周毅 ，趙赫然 ，章曉云 ，張璇 ，陳躍平 ，陳雷雷

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530011； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510378；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378；5.廣東省中醫(yī)骨傷研究院，廣東 廣州 510378

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是臨床常見的骨科難治疾病，以髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙為臨床表現(xiàn)[1]。流行病學(xué)研究顯示，目前全世界有ONFH患者約2 000多萬例，其中，中國約有800萬例，并且以每年10～20萬例的速度增加[2-3]。ONFH與脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)凝血、成脂分化、細胞凋亡自噬、骨質(zhì)疏松、基因多態(tài)性等密切相關(guān)[4]。ONFH屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痹”“骨痿”范疇，與肝腎虧虛、外邪侵襲、氣滯血瘀密切相關(guān)，治療以活血化瘀為主，輔以通絡(luò)止痛、健脾化濕、補腎健骨等[5-6]。

生血補髓湯出自《傷科補要》，具有益氣補血、補髓壯骨之功。謝本淵等[7]運用生血補髓湯配合膏藥外敷治療早期ONFH，發(fā)現(xiàn)該方可通過補益氣血，調(diào)節(jié)免疫功能，改善股骨頭血運，取得良好療效。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS）對生血補髓湯湯劑進行成分鑒定，再運用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP）2.0進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，基于質(zhì)譜鑒定、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果和文獻分析，構(gòu)建生血補髓湯單體復(fù)方，進行體外實驗驗證，以探究生血補髓湯干預(yù)ONFH的作用機制。

1 儀器、試藥與細胞

Ultimate3000超高效液相色譜儀（賽默飛世爾有限公司），TripleTOF?5600（美國AB Sciex公司），Analyst TF1.7工作站（美國AB Sciex公司），5810R型離心機（SIGMA公司），DMI3000B型倒置顯微鏡（德國Leica公司），CFX96 Touch型熒光定量PCR儀（美國BioRad公司），T100型梯度PCR儀（美國BioRad公司）。

TRAP染色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1050-50T），CCK-8試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號KGA317-1），胎牛血清（依科賽生物科技有限公司，批號FSS100），巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，批號CB34），小鼠RANKL（派普泰克生物科技有限公司，貨號315-11C），活性氧（ROS）檢測試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，批號CA1410），總RNA小量提取試劑盒（廣州億濤生物科技有限公司，批號EK1300）， TB Green?Premix Ex TaqTMqPCR Kit（Takara，批號RR420Q），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司，批號AG11706），高糖DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾有限公司，批號PM150210P）。對照品阿魏酸、綠原酸、梓醇、芍藥苷、槲皮素、山柰酚，索萊寶生物科技有限公司，批號分別為SF8030、SC8210、SC8150、SP8030、SQ8030、SB8020，純度均不低于98%。

RAW264.7細胞，武漢普諾賽公司，批號CL-0190。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

生血補髓湯（生地黃12 g，白芍9 g，川芎6 g，黃芪9 g，鹽牛膝9 g，鹽杜仲9 g，紅花5 g，南五加皮9 g，當歸9 g，鹽續(xù)斷9 g）飲片，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥房，加1 000 mL水浸泡30 min后煮沸，繼續(xù)煎煮30 min，得頭煎液300 mL，藥渣加500 mL水，同法獲得二煎液200 mL，合并2次煎液，室溫放涼，混勻后取50 mL樣品，1 000 r/min離心20 min，取上清液，即得。

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫40 ℃，上樣量3 μL，流速400 μL/min，流動相正離子模式為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），負離子模式為2 mmol/L乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.5 min，5%B；1.5～2.5 min，10%B；2.5～14.00 min，10%～40%B； 14.00～22.00 min， 40%～95%B； 22.00～25.00 min，95%B；25.00～26.00 min，95%～5%B；26.00～30.00 min，5%B）。

