張藝欣， 聶 蒙， 錢華卉， 邱 莉， 桑智玥， 陶月琴， 涂辰鈺

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334001； 2.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西上饒 334001；3.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西上饒 334001；4.上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西上饒 334001)

江西鉛山紅芽芋(ColocasiaesculentaL. Schoot var.cormosus‘Hongyayu’)為天南星科本草植物，其營(yíng)養(yǎng)全面，粉糯爽口，具有寬腸胃、補(bǔ)脾胃、消癆散結(jié)、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)免疫等功效[1]，是江西省知名名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品和國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品[2]。植物的生長(zhǎng)發(fā)育一直受外界各種微生物的威脅和挑戰(zhàn)，在與病原菌長(zhǎng)期的共進(jìn)化過程中，植物逐漸進(jìn)化出一套復(fù)雜而精細(xì)的保護(hù)自身免受病原微生物侵害的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制[3]。植物抗病反應(yīng)蛋白能夠特異地識(shí)別病原微生物分泌的效應(yīng)蛋白，從而觸發(fā)免疫響應(yīng)，產(chǎn)生或激活能夠特異識(shí)別效應(yīng)因子的抗性蛋白，以對(duì)抗病原微生物的侵?jǐn)_[4]。因此，克隆江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因并檢測(cè)其組織表達(dá)特異性對(duì)了解江西鉛山紅芽芋抗病品種選育具有重要意義。

關(guān)于植物抗病反應(yīng)蛋白(plant disease resistance response protein)編碼基因的研究尚少見報(bào)道。目前的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物抗病蛋白(plant disease resistance protein)含有一系列富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs)、1個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和1個(gè)假定的氨基末端信號(hào)結(jié)構(gòu)域，它們被稱為NBS-LRR蛋白。來自許多生物體多種蛋白質(zhì)的LRRs是作為蛋白質(zhì)相互作用平臺(tái)和蛋白質(zhì)活化的調(diào)節(jié)模塊。在遺傳學(xué)上，植物抗病蛋白的LRRs是反映特異性的決定因素，它們的作用可以導(dǎo)致植物細(xì)胞以常見的超敏反應(yīng)(HR)的形式死亡[5]。目前，對(duì)紅芽芋的研究主要集中在脫毒快繁[6]、微芋誘導(dǎo)[7]、下游加工[2]、成分分析[1]等方面，關(guān)于紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)克隆江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因，并用生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行序列分析和組織表達(dá)分析，為揭示江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平選育江西鉛山紅芽芋抗病品種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為江西鉛山紅芽芋試管苗，試驗(yàn)時(shí)間為2021年5—9月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成 用TRIzol試劑提取江西鉛山紅芽芋試管苗的總RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA第1鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo(dT)18Primer：5′-G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C T T T T T T T T T T T T T T T T T T-3′，具體步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.2 植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的克隆 采用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN22649_c0_g1)，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(F：5′-A T G T C C G T A T T A T T C A T C A T T T A T C-3′；R：5′-T C A A T A G T T G A A G A C T G T C A C G T T G-3′)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55.3 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α中，將鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的生物信息學(xué)分析 使用BioEdit軟件將基因序列翻譯為氨基酸序列，用ProtParam預(yù)測(cè)酶的理化性質(zhì)，用ProtScale預(yù)測(cè)酶的疏/親水性。用GORⅠ軟件在線預(yù)測(cè)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MOLD在線預(yù)測(cè)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用WoLFPsort在線預(yù)測(cè)基因的表達(dá)部位。通過軟件DNAMAN、Bioedit進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的組織表達(dá)分析 分別取500 ng來自江西鉛山紅芽芋試管苗根、莖、葉、試管球莖(初期、中期和末期)的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過熒光定量PCR(qRT-PCR，SYBR GreenⅠ)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)引物(F：5′-T G C C C T G A G C G T T C C C T A C-3′；R：5′-A C C C G C C T C C A C T T C T T C C-3′；大小為178 bp；Tm為58.3 ℃)。qRT-PCR檢測(cè)采用20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因組織表達(dá)的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的cDNA序列

采用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN22649_c0_g1)，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的cDNA總長(zhǎng)度為534 bp，G+C含量為58.05%(圖1、圖2、圖3)。

2.2 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的氨基酸序列

通過Protparam預(yù)測(cè)，得到江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白氨基酸序列(圖4)。江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白由177個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為19 369.13 u，等電點(diǎn)為6.09，為疏水性蛋白質(zhì)。各氨基酸的數(shù)目和比例：丙氨酸(Ala，A)，13個(gè)，7.3%；精氨酸(Arg，R)，11個(gè)，6.2%；天冬氨酸(Asn，N)，8個(gè)，4.5%；天冬氨酸(Asp，D)，8個(gè)，4.5%；半胱氨酸(Cys，C)，1個(gè)，0.6%；谷氨酰胺(Gln，Q)，6個(gè)，3.4%；谷氨酸(Glu，E)，7個(gè)，4.0%；甘氨酸(Gly，G)，17個(gè)，9.6%；組氨酸(His，H)，2個(gè)，1.1%；異亮氨酸(Ile，I)，9個(gè)，5.1%；亮氨酸(Leu，L)，14個(gè)，7.9%；賴氨酸(Lys，K)，3個(gè)，1.7%；甲硫氨酸(Met，M)，6個(gè)，3.4%；苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))，14個(gè)，7.9%；脯氨酸(Pro，P)，8個(gè)，4.5%；絲氨酸(Ser，S)，15個(gè)，8.5%；蘇氨酸(Thr，T)，10個(gè)，5.6%；酪氨酸(Tyr，Y)，7個(gè)，4.0%；纈氨酸(Val，V)，18個(gè)，10.2%。帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為15個(gè)，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為14個(gè)。估計(jì)半衰期的排序：30 h(哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外)>20 h(酵母，體內(nèi))>10 h(大腸桿菌，體內(nèi))。不穩(wěn)定指數(shù)中的失穩(wěn)指數(shù)(Ⅱ)為18.11，因此將蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

