牟飛燕，凌 荔，肖鈞文，李 良，董孝元，陳茂彬，張 玉，方尚玲

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.湖北省黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430068）

清香型白酒以“汾酒、黃鶴樓酒”為代表，酒曲主要原料是大麥與豌豆，中國傳統(tǒng)白酒以“曲”為發(fā)酵劑（啟動物），釀造過程直接受大曲中微生物和酶系的影響。主要起作用的微生物類型是酵母菌、霉菌、細菌以及放線菌[1]。白酒發(fā)酵過程中酵母菌主要作用是產(chǎn)酒和生香，可以將原料中的一部分糖轉(zhuǎn)化為乙醇，同時生成酯類、醇類、醛酮類、芳香族化合物等物質(zhì)，直接影響酒的外觀、香味以及口感。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，是一類可以催化α-D-吡喃葡糖基之間1-4 糖苷鍵水解的酶類，能使淀粉絕大部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖從而提高淀粉利用率，是衡量大曲質(zhì)量的重要指標[2]。蛋白酶分為中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，蛋白酶可以提高產(chǎn)酒率，產(chǎn)物氨基酸可參與香氣物質(zhì)的合成和促進酵母生長[3]。微生物代謝是蛋白酶的主要來源。微生物產(chǎn)蛋白酶活的高低會直接影響到微生物的作用以及大曲的質(zhì)量[4]。

微生物代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)生的具有特征風味的化合物是中國白酒風味特征形成的主要影響因素[5]。酵母菌的發(fā)酵特性因其菌株的不同存在明顯差異，菌株的不同會導(dǎo)致利用的底物不同，生成的風味化學物質(zhì)不同，因此固態(tài)發(fā)酵出的產(chǎn)物的特征香味成分會存在顯著區(qū)別。本研究以湖北某酒廠的清香型大曲為原料，篩選出產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的酵母菌，對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測，以研究酵母菌的產(chǎn)酶特性和發(fā)酵特性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：清香型大曲，湖北某酒廠。

分離純化培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

篩淀粉酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、NaCl 5 g、蛋白胨10 g、可溶性淀粉2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌15 min。

種子液培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、可溶性淀粉2 g、蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（高粱固態(tài)培養(yǎng)基）：在一定量的高粱中加入60%的沸水潤糧20 h 后在121 ℃下蒸糧50 min，用開水復(fù)水20 min，127 ℃下再次蒸糧20 min 后取出，加入15 μ g 的淀粉酶并在95 ℃保溫反應(yīng)1 h，再加入250 μ g 的糖化酶并在55 ℃下保溫反應(yīng)2 h得到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

試劑及耗材：標準葡萄糖溶液（1 g/L）、DNS 溶液、酪氨酸溶液、福林酚溶液、三氯乙酸溶液、稀碘液等。

儀器設(shè)備：高速臺式冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific 公司；粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

采用稀釋涂布平板分離法[6]從大曲中分離菌種：稱取10 g 粉碎后的清香型大曲加入到滅菌后的0.9%生理鹽水中，搖床搖20 min后過濾得到10-1的樣品，用0.9%生理鹽水對10-1的樣品進行稀釋，得到10-2、10-3、10-4、10-5樣品液，選擇合適的梯度，取150 μ L 的樣品液涂布在固體YPD 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24～48 h。選擇生長狀況良好，菌落形態(tài)顯著的菌種，采用劃線平板分離法對其進行純化。

1.2.2 種子液的配制與固態(tài)發(fā)酵

取純化后的單菌落，接種于滅菌后的液體YPD培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)3 d，得到種子液；采用三角瓶培養(yǎng)法進行固態(tài)模擬發(fā)酵，將種子液以5%的比例接種于裝于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中（50 g 高粱），30 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶功能菌篩選

經(jīng)分離純化的菌種通過透明圈法進行初篩，將活化的酵母點種于篩淀粉酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h 后將稀碘液滴在菌落周圍，菌落周圍產(chǎn)生透明圈證明該菌產(chǎn)淀粉酶。

采用DNS 法[7]對菌種的產(chǎn)淀粉酶活力進行檢測，稍作修改。（1）標準曲線的制作：由標準葡萄糖溶液（1 g/L）稀釋得到0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1 g/L 標準糖組，分別取標準糖組中不同濃度的糖液0.5 mL，加入1.5 mL DNS 溶液后在沸水中煮沸15 min，冷卻后加入10.5 mL 蒸餾水，在550 nm 處測定其OD 值，每個濃度做三個平行，以葡萄糖濃度為橫坐標，以O(shè)D 值為縱坐標制作標準曲線；（2）樣品粗酶液淀粉酶活力的測定：取模擬固態(tài)發(fā)酵物2.5 g，加水50 mL，靜置1 h 后，8000 r/min 離心5 min 得到粗酶液，取粗酶液1 mL、加入9 mL 的淀粉緩沖液，于50 ℃下恒溫水浴反應(yīng)20 min，吸取反應(yīng)液0.5 mL，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴15 min，冷卻后加入3.5 mL 蒸餾水，搖勻在550 nm 處測吸光度。對照組處理方法除了將粗酶液1 mL 換成蒸餾水1 mL外，其余步驟與樣品處理相同。

