何皎，孫曉菲，潘琳，田慧敏,陳霞

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南科技大學(xué)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品微生物河南省工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023)

香菇在世界食用菌中排行第二，在食用和藥用方面都具有較高的價(jià)值，香菇多糖為香菇提取物中最重要的活性成分之一[1-2]。在調(diào)控機(jī)體免疫、抗菌和抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)和抗氧化等方面的作用顯著[3]。微波輔助法為目前獲取香菇多糖的較優(yōu)方法[4-5]。目前，納米級(jí)微膠囊的制備技術(shù)已經(jīng)逐漸滲透到醫(yī)藥、食品、生物等領(lǐng)域中。微膠囊可以很好地隔絕藥物與外界的接觸，達(dá)到保護(hù)藥物、減緩其變性的目的[6-7]，并且外層的壁材能夠起到控制藥物釋放的目的，使藥物的釋放速度能夠人為控制[8]，從而提高藥物的療效與作用。本實(shí)驗(yàn)采用β-環(huán)糊精作為壁材，香菇多糖作為芯材制備微膠囊，旨在最大限度地發(fā)揮香菇多糖的生物活性[9-10]。

本研究以微波輔助提取制備香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊，以期為開(kāi)發(fā)新型香菇多糖防腐劑及抗衰老保健品提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的干香菇購(gòu)自洛陽(yáng)白云山五馬寺村；β-環(huán)糊精購(gòu)自綠葉生物科技有限公司。

1.2 菌種

沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等菌種為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品的制備

將干香菇粉碎，過(guò)40目篩，置于棕色瓶中備用。

2.2 微波提取香菇多糖的提取工藝流程[11-13]

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份過(guò)40目篩后的香菇粉各1 g分別于500 mL燒杯中，按預(yù)設(shè)料液比各加入適量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，在預(yù)設(shè)微波功率的條件下處理相應(yīng)時(shí)間。處理好的樣品得濾液，量出其體積并倒入燒杯中，按其體積的3倍加入無(wú)水乙醇，4 ℃醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，取沉淀于不同的燒杯中，加蒸餾水在100 mL容量瓶中進(jìn)行定容，得到含香菇多糖的溶液后分裝進(jìn)行冷凍干燥。

2.3 抑菌與抗氧化雙活性檢測(cè)[14-16]

2.3.1 培養(yǎng)基制備與菌種活化

BPA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基配方均參考現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第二版。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌用各自培養(yǎng)基復(fù)蘇備用。

2.3.2 抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定抑菌活性，在帶孔混菌平板中按順序加入 100 μL樣品，以100 μL無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，100 μL相應(yīng)濃度的尼泊金甲脂醇溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè) 3個(gè)平行，平板于相應(yīng)溫度恒溫培養(yǎng) 12～24 h，電子游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)。

2.3.3 抗氧化測(cè)定

2.3.3.1 DPPH·清除能力測(cè)定

吸取2.0 mL待測(cè)液，加入0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液4.0 mL，25 ℃避光反應(yīng)30 min，以無(wú)菌水調(diào)零，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，用無(wú)菌水代替DPPH所測(cè)值為吸光度值A(chǔ)2，用無(wú)菌水代替待測(cè)液所測(cè)值為吸光度值A(chǔ)0，同時(shí)以同濃度的維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)3次。

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2.3.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定

試管中依次加入樣品溶液2 mL、9 mol/L H2O2溶液2 mL，室溫靜置10 min，再加入9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL，混勻室溫靜置 40 min，于510 nm 處測(cè)吸光度A1；用相同濃度乙醇替代水楊酸-乙醇溶液，其余條件不變測(cè)得A2；同濃度乙醇替代樣品溶液，其余條件不變測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2.4 微波提取香菇多糖的提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 微波功率對(duì)香菇多糖得率的影響

提取工藝流程依據(jù)2.2，固定料液比為1∶30，微波時(shí)間為2 min，分別在微波功率為0，119，238，385，539 W的條件下進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 微波功率對(duì)香菇多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of lentinan

