸道細(xì)胞凋亡，幫助恢復(fù)腸道微生物群來(lái)治療球蟲(chóng)病[42]。

3.2 隱孢子蟲(chóng)

隱孢子蟲(chóng)常與其他病原進(jìn)行混合感染，在犢牛腹瀉中，由隱孢子蟲(chóng)單獨(dú)感染或與其他病原混合感染引起的腹瀉已超過(guò)50%[43]。到目前已發(fā)現(xiàn)40種隱孢子蟲(chóng)，其中小隱孢子蟲(chóng)、牛隱孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)和瑞氏隱孢子蟲(chóng)最常見(jiàn)，可以根據(jù)18S rRNA基因序列分析對(duì)這4種隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行區(qū)分[44]。為了方便對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，Yao等[45]針對(duì)隱孢子蟲(chóng)cgd3_330基因特殊序列區(qū)域建立了一種更加便捷的納米PCR檢測(cè)法，通過(guò)測(cè)試發(fā)現(xiàn)這種納米PCR檢測(cè)的靈敏度比普通PCR檢測(cè)高10倍，為檢測(cè)小隱孢子蟲(chóng)提供了方法。盡管我國(guó)在隱孢子蟲(chóng)的研究方面取得了進(jìn)展，但在隱孢子蟲(chóng)病的實(shí)地研究中仍缺乏先進(jìn)的分子診斷工具，無(wú)法很好地跟進(jìn)綜合性流行病學(xué)調(diào)查。研究證明，在犢牛出生前5 d直接使用常山酮進(jìn)行預(yù)防性治療后可以觀察到卵囊脫落明顯減少，犢牛腹瀉和死亡率顯著降低，機(jī)體抵抗力提升后也能較少地受到其他病原的侵襲[46]。

3.3 賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardia)

賈第鞭毛蟲(chóng)是已知唯一一種以抗原變異機(jī)制逃避宿主免疫的人畜共患原蟲(chóng)，牛是人源性賈第鞭毛蟲(chóng)的重要宿主之一。卵囊主要通過(guò)水源進(jìn)行傳播，隨著土壤濕度增加，檢出的卵囊數(shù)量也會(huì)增加[47]。賈第鞭毛蟲(chóng)的基因型分為A～H，A和E組合主要感染牛，E3在中國(guó)分布最廣。如今，普遍采用谷氨酸、脫氨酶(gdh)和磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)基因進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)多位點(diǎn)基因分型。這3種基因中，bg基因的變異性最大，可以用來(lái)檢測(cè)基因的遺傳多樣性。ssu基因具有高度保守性，可用于樣品中賈第鞭毛蟲(chóng)的鑒別[48]。研究顯示，給犢牛每次口服10 mg/kg塞克硝唑可以100%減少賈第鞭主蟲(chóng)的排泄，說(shuō)明此藥對(duì)治療賈第鞭毛蟲(chóng)感染能起到比較理想的效果[49]。

4 綜合防控

在全世界引起犢牛腹瀉的病原多種多樣，除了常見(jiàn)病原外，牛星狀病毒、牛圓環(huán)病毒、牛諾如病毒、牛腸道病毒、牛細(xì)小病毒等也會(huì)致?tīng)倥８篂a[50]。不同病原由于毒力不同，當(dāng)病原發(fā)生混合感染或進(jìn)行基因型變異時(shí)，疫苗就需要及時(shí)進(jìn)行更新。豐富的疫苗種類(lèi)主要得益于新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與技術(shù)的更新。疫苗在一定程度上可以提高犢牛獲得抗體的滴度，激發(fā)保護(hù)機(jī)制。另外，研制高效的抗菌素替代品，如飼喂釀酒酵母培養(yǎng)物、益生菌、益生元、發(fā)酵代乳粉與超免疫初乳等都可以在一定程度上起到降低犢牛腹瀉發(fā)病率的作用。在廢奶管理方面，雖然有研究證明經(jīng)消毒的廢奶營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)于濃縮飼料，但巴氏滅菌法無(wú)法祛除廢奶中的殘留抗生素，不但致耐藥菌增多，還會(huì)干擾腸道微生物菌群和免疫細(xì)胞的分化。

犢牛會(huì)因病原體的侵襲、環(huán)境的變化或機(jī)體抵抗力降低等誘發(fā)感染性腹瀉。如今，國(guó)內(nèi)大型養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)于犢牛的生長(zhǎng)環(huán)境、飼喂條件等管理更加專(zhuān)業(yè)智能化，犢牛島區(qū)域的合理規(guī)劃有利于改善犢牛的居住與運(yùn)動(dòng)條件，降低腹瀉的發(fā)生。另外，犢牛在被運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中常發(fā)生運(yùn)輸應(yīng)激，這會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，從而為病原入侵提供了條件[51]。因此，應(yīng)將各項(xiàng)運(yùn)輸前后的管理列為犢牛綜合養(yǎng)殖的考慮范圍，提高犢牛養(yǎng)殖方面的廣度和深度認(rèn)識(shí)。

在防治犢牛腹瀉方面使用抗生素結(jié)合支持療法出現(xiàn)了較明顯副作用，這種方法造成了細(xì)菌耐藥性和藥物殘留問(wèn)題且臨床治療效果不夠理想。同樣，中獸藥在治療上也存在著一定局限性，因?yàn)榇蠖喾絼┑氖褂眠€停留在傳統(tǒng)階段，所以開(kāi)發(fā)新制劑成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。集約化和標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展是趨勢(shì)，犢牛感染性腹瀉的防治對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有十分重要的意義。需要采取更加嚴(yán)格科學(xué)的綜合性防治措施，以便更好地進(jìn)行畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)。