黃艷紅，張興榮，徐慧，國(guó)天慶，賀連智，田延軍

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013）

魚(yú)露，又稱(chēng)魚(yú)醬油、胰油，是一種傳統(tǒng)的東方食品[1]，主要以海洋低值魚(yú)類(lèi)、淡水魚(yú)蝦或水產(chǎn)加工廢棄物為原料，在高鹽條件下經(jīng)過(guò)一兩年的發(fā)酵制成[2]，營(yíng)養(yǎng)豐富、香氣濃郁、味道鮮美，被世界各地消費(fèi)者廣泛接受。魚(yú)露的生產(chǎn)主要分布在東南亞如越南、泰國(guó)，我國(guó)東部沿海地帶，在歐洲和非洲地區(qū)也有分布[3-4]。進(jìn)入二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，魚(yú)露產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，目前國(guó)內(nèi)產(chǎn)量每年約10萬(wàn)t以上[5]。魚(yú)露生產(chǎn)過(guò)程中，不可避免的產(chǎn)生魚(yú)頭、魚(yú)骨等大量發(fā)酵尾料，不加以利用會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)[6-7]，人口的增長(zhǎng)，食物資源的短缺，也必然要求綜合利用魚(yú)體的價(jià)值[8-9]。魚(yú)露發(fā)酵尾料中含有大量的蛋白質(zhì)[10-11]，從魚(yú)露發(fā)酵尾料中提取蛋白質(zhì)、回收膠原蛋白，進(jìn)行精加工，制備氨基酸強(qiáng)化劑、特殊風(fēng)味的魚(yú)味調(diào)味劑或開(kāi)發(fā)具有生物活性的多肽，也是魚(yú)露生產(chǎn)行業(yè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)[12]。蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后得到水解蛋白，該類(lèi)蛋白質(zhì)主要為低分子的多肽，含人體所需的必需氨基酸、?；撬?、碘、硒以及B族維生素，水溶性好，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有增強(qiáng)免疫力和降低膽固醇等生理功效，極易被人體消化吸收[13-14]。蛋白酶的成本隨著酶技術(shù)的發(fā)展也在不斷降低，水解技術(shù)已經(jīng)成為制備水解蛋白較為有效的方法[15]，陳紫紅等[16]利用木瓜蛋白酶水解斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)下腳料制備多肽，通過(guò)條件優(yōu)化得到水解液的水解度為38.89%，為斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。王可琦等[17]以鰈魚(yú)加工過(guò)程中的下腳料為原料，通過(guò)中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，在最優(yōu)條件下水解度可達(dá)44.56%。水解技術(shù)的應(yīng)用可大大增加魚(yú)類(lèi)資源的利用率，將該技術(shù)用于魚(yú)露發(fā)酵尾料中，開(kāi)發(fā)其中的蛋白資源可以有效提高魚(yú)露發(fā)酵產(chǎn)品的附加值，目前鮮見(jiàn)該方面的報(bào)道。

本文以魚(yú)露的發(fā)酵尾料為原料，利用蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解，通過(guò)單因素輪換法和響應(yīng)面分析法優(yōu)化其蛋白水解工藝，并對(duì)其水解產(chǎn)物抗氧化性進(jìn)行研究，為后續(xù)魚(yú)露發(fā)酵尾料的綜合利用提供相應(yīng)的試驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烘干后的魚(yú)露發(fā)酵尾料：威海浦源食品有限公司。

中性蛋白酶（10萬(wàn) U/g）、木瓜蛋白酶（10萬(wàn) U/g）、堿性蛋白酶（20萬(wàn) U/g）、風(fēng)味蛋白酶（10萬(wàn) U/g）：安琪酵母股份有限公司；硫酸、鹽酸（分析純）：煙臺(tái)東明化工有限公司；甲醛（分析純）：天津天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、石油醚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；A004-96T羥基自由基清除能力測(cè)試試劑盒、96T氮自由基（DPPH）清除能力測(cè)試試劑盒：上?；菡\(chéng)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KT8200凱氏定氮儀：福斯華（北京）科貿(mào)有限公司；pHS-3c型pH計(jì)、752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZKW-A水浴鍋：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；HFJ-10勻漿機(jī)：上海楚定分析儀器有限公司；LT53離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；JD200-3電子分析天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；Y921型料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

總蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定

將原料置于勻漿機(jī)中，按照一定的料液比勻漿，調(diào)整體系pH值，水解、過(guò)濾、離心，之后去除上層油脂，得到清液，采用甲醛滴定法（GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》）測(cè)定清液中氨基酸態(tài)氮含量。按以下公式計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量。

式中：X1為樣品中氨基酸態(tài)氮含量，g/100 g；V1為測(cè)定時(shí)加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白加入甲醛后消耗的氫氧化鈉的體積mL；c為氫氧化鈉的濃度，mol/L；m 為樣品的質(zhì)量，g；V3為測(cè)定時(shí)上清液的用量，mL；V4為上清液的總體積，mL。