采用Analyst TF 1.7軟件中的IDA功能進行一、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)篩選出強度最強且＞100的分子離子，以獲得相應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。一級質(zhì)譜采集范圍m/z 50～1 200，轟擊能量30 eV，每50 ms 10張二級譜圖。電噴霧離子源（ESI），霧化氣壓60 psi，輔助氣壓60 psi，氣簾氣壓35 psi，離子源溫度650 ℃，噴霧電壓5.0 kV（正）、-4.0 kV（負）。

2.3 活性成分鑒定

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MSDIAL4.6軟件進行峰尋找、峰對齊等處理，利用前期建立的生血補髓湯10味中藥化學(xué)成分、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，同時整合Metlin、MassBank、MoNA和HMDB公共數(shù)據(jù)庫，扣除空白樣品得到鑒定結(jié)果。鑒定過程中進行一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對（相對誤差＜10 ppm），在此基礎(chǔ)上通過二級質(zhì)譜分析及文獻[8-17]比對，進一步對活性成分進行確認。

2.4 生血補髓湯治療股骨頭壞死潛在靶點

將初步鑒定得到生血補髓湯活性成分導(dǎo)入TCMIP2.0，使用活性成分靶點預(yù)測功能，以相似性分數(shù)≥0.8為標準進行篩選[18]；以“Osteonecrosis of the Femoral Head”“Femur Head Necrosis”為關(guān)鍵詞，通過“疾病相關(guān)分子挖掘及其功能分析模塊”收集相關(guān)靶點；使用“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”版塊的“疾病-方劑”網(wǎng)絡(luò)模塊，分別上傳生血補髓湯和ONFH的候選靶點群。以度值（degree）、介度值（betweenness）和緊密度（closeness）作為篩選指標，以三者均大于中位數(shù)的節(jié)點作為分析靶點。同時，選取該靶點群中的生血補髓湯和ONFH共有靶點作為生血補髓湯治療ONFH靶點。

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將核心靶點上傳到STRING11.0平臺進行蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，并將TSV格式文件輸入Cytoscape3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲學(xué)分析，計算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的度值和介度值。度值越大表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越強，介度值越大表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中發(fā)揮的作用越重要，即靶點越處于網(wǎng)絡(luò)中心。

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，通過GO富集分析核心靶點的生物過程，KEGG富集分析其相關(guān)通路，選取P＜0.05的富集結(jié)果，并使用R語言軟件繪圖。

2.7 多維網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)藥物活性成分及其預(yù)測靶點，結(jié)合KEGG通路富集分析結(jié)果，采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建生血補髓湯治療ONFH的中藥-成分-靶點-通路多維網(wǎng)絡(luò)，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。

2.8 細胞實驗

2.8.1 生血補髓湯單體復(fù)方制備

根據(jù)質(zhì)譜分析和TCMIP預(yù)測結(jié)果，選取滿足以下條件的單體組成新的單體復(fù)方用于實驗：①生血補髓湯組方藥物的主要活性成分或質(zhì)量標志物且在質(zhì)譜分析中檢測出的成分，如梓醇為生地黃質(zhì)量控制的指標性成分，阿魏酸為當歸和川芎的主要活性成分[19]，綠原酸為五加皮的主要活性成分[20-21]，芍藥苷為白芍的主要活性成分[22]；②TCMIP預(yù)測結(jié)果中存在較多治療靶點的活性成分（如槲皮素、山柰酚均有13個靶點）；③排除氨基酸、核苷類、生物堿類廣泛存在于各種藥材中不具備代表性的活性成分。

參考活性成分使用說明書制備生血補髓湯單體復(fù)方。①低濃度：梓醇1.5 μg/mL、芍藥苷17 μg/mL、阿魏酸1.25 μg/mL、綠原酸17.5 μg/mL、槲皮素15 μg/mL、山柰酚14 μg/mL；②中濃度：梓醇3 μg/mL、芍藥苷31 μg/mL、阿魏酸2.5 μg/mL、綠原酸35 μg/mL、槲皮素30 μg/mL、山柰酚28 μg/mL；③高濃度：梓醇6 μg/mL、芍藥苷62 μg/mL、阿魏酸5 μg/mL、綠原酸70 μg/mL、槲皮素60 μg/mL、山柰酚56 μg/mL。