由圖1可知，當(dāng)微波功率為119 W時(shí)，香菇多糖得率達(dá)到最高，為7.95%，故選擇微波功率為119 W進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.2 微波時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響

在料液比1∶40、微波功率119 W的條件下處理2，4，6，8，10 min，其余實(shí)驗(yàn)操作條件同2.4.1。

圖2 微波時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the yield of lentinan

由圖2可知，當(dāng)微波時(shí)間為4 min時(shí)，香菇多糖得率達(dá)到最高，時(shí)間超過(guò)4 min時(shí)，香菇多糖得率逐漸下降，故選擇微波提取時(shí)間4 min進(jìn)行優(yōu)化最適宜。

2.4.3 料液比對(duì)香菇多糖得率的影響

固定微波功率119 W，處理2 min，料液比分別為為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，其余實(shí)驗(yàn)操作條件同2.4.1。

圖3 料液比對(duì)香菇多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of lentinan

由圖3可知，料液比為1∶40時(shí)，香菇多糖得率達(dá)到最大，故選擇料液比1∶40進(jìn)行優(yōu)化最適宜。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，確定料液比為1∶30、1∶40、1∶50；微波功率為0，119，238 W；微波時(shí)間為2，4，6 min。利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，測(cè)定樣品在490 nm處的吸光度，得出香菇多糖得率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析所得數(shù)據(jù)并擬合多元回歸方程：Y=9.59-1.15A-1.08B+0.016C-1.00AB+0.23AC-0.22BC-1.61A2-0.85B2-1.73C2。由方程一次項(xiàng)系數(shù)可知，影響香菇多糖得率最大的因素是料液比，其次是微波功率和微波時(shí)間。

2.5.1β-環(huán)糊精香菇多糖微膠囊的制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取適量β-環(huán)糊精4份，溶解于25 mL蒸餾水中，50 ℃恒溫?cái)嚢璞３?0 min后，分別加入預(yù)設(shè)香菇多糖。分別加入不同量乳化劑吐溫80，置于磁力攪拌器中，設(shè)置溫度為50 ℃，保持恒定轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得乳狀液。將所得不同乳化劑添加量的乳狀液分別倒入單個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，放入冷凍干燥機(jī)，進(jìn)行冷凍干燥。將凍干后所得到的固體物質(zhì)研磨成細(xì)粉狀，裝瓶備用，即得香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊。

2.5.2 不同乳化劑添加量的香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的制備

固定包埋時(shí)間為30 min，固形物質(zhì)量濃度為20 g/dL，壁材和芯材比例為1∶3，乳化劑添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，以枯草芽孢桿菌為指示菌，抑菌圈直徑作為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 乳化劑添加量對(duì)微膠囊抑菌活性的影響Fig.4 Effect of the addition amount of emulsifier on the antibacterial activity of microcapsules

由圖4可知，當(dāng)乳化劑添加量為0.3%時(shí)，微膠囊的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為16.7 mm。

2.5.3 不同固形物質(zhì)量濃度的香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的制備

固定乳化劑添加量為0.2%，包埋時(shí)間為30 min，壁材和芯材比例為1∶3，分別在固形物質(zhì)量濃度為10，20，30，40 g/dL的條件下制備香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊，其余步驟同2.5.1。

圖5 固形物質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊抑菌活性的影響Fig.5 Effect of mass concentration of solids on the antibacterial activity of microcapsules

由圖5可知，香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的抑菌活性在固形物質(zhì)量濃度為20 g/dL時(shí)達(dá)到最大值，其抑菌圈直徑為16.4 mm。

2.5.4 不同包埋時(shí)間的香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的制備

固定乳化劑添加量為0.2%，固形物質(zhì)量濃度為20 g/dL，壁材和芯材比例為1∶3，分別在包埋時(shí)間為20，30，40，50 min的條件下制備香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊，其余步驟同2.5.1。

圖6 包埋時(shí)間對(duì)微膠囊抑菌活性的影響Fig.6 Effect of embedding time on the antibacterial activity of microcapsules