1.3.3 水解度的測(cè)定

水解度的計(jì)算參考寧詩(shī)文等[18]的方法。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶制劑，分別用緩沖溶液配制成相同濃度的酶溶液，對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料進(jìn)行單酶水解反應(yīng)，選取最佳酶制劑種類(lèi)進(jìn)行條件優(yōu)化。

在最佳酶制劑的基礎(chǔ)上采用單因素輪換法依次考察料液比 [1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）]、酶制劑用量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、水解時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8 h）、pH 值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、水解溫度（25、30、35、40、45、50、55℃）。水解結(jié)束后，8 000 r/min離心 10 min，去除上層油脂，測(cè)量清液的體積，并取適量測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量及水解度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的取值范圍和最優(yōu)點(diǎn)，使用Design-expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以水解度（Y）為響應(yīng)值，料液比（A）、酶制劑用量（B）、水解時(shí)間（C）為考察指標(biāo)，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.3.6 粗提物DPPH·和·OH清除能力的測(cè)定

水解液經(jīng)過(guò)離心、真空濃縮、冷凍干燥處理，得到水解蛋白粗提物。將粗提取配制成不同濃度的溶液（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL），參照 Jamdar等[19]和李敏等[20]的方法，按照DPPH·和·OH清除能力測(cè)試試劑盒的使用說(shuō)明，采用分光光度法分別在517 nm和532 nm測(cè)定吸光度，按以下公式計(jì)算自由基清除率。

式中：A1為樣品組加入粗提物溶液和DPPH溶液時(shí)的吸光度；A2為空白組加入粗提物溶液，不加入DPPH溶液時(shí)的吸光度；A3為對(duì)照組不加粗提物溶液，加入DPPH溶液時(shí)的吸光度。

式中：A為樣品組加粗提物溶液測(cè)得的吸光度；A0為空白組用蒸餾水代替粗提物溶液測(cè)得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，使用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)含量分析

以干燥后的魚(yú)露發(fā)酵尾料為原料，通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明，原料中蛋白質(zhì)含量為（35.12±0.55）%。魚(yú)類(lèi)蛋白質(zhì)中氨基酸的組成與人體組成類(lèi)似，具有較高的生理價(jià)值[21]，利用蛋白酶對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料進(jìn)行水解可以得到功能和品質(zhì)相對(duì)較高的水解蛋白。

2.2 不同蛋白酶對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解效果的比較

以魚(yú)露發(fā)酵尾料為底物，選取4種不同反應(yīng)機(jī)理的蛋白酶進(jìn)行水解，當(dāng)?shù)鞍酌概c發(fā)酵尾料中的蛋白質(zhì)作用時(shí)，因不同蛋白酶的作用條件不同，對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響也會(huì)不同。根據(jù)不同蛋白酶推薦的最適條件，按照相同的加酶量，對(duì)發(fā)酵尾料進(jìn)行水解，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶種類(lèi)對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.1 Effects of enzyme types on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖1可知，4種蛋白酶的對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料蛋白質(zhì)水解度的影響依次為堿性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。堿性蛋白酶的作用效果最好，對(duì)發(fā)酵尾料的水解度最高，因此選用堿性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 堿性蛋白酶水解魚(yú)露發(fā)酵尾料的單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)水解度的影響

固定堿性蛋白酶的添加量為0.8%，水解溫度為40℃，水解時(shí)間為3 h，水解體系pH9.0，探討料液比對(duì)尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree of fish sauce scraps

不同的料液比代表不同的底物濃度，由圖2可知，隨著溶劑用量的增加，底物濃度的減小，水解度呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時(shí)，蛋白的水解度最高，為（25.80±0.55）%，之后水解度有下降趨勢(shì)。蛋白酶的酶促反應(yīng)存在著產(chǎn)物與底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，過(guò)高或過(guò)低的料液比，都會(huì)引起酶促反應(yīng)的失衡，導(dǎo)致原料中蛋白水解度的降低[22]。

2.3.2 酶用量對(duì)水解度的影響

在最佳料液比的基礎(chǔ)上，按照水解時(shí)間3 h、水解溫度40℃，水解體系pH9.0，探討不同加酶量對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶用量對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖3可知，在加酶量低于1.0%時(shí)，隨著加酶量的增加，反應(yīng)底物在酶的作用下快速降解，水解度增加較快。在加酶量高于1.0%時(shí)，水解度稍有降低，此時(shí)酶的濃度過(guò)高，酶分子之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制導(dǎo)致水解度的下降[15]。綜合考慮蛋白酶的成本等因素，選擇加酶量為1.0%。

2.3.3 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在料液比1∶10（g/mL），加酶量為1.0%的基礎(chǔ)上，設(shè)置水解溫度為40℃，水解體系pH9.0，研究不同水解時(shí)間對(duì)尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 水解時(shí)間對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of fish sauce scraps