2.8.2 CCK-8法檢測細胞活力

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，以6×103個/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞液，培養(yǎng)過夜。實驗分為空白對照組（含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM）、RANKL組（RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM）和單體復(fù)方組（不同濃度生血補髓湯單體復(fù)方+RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM），每組4個復(fù)孔，干預(yù)6、12、24 h，每孔加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下避光培養(yǎng)1 h，于酶標儀450 nm波長處檢測各孔吸光度（OD值）。

2.8.3 分組及干預(yù)

取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，以6×103細胞量接種到6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為空白對照組（含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM）、RANKL組（RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM）、高濃度單體復(fù)方組（高濃度生血補髓湯單體復(fù)方+RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基H-DMEM），過夜后按以上分組進行破骨細胞誘導(dǎo)，持續(xù)5 d。

2.8.4 TRAP染色檢測細胞破骨分化

各組細胞于12孔板干預(yù)5 d，按TRAP染色試劑盒使用說明進行染色，置于顯微鏡下觀察、拍照，多核（細胞核≥3個）、胞體較大、酒紅色細胞為成熟破骨細胞。

2.8.5 活性氧清除實驗

各組細胞干預(yù)48 h，按1∶800比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，去除細胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μL稀釋好的DCFH-DA，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。采用Image J軟件進行圖像分析，計算平均熒光強度。

2.8.6 RT-qPCR檢測相關(guān)靶點mRNA表達

各組細胞干預(yù)1、3、5 d，收集RNA，進行RT-qPCR，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。引物購自鉑尚生物技術(shù)有限公司，各基因引物信息見表1。

表1 RT-qPCR各基因引物信息

2.8.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，GraghPad9.0軟件進行繪圖。數(shù)據(jù)以表示，符合正態(tài)分布且方差齊的2組數(shù)據(jù)用非配對t檢驗，多組數(shù)據(jù)用方差分析，并采用Bonferroni法進行兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生血補髓湯活性成分

生血補髓湯溶液正離子和負離子全掃描模式質(zhì)譜圖見圖1。根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果得到質(zhì)譜碎片，將理論值與實測值進行比對（計算相對誤差），正、負離子模式下鑒別出46個活性成分，見表2。

表2 生血補髓湯化學(xué)成分鑒定

圖1 生血補髓湯溶液正離子和負離子全掃描模式質(zhì)譜圖

3.2 生血補髓湯治療股骨頭壞死靶點

將篩選得到的活性成分按所屬藥物歸類，其中生地黃8個、白芍5個、川芎3個、當歸9個、杜仲9個、紅花8個、牛膝11個、黃芪17個、五加皮12個、續(xù)斷1個，合并、去重后獲得46個活性成分，得到預(yù)測靶點共732個。檢索獲得ONFH靶點1 386個。篩選得到生血補髓湯和ONFH靶點群中度值、介度值和緊密度均大于中位數(shù)的核心節(jié)點317個，其中二者交集靶點有48個，即為生血補髓湯治療ONFH靶點。

3.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將48個交集靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，使用CytoNCA插件，以度值、介度值為參數(shù)進行分析。PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。度值和介度值排名前20位的靶點有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、人內(nèi)源性肌動蛋白（ACTB）、蛋白激酶1（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、胰島素基因（INS）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤壞死因子（TNF）、HRas原癌基因（HRAS）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細胞介素6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、白細胞介素1β（IL-1β）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、轉(zhuǎn)錄因子p50（NFKB1）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、雄激素受體（AR）。

圖2 生血補髓湯治療ONFH靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

3.4 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

GO富集分析獲得生物過程（biological process，BP）條目共1 383個（P＜0.05），主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和信號傳導(dǎo)過程等相關(guān)，前20個條目見圖3。KEGG通路富集分析得到相關(guān)通路共157條（P＜0.05），主要涉及TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K信號通路、HIF-1信號通路，前20條通路見圖4。

圖3 生血補髓湯治療ONFH靶點GO BP富集分析

圖4 生血補髓湯治療ONFH靶點KEGG通路富集分析

3.5 多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

將48個交集靶點相關(guān)活性成分和藥物及主要KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-成分-靶點-通路多維網(wǎng)絡(luò)，見圖5。該網(wǎng)絡(luò)中包括9個藥物、26個活性成分節(jié)點、48個作用靶點及靶點富集的20條信號通路，共有478條邊。分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，節(jié)點平均度值為13.31，節(jié)點度值排名前5位的活性成分是綠原酸、槲皮素、木犀草素、山柰酚、腺苷。

圖5 生血補髓湯治療ONFH中藥-成分-靶點-通路多維網(wǎng)絡(luò)

3.6 實驗驗證結(jié)果

3.6.1 單體復(fù)方濃度對RAW264.7細胞活力的影響

與RANKL組比較，RAW264.7細胞經(jīng)低濃度、中濃度、高濃度生血補髓湯單體復(fù)方處理6、12、24 h，其活力無明顯變化（P＞0.05），見表3。選取高濃度單體復(fù)方作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度。

表3 各組不同時點RAW264.7細胞活力比較（，OD值）

表3 各組不同時點RAW264.7細胞活力比較（，OD值）

組別空白對照組RANKL組低濃度單體復(fù)方組中深度單體復(fù)方組高濃度單體復(fù)方組n 3 3 3 3 3 6 h 0.256±0.003 0.424±0.002 0.456±0.001 0.476±0.007 0.442±0.004 12 h 0.252±0.002 0.545±0.005 0.565±0.003 0.565±0.006 0.548±0.005 24 h 0.248±0.001 0.706±0.009 0.751±0.012 0.714±0.014 0.678±0.005

3.6.2 單體復(fù)方對RAW264.7細胞破骨分化的影響

RANKL組顯微鏡下可見多核細胞、單核細胞，其中破骨細胞體積較大，胞漿豐富、呈酒紅色，多核。與空白對照組比較，RANKL組TRAP陽性細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01）；與RANKL組比較，高濃度單體復(fù)方組陽性細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.01）。見圖6、表4。

圖6 各組RAW264.7細胞破骨分化（TRAP染色，×40）

表4 各組RAW264.7細胞TRAP陽性數(shù)量比較（）

表4 各組RAW264.7細胞TRAP陽性數(shù)量比較（）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與RANKL組比較，**P＜0.01

TRAP+nuclei 0 452.7±19.7##55.7± 9.4**組別空白對照組RANKL組高濃度單體復(fù)方組n3 3 3

3.6.3 單體復(fù)方抑制RANKL誘導(dǎo)的活性氧活性

各組RAW264.7細胞干預(yù)48 h，用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS含量。與空白對照組比較，RANKL組細胞熒光強度明顯增強，表明RAW264.7細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS（P＜0.05）；與RANKL組比較，高濃度單體復(fù)方組細胞有少量熒光（P＜0.05），表明生血補髓湯單體復(fù)方可顯著抑制RAW264.7細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。見表5。

表5 各組RAW264.7細胞ROS含量比較（，熒光強度）

表5 各組RAW264.7細胞ROS含量比較（，熒光強度）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與RANKL組比較，*P＜0.05

ROS 11.82±0.86 21.72±2.21#12.84±0.96*組別空白對照組RANKL組高濃度單體復(fù)方組n 3 3 3

3.6.4 單體復(fù)方對RAW264.7細胞IL6、PTGS2、TNFα、RELAmRNA表達的影響

KEGG富集分析結(jié)果提示，TNF信號通路是富集程度最高且與生血補髓湯治療ONFH密切相關(guān)的通路，因此，選取該通路相關(guān)靶點IL6、PTGS2、TNFα、RELA，檢測其mRNA表達。分別于干預(yù)1、3、5 d檢測各組細胞IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。干預(yù)1 d，與RANKL組比較，高濃度單體復(fù)方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6 mRNA表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；干預(yù)3 d，與RANKL組比較，高濃度單體復(fù)方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6、TNFα mRNA表達水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；干預(yù)5 d，與RANKL組比較，高濃度單體復(fù)方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表6。

表6 各組RAW264.7細胞干預(yù)不同時點IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達比較（）

表6 各組RAW264.7細胞干預(yù)不同時點IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達比較（）

注：與RANKL組同時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01

RELA 1.002±0.068 1.063±0.340 1.025±0.223 1.037±0.053 2.493±0.192 21.020±0.447 1.776±0.224 2.740±0.078 12.784±1.166**組別空白對照組RANKL組高濃度單體復(fù)方組時間1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 IL6 0.158±0.022 1.038±0.261 1.076±0.432 1.003±0.080 8.715±1.025 26.751±5.436 0.554±0.042**3.366±0.354*5.539±2.179*PTGS2 1.003±0.072 1.000±0.014 1.087±0.394 1.321±0.142 0.375±0.011 14.801±0.544 2.813±1.461 9.245±0.489**4.643±1.478**TNFα 1.015±0.166 1.002±0.060 1.008±0.129 1.525±0.087 8.751±0.544 5.607±0.411 0.926±0.203 0.380±0.024**3.252±0.467*

4 討論

依據(jù)臨床分期、病灶范圍和位置，ONFH可予髖關(guān)節(jié)置換術(shù)和保髖治療，保髖治療包括手術(shù)保髖和非手術(shù)保髖。中醫(yī)藥治療在預(yù)防股骨頭塌陷、壞死，延緩髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的時間有獨特優(yōu)勢，中國ONFH病例的中醫(yī)藥治療率達72%[23]。ONFH病理過程包括股骨頭發(fā)生缺血壞死，以及之后出現(xiàn)的壞死區(qū)的修復(fù)[24]。組織病理學(xué)研究結(jié)果顯示，壞死區(qū)骨組織骨小梁表面成骨細胞數(shù)量顯著減少、骨形成功能減弱，而破骨細胞數(shù)量異常增加、骨吸收功能增強[25-26]。在ONFH的早期階段可發(fā)現(xiàn)破骨細胞活性呈顯著增強狀態(tài)，若不加干預(yù)，隨著破骨細胞活性升高，其發(fā)展成晚期ONFH將極為迅速[27]。破骨細胞在分化成熟過程中會分泌大量炎性因子，升高骨髓微環(huán)境中炎癥水平，而這些炎性因子又可進一步促進破骨分化，炎性因子與破骨分化存在密切聯(lián)系[28-30]。在ONFH早期，炎性因子大量釋放，導(dǎo)致免疫細胞浸潤大血管區(qū)域，誘發(fā)血管區(qū)域的免疫炎性反應(yīng)，繼續(xù)損害血管，加重病情[31-32]。