由圖6可知，隨著包埋時(shí)間的增加，香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的抑菌活性不斷增大，在包埋時(shí)間為40 min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值17.9 mm。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊工藝實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)確定乳化劑添加量的梯度范圍為0.2%、0.3%、0.4%；包理時(shí)間的梯度范圍為30，40，50 min；固形物質(zhì)量濃度為10，20，30，40 g/dL。利用響應(yīng)面軟件中的 Box-Behnken 功能設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，以枯草芽孢桿菌為指示菌，使用抑菌圈直徑作為響應(yīng)值。

得到回歸方程：Y=17.04-0.21D-0.18E-0.12F+0.010DE+0.013DF+0.033EF-0.50D2-0.92E2-1.09F2。

2.6.1 回歸模型的方差分析

對(duì)回歸方程方程進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回歸模型方差分析結(jié)果Table 2 The variance analysis results of regression model

2.6.2 優(yōu)化提取參數(shù)及驗(yàn)證

通過(guò)軟件中的 Optimization 程序優(yōu)化得到：乳化劑添加量0.38%、包埋時(shí)間39 min、固形物質(zhì)量濃度19.5 g/dL。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整最佳工藝參數(shù)為乳化劑添加量0.38%、包埋時(shí)間39 min、固形物質(zhì)量濃度20 g/dL，抑菌圈直徑理論值為16.59 mm。通過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到抑菌圈大小為17.07 mm，與預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明按照模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可行。由表2可知，擬合方程的相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.975 4，說(shuō)明該模型能夠解釋97.54%的響應(yīng)值的變化。相關(guān)系數(shù)R2=0.989 3>0.9，說(shuō)明該模型擬合程度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)制備工藝參數(shù)進(jìn)行分析以及預(yù)測(cè)。該模型中D、E、F、D2、E2、F2項(xiàng)達(dá)到顯著水平。影響香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的抑菌活性的最顯著因素為乳化劑添加量。

圖7 固型物質(zhì)量濃度、乳化劑添加量、包埋時(shí)間的交互作用對(duì)抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 The response surface diagrams and contour lines of effect of interaction of mass concentration of solids, emulsifier addition amount and embedding time on the antibacterial zone diameter

3 結(jié)論與討論

3.1 香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的掃描電鏡觀察

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳工藝制備的香菇多糖納米膠囊的掃描電鏡圖。采用掃描電子顯微鏡測(cè)得最佳條件下納米微粒粒徑的形態(tài),見(jiàn)圖8。

圖8 香菇多糖納米微膠囊的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrograph of lentinan nanocapsules

3.2 香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的抑菌抗氧化效果

香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊及相應(yīng)成分抑菌性對(duì)比見(jiàn)表3，香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊及相應(yīng)成分抗氧化對(duì)比見(jiàn)表4。

表3 香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊及相應(yīng)成分抑菌性對(duì)比Table 3 Antibiosis comparison of lentinan β-cyclodextrin microcapsules and the corresponding components mm

表4 香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊及相應(yīng)成分抗氧化對(duì)比Table 4 Antioxidant comparison of lentinan β-cyclodextrin microcapsules and the corresponding components %

結(jié)果表明，微波提取香菇多糖的最佳工藝條件為料液比1∶40、微波提取時(shí)間4 min、微波功率119 W。香菇多糖β-環(huán)糊精微膠囊的最佳制備工藝為乳化劑添加量0.38%、包埋時(shí)間39 min、固形物質(zhì)量濃度19.5 g/dL。得出納米級(jí)微膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用較弱，同時(shí)具有較好的抗氧化性。所制備的微膠囊抑菌活性和抗氧化活性與香菇多糖相比有增幅。通過(guò)微波獲得的香菇多糖制作的微膠囊可作為藥物和功能性食品工業(yè)中天然防腐劑與抗氧化劑組分，作為新型天然抗菌抗氧化劑使用具有巨大潛力。因此，未來(lái)應(yīng)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能評(píng)估進(jìn)一步研究。