2.3 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的親疏水性分析

圖5中的高峰值(正值)區(qū)域表示疏水區(qū)域，而負(fù)值的低谷區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性分析結(jié)果表明，最大疏水值約為2.75，在該多肽中說明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值約為-2.0，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的疏水性，說明該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)。

2.4 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果：GOR預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋[alphahelix(Hh)，15.25%]、β-片層[extendedstrand(Ee)，27.68%]、無規(guī)則卷曲[randomcoil(Cc)，57.06%]構(gòu)成(圖6、圖7)。從分布位點(diǎn)上看，C端、N端主要含有α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-片層，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL軟件對(duì)江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用Rasmol軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖形化分析。由圖8可知，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源三聚體。

2.6 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的亞細(xì)胞定位

用WoLFPsort在線軟件對(duì)江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，圖9結(jié)果顯示，定位于線粒體中的抗病反應(yīng)蛋白數(shù)量為6個(gè)，細(xì)胞核中的數(shù)量為5個(gè)，細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為2個(gè)，細(xì)胞外的數(shù)量為1個(gè)，表明江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因主要存在于線粒體和細(xì)胞核中。

2.7 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，江西鉛山紅芽芋與芋(Colocasiaesculenta)在一個(gè)大分支下，說明江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白在進(jìn)化上與C.esculenta的親緣關(guān)系較近，尤其是與C.esculentahypothetical peotein Taro_046195(MQM13270.1)在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

2.8 江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息

江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息見圖10。可以看出，江西鉛山紅芽芋與Colocasiaesculenta尤其是與C.esculentahypothetical peotein Taro_046195(MQM13270.1) 的保守結(jié)構(gòu)域較多，這也證實(shí)了江西鉛山紅芽芋與Colocasiaesculenta在進(jìn)化上與C.esculentahypothetical peotein Taro_046195(MQM13270.1)具有最高的親緣關(guān)系。

2.9 江西鉛山紅芽芋不同器官及球莖膨大不同時(shí)期植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的表達(dá)分析

以江西鉛山紅芽芋的GAPDH為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因在江西鉛山紅芽芋不同器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在不同組織器官中的表達(dá)情況差異顯著(圖11)，其中江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因在莖、球莖膨大末期的表達(dá)量最高。

3 討論

植物一般通過對(duì)病原菌效應(yīng)蛋白的特異性識(shí)別感知病原體的入侵，進(jìn)而快速、精準(zhǔn)激活免疫反應(yīng)，表達(dá)植物的抗病反應(yīng)蛋白[8]。培育具有廣譜而持久抗性的植物品種是育種學(xué)家追求的目標(biāo)。目前，關(guān)于植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因介導(dǎo)的抗性等已經(jīng)取得了大量新的研究成果[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因或過表達(dá)NBS-LRR(nudeotide-binding site-leucine-rich repeat， 含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù))基因可顯著提高植物的抗病性[10-11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，RPM1蛋白對(duì)表達(dá)Ⅲ型效應(yīng)蛋白AvrRpm1或AvrB的丁香假單胞菌pv番茄DC3000產(chǎn)生抗性，RIN13(RIN13s)的異位表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)菌的限制性機(jī)制，但矛盾的是卻消除了由RPM1控制的正常快速超敏反應(yīng)(HR)；與野生型植物相比，表達(dá)RIN13s的葉片在細(xì)菌輸送AvrRpm1后沒有發(fā)生電解質(zhì)滲漏或積累H2O2；RIN13的過度表達(dá)也改變了正常HR期間觀察到的轉(zhuǎn)錄譜。相比之下，RIN13基因敲除植物對(duì)DC3000(avrRpm1)的反應(yīng)具有與野生型植物相同的離子泄漏特征和HR時(shí)間，但未能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；在RIN13s/as植物中觀察到的修飾表型對(duì)AvrRpm1或AvrB的識(shí)別具有特異性，并且在與其他不相容病原體或強(qiáng)毒力DC3000分離物的攻擊后觀察到野生型[12]。本試驗(yàn)用同源克隆技術(shù)成功克隆了江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因序列，PCR結(jié)果表明，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因cDNA總長(zhǎng)度為 534 bp，G+C含量為58.05%；江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白由177個(gè)氨基酸組成，分子量為 19 369.13 u，等電點(diǎn)為6.09，為疏水性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋(15.25%)、β-片層(27.68%)、無規(guī)則卷曲(57.06%)構(gòu)成；三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源三聚體。由此可見，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體中；江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白在進(jìn)化上與Colocasiaesculenta的親緣關(guān)系較近，尤其是與C.esculentahypothetical peotein Taro_046195(MQM13270.1)在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因與其他物種[博落回(Macleayacordata)；蔓花生(Arachisduranensis)]也具有較高的相似性，表明它們?cè)谶M(jìn)化上的同源性較高，表明江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因與這些物種在進(jìn)化上存在較高程度的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)存在器官特異性，在莖和球莖膨大末期的表達(dá)量最高。因此，江西鉛山紅芽芋植物抗病反應(yīng)蛋白編碼基因的克隆，不僅為研究該基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，而且豐富了植物抗病反應(yīng)蛋白分子進(jìn)化和結(jié)構(gòu)功能研究的材料。