從圖4可以看出，水解前期（1 h～5 h）魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)的水解度隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)快速增加，當(dāng)水解時(shí)間大于5 h時(shí)，水解度趨于平緩。原因在于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)露發(fā)酵尾料中的蛋白逐漸較少，多肽被水解成氨基酸，體系中游離的氨基酸抑制了堿性蛋白酶的水解作用[23]，綜合考慮最適水解時(shí)間為5 h，此時(shí)蛋白質(zhì)的水解度為（36.59±0.53）%。

2.3.4 水解體系pH值對(duì)水解度的影響

在料液比1∶10（g/mL），加酶量為1.0%的基礎(chǔ)上，設(shè)置水解溫度為40℃，水解時(shí)間為5 h，研究不同水解體系pH值對(duì)尾料中蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree of fish sauce scraps

水解體系的pH值能夠pH能夠影響底物及酶的解離狀態(tài)、空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶與底物的結(jié)合以及酶的活性[24]。由圖5可知，隨著體系pH值的增加，發(fā)酵尾料中蛋白的水解度呈先增加后減少趨勢(shì)，在pH10.0左右水解度最大，為（37.89±0.61）%，水解效果最好，因此選擇水解體系的最佳pH值為10.0。

2.3.5 水解溫度對(duì)水解度的影響

在最佳料液比、加酶量、水解時(shí)間、水解體系pH值的基礎(chǔ)上，考察不同的水解溫度對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 水解溫度對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖6可知，隨著反應(yīng)體系溫度的增加，魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度呈先增加后降低的趨勢(shì)，溫度在45℃～55℃，體系的水解度相對(duì)較高，此時(shí)反應(yīng)體系的分子運(yùn)動(dòng)加速，酶活性增加[6]。隨著溫度的上升，堿性蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，變性失活，導(dǎo)致蛋白酶水解度降低，因此選擇50℃作為后續(xù)試驗(yàn)的水解溫度。

2.4 魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化魚(yú)露發(fā)酵尾料中水解蛋白的提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析見(jiàn)表2、表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

采用Design-Expert 10.0軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行回歸性分析，以水解度（Y）為因變量，料液比（A）、堿性蛋白酶用量（B）、水解時(shí)間（C）為自變量，建立回歸方程：Y=40.84+2.34A+4.89B+5.35C-0.47AB-2.35AC+0.37BC-3.16A2+5.24B2-5.338C2。

由表3可知，模型的P＜0.05，影響顯著，失擬值P＞0.05，影響不顯著，說(shuō)明該模型較為適合，試驗(yàn)點(diǎn)均可用模型描述。此外，相關(guān)系數(shù)R2為0.986 8，表明該模型有較好的可信度，即該模型能夠很好地解釋料液比、堿性蛋白酶用量、水解時(shí)間對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響。一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），AB、BC 對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)魚(yú)露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.7 Response surface plots of effect of interaction between each factor on hydrolysis degree of fish sauce scraps

響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖能夠直觀(guān)地反映不同因素之間的交互作用及其對(duì)響應(yīng)值（Y）的影響，由圖7可知，料液比（A）與水解時(shí)間（C）之間的交互作用對(duì)水解度（Y）的影響最大，其次是料液比（A）與堿性蛋白酶用量（B）的交互作用，堿性蛋白酶用量（B）與水解時(shí)間（C）的交互作用最小，與方差分析結(jié)果一致。

由模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為料液比1∶10（g/mL）、酶用量1.1%、水解時(shí)間5.4 h，在此優(yōu)化條件下水解度理論值為43.48%。為了驗(yàn)證模型的有效性，在上述水解條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)的水解度在（43.78±0.57）%，與理論值接近，說(shuō)明方程與真實(shí)試驗(yàn)情況擬合度較好，響應(yīng)面分析法得到的最佳工藝合理。

2.5 水解蛋白粗提物DPPH·和·OH清除能力試驗(yàn)

水解蛋白粗提物的抗氧化活性與濃度的關(guān)系如圖8所示。

圖8 粗提物濃度對(duì)DPPH·和·OH清除能力的影響Fig.8 Effect of crude extract concentration on scavenging abilities of DPPH·and·OH

由圖8可知，粗提物濃度為1 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，DPPH·和·OH清除率與粗提物的濃度均呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到63.01%，·OH清除率為41.11%。隨著粗提物濃度的增加，暴露出的還原性基團(tuán)的數(shù)量也在增加，其溶液的抗氧化活性也隨之增強(qiáng)。

3 結(jié)論

以魚(yú)露發(fā)酵尾料為研究對(duì)象，探討了不同蛋白酶對(duì)原料中蛋白質(zhì)水解度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了魚(yú)露發(fā)酵尾料蛋白質(zhì)的制備工藝，得出最佳水解條件：料液比 1∶10（g/mL）、堿性蛋白酶用量1.1%、水解時(shí)間5.4 h、水解溫度50℃、pH10.0，在此工藝條件下，魚(yú)露發(fā)酵尾料中蛋白水解度為（43.78±0.57）%。同時(shí)DPPH·和·OH清除試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，該水解蛋白粗提物具有較好的抗氧化活性。此研究可為魚(yú)露發(fā)酵尾料中水解蛋白的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考，有利于魚(yú)類(lèi)的