1.2.4 產(chǎn)中性蛋白酶菌株篩選

采用福林酚法[8]對菌種產(chǎn)中性蛋白酶活力進行檢測，稍作修改。（1）標準曲線的制作：將100 mg/L的酪氨酸溶液稀釋成0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μ g/mL、80 μ g/mL、100 μ g/mL 標準酪氨酸組，分別取標準酪氨酸組的不同濃度酪氨酸1 mL，加入5 mL的Na2CO3溶液和1 mL福林酚，40 ℃水浴20 min 后，在680 nm 處測定其OD 值，每個濃度做三個平行，以酪氨酸濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線；（2）含水量的測定：取一定量的培養(yǎng)物稱重并記錄，105 ℃烘干至恒重，然后稱重，計算其含水量；（3）粗酶液中性蛋白酶活力的測定：取5 g 固態(tài)培養(yǎng)物，加pH7.2 磷酸緩沖液100 mL，靜置浸提1 h 后，8000 r/min 離心5 min，得到待測樣品的粗酶提取液，取粗酶液1 mL，40 ℃預(yù)熱5 min，加入同樣40 ℃預(yù)熱5 min 的20 g/L 中性酪蛋白溶液1 mL，精準保溫10 min 后加入2 mL 的0.4 mol/L 三氯乙酸后保溫20 min，8000 r/min 離心5 min，取上清液1 mL，加入Na2CO35 mL 和稀釋的福林酚1 mL，40 ℃水浴保溫20 min 后，在680 nm 處測定OD 值。對照組處理方法除將酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液加入的順序調(diào)換，其余與樣本處理相同。

1.2.5 分子生物學鑒定

通過16S rDNA 分子生物學鑒定對兩株酵母進行測序[2]。

1.2.6 香氣成分檢測

HS-SPME 步驟：準確稱取3 g 模擬固態(tài)發(fā)酵物質(zhì)于頂空瓶中，在磁力攪拌器上（60 ℃）平衡15 min，將萃取頭插入頂空瓶距離樣品1 cm 處萃取40 min，插入進樣口解析5 min 取出，經(jīng)GC-MS 進行分析。GC-MS條件同參考文獻[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩菌結(jié)果

通過稀釋涂布平板法從大曲中篩選出兩株菌落形態(tài)為白色、圓形、干燥、菌絲緊密、難挑起的酵母，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)兩株酵母不僅都含有酵母狀的芽殖細胞，還含有分支狀的隔假菌絲（圖1）。將兩株酵母命名為JM1-1和JM1-2。

圖1 兩株酵母的鏡檢圖（10×40倍）

2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

淀粉培養(yǎng)基上接種篩選出的兩株酵母菌，在30 ℃下培養(yǎng)24 h 后，將碘液滴在菌落周圍，觀察其透明圈，結(jié)果如圖2所示。

圖2 兩株酵母的初篩透明圈圖

JM1-1 和JM1-2均產(chǎn)生透明圈，JM1-1 和JM1-2 的透明圈直徑和菌落直徑比值（D/d值）大小分別為5.55和7，即兩株酵母菌均產(chǎn)淀粉酶。

不同菌株的生長速度、產(chǎn)酶速度和淀粉酶酶系的不同以及培養(yǎng)基的厚度和固體液體培養(yǎng)基的不同，會使菌種在平板上的菌種大小與堆積情況有所差異，造成透明圈大小上的區(qū)別，透明圈的D/d 值雖然可以反映菌株具有產(chǎn)酶能力，卻不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力的大小，因此模擬固態(tài)發(fā)酵進行復(fù)篩是必不可少的[10]。

進一步對初篩的兩株產(chǎn)淀粉酶酵母菌做模擬固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)試驗，采用DNS 法對待測樣品的粗酶液淀粉酶酶活進行精確測定。將測定的標準曲線數(shù)據(jù)繪制成圖得出的回歸方程為：y=0.5759x-0.0148（R2=0.9976），兩株酵母的淀粉酶活力見表1，U代表每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，定義為一個淀粉酶活力單位。

表1 兩株酵母菌的淀粉酶活力

由表1 可看出，JM1-1 產(chǎn)淀粉酶活力為68.640 U/mL，JM1-2產(chǎn)淀粉酶活力為30.352 U/mL，兩株酵母都產(chǎn)淀粉酶，JM1-1 的產(chǎn)淀粉酶能力強于JM1-2。

2.3 產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選

通過福林酚法測定的數(shù)據(jù)繪制標準曲線得出的回歸方程為y=0.0084x+0.0103（R2=0.9982）。兩株酵母的蛋白酶活力如表2 所示，U 代表在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 mg 酪氨酸，定義為一個蛋白酶活力單位。