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析生血補髓湯46種活性成分，并使用TCMIP2.0對鑒定的活性成分進行分析，找到生血補髓湯中關(guān)鍵成分如阿魏酸、綠原酸、芍藥苷、梓醇、槲皮素、山柰酚等。阿魏酸是當歸、川芎的主要活性成分[19]。吳建良等[33]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能降低一氧化氮濃度，效果與藥物濃度呈正相關(guān)，可有效抑制炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α表達。綠原酸是刺五加、五加皮、紅毛五加皮的主要活性成分，具有抗氧化和抗炎特性[20-21]。綠原酸可通過清除細胞內(nèi)ROS，抑制P-p38 MAPK磷酸化和上調(diào)NF-κB信號通路而抑制IL-8產(chǎn)生，從而起到抗炎作用[34]。芍藥苷是白芍的主要有效成分，其鎮(zhèn)痛作用可能與升高血清和大腦皮層中β-內(nèi)啡肽水平、減少大腦皮層前列腺素E2（PGE2）生成或釋放有關(guān)[22，35]。梓醇是生地黃質(zhì)量篩選的主要活性成分，在“成骨-破骨”共育體系中促進成骨細胞增殖，增強成骨細胞堿性磷酸酶活性，抑制破骨細胞活性，上調(diào)成骨細胞雌激素受體β mRNA表達[36-37]。槲皮素類黃酮成分包括槲皮素及山柰酚等，槲皮素類成分具有抗氧化、抗炎等藥理作用[38]。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞RAW264.7中PGE2的產(chǎn)生有明顯抑制作用[39]。

根據(jù)活性成分對應(yīng)的靶點進行分析，構(gòu)建藥物-成分-靶點-通路多維網(wǎng)絡(luò)，對治療靶點進行GO和KEGG富集分析，得到生血補髓湯治療ONFH的信號通路，其中富集最顯著且與ONFH密切相關(guān)的是TNF信號通路，IL6、PTGS2、TNF、RELA是多維網(wǎng)絡(luò)中與該信號通路密切相關(guān)的靶點。炎性因子如IL-6、IL-4和TNF-α可能是ONFH疼痛癥狀的主要誘因，ONFH患者血清TNF-α和IL-6水平較健康志愿者偏高[31，40]。TNF-α在炎癥條件下直接或通過增加成骨細胞和基質(zhì)細胞的RANKL和M-CSF表達刺激破骨細胞形成和激活[41]。研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死標志基因PTGS2主要參與炎癥免疫反應(yīng)，這可能是疾病中期疼痛加重、功能受限的原因之一[42]。ROS是破骨細胞分化和形成的關(guān)鍵因素，抗氧化劑可以通過抑制ROS水平和抑制破骨細胞延緩ONFH進展[43]。Cheng等[44]研究發(fā)現(xiàn)，可以通過抑制PTGS2和PI3K-Akt途徑抑制ROS產(chǎn)生并發(fā)揮抑制破骨細胞活性的作用。RELA能夠阻斷RANKL誘導(dǎo)的JNK-Bid凋亡通路，從而促進破骨細胞分化[45]。TNF信號通路具有調(diào)節(jié)破骨細胞活性及骨吸收的作用，其中分離出的糖蛋白骨保護素（OPG）對骨形成也具有積極的保護作用[46]。而RANKL/RANK/OPG信號通路在調(diào)節(jié)骨重塑、破骨細胞分化和多種病理狀態(tài)過程中起著關(guān)鍵作用。由于其能夠調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，以及骨髓間充質(zhì)干細胞中成骨細胞和成脂的異常轉(zhuǎn)分化，因此被認為在ONFH的分子機制中起著核心作用[47]。

以上結(jié)果提示，生血補髓湯治療ONFH靶點主要與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)，相關(guān)靶點主要富集在炎癥相關(guān)信號通路，而炎癥反應(yīng)是ONFH中晚期的典型表現(xiàn)。本研究采用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞破骨分化模型，并予生血補髓湯單體復(fù)方進行干預(yù)，同時檢測RAW264.7細胞破骨分化過程中ROS含量及IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。結(jié)果顯示，生血補髓湯單體復(fù)方可顯著減少RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞破骨分化中成熟破骨細胞數(shù)量、細胞漿內(nèi)ROS含量及IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對生血補髓湯中的活性成分進行快速、全面識別，可為進一步研究生血補髓湯干預(yù)ONFH及闡明生血補髓湯藥理作用提供依據(jù)；同時，基于TCMIP2.0使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法和細胞實驗驗證探究其治療ONFH的作用機制，可為后續(xù)研究提供指導(dǎo)。