表2 兩株酵母菌中性蛋白酶活力

由表2 可以看出，JM1-1 產(chǎn)中性蛋白酶活力為67.702 U/mL，JM1-2 不產(chǎn)中性蛋白酶。JM1-1 中含有的中性蛋白酶可以使蛋白質(zhì)包裹的淀粉暴露，經(jīng)過淀粉酶的作用，使淀粉糖化，促進發(fā)酵，同時蛋白酶使蛋白質(zhì)水解獲得碳源，有利于釀酒微生物的生長[11]。蛋白酶在發(fā)酵過程中可將糧谷原料中部分風味物質(zhì)的前體物質(zhì)即蛋白質(zhì)類（氨基酸、小分子肽）等降解，降解產(chǎn)物可再經(jīng)過多種微生物的代謝，生成醇類、酯類、酸類和醛酮類等多種風味物質(zhì)，對白酒香味有一定的貢獻。

2.4 鑒定結(jié)果

根據(jù)檢測結(jié)果：JM1-1 為Saccharomycopsis fibuligera(扣囊復(fù)膜酵母）、JM1-2 為Wickerhamomyces anomalus(異常威克漢姆酵母)。

2.5 香氣成分檢測結(jié)果

由表3 可知，運用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜法檢測出JM1-1 和JM1-2 均有42 種香氣揮發(fā)性成分。JM1-1 有19 種酯類，12 種醇類，4 種酸類，5種醛酮類，2 種其他；JM1-2 包含酯類21 種，醇類14種，酸類1種，醛酮類5種，其他1種。

表3 兩株酵母菌模擬發(fā)酵后香氣成分檢測結(jié)果

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖

JM1-1 和JM1-2 中香氣成分相對占比較大的物質(zhì)有辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、棕櫚酸乙酯、甲酸辛酯、反-4-癸烯酸乙酯、油酸乙酯、異戊醇、2-辛醇和β-苯乙醇等，JM1-2中花生酸乙酯含量也較高。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分與空白發(fā)酵產(chǎn)物對比，JM1-1 和JM1-2 的酯類和醇類種類大大增加，這些風味物質(zhì)對香味的形成有一定貢獻[12]。醇類、酯類均會產(chǎn)生一些令人愉快的氣味，酯類是白酒中占比最大的風味物質(zhì)，部分醇類具有水果香味，適量的高級醇可以豐富白酒香氣并可以提升酒的濃厚感與協(xié)調(diào)感。兩株酵母都產(chǎn)具有玫瑰香味的β-苯乙醇，β-苯乙醇是白酒中的一種重要香氣成分和香氣前體物質(zhì)，提高其濃度有利于豐富白酒的香氣層次，目前來說酵母菌是合成β-苯乙醇主要菌屬[13]。

大曲中酶活與香氣物質(zhì)的生成有著密不可分的關(guān)系，淀粉酶可將淀粉水解為葡萄糖，葡萄糖可以經(jīng)過糖酵解途徑（EMP）和丙酮酸的無氧酵解反應(yīng)生成乙醇，從而催化酯類的生成，當?shù)矸勖富盍Ω邥r，可增加莽草酸途徑的前體供應(yīng)，致使流入莽草酸途徑的通量增加[14]，有利于β-苯乙醇等芳香醇特征香氣成分的合成。

3 結(jié)論

非釀酒酵母可以產(chǎn)生酯和高級醇等風味物質(zhì)，以及某些參與釀酒過程反應(yīng)的酶類[15]。經(jīng)鑒定判斷兩株酵母菌分別為Saccharomycopsis fibuligera和Wickerhamomyces anomalus。兩株酵母菌均屬于非釀酒酵母。Saccharomycopsis fibuligera既產(chǎn)淀粉酶又產(chǎn)蛋白酶，Wickerhamomyces anomalus只產(chǎn)淀粉酶，并且Saccharomycopsis fibuligera的產(chǎn)淀粉酶能力高于Wickerhamomyces anomalus。產(chǎn)淀粉酶活力和產(chǎn)蛋白酶活力是大曲十分重要的生化指標，淀粉酶和蛋白酶不僅影響著基酒的產(chǎn)量，還與白酒風味物質(zhì)的生成有著密切聯(lián)系，酶可以催化微生物的生化反應(yīng)，有利于白酒中特征香氣成分的合成。

白酒中的風味物質(zhì)主要來自原料、酒曲及微生物發(fā)酵過程，微生物發(fā)酵是白酒風味的主要來源[16]。通過對兩株酵母的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行頂空固相微萃取檢測，發(fā)現(xiàn)兩株酵母產(chǎn)的風味物質(zhì)種類有所不同。JM1-1 具有良好的產(chǎn)酶能力和產(chǎn)香能力。本結(jié)論與前人研究出扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）廣泛存在于清香型白酒中，除了具有產(chǎn)糖化酶和淀粉酶能力外，還產(chǎn)生β-苯乙醇、乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯和苯乙酸乙酯等風味物質(zhì)[16]相符合。

本研究豐富了清香型白酒大曲中既產(chǎn)淀粉酶又產(chǎn)蛋白酶的菌種資源，同時初步說明扣囊復(fù)膜酵母在釀造生香方面具有很好的應(yīng)用潛質(zhì)，后續(xù)研究方向可圍繞該菌株的綜合性能、與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵以及與霉菌的產(chǎn)淀粉酶能力對比等方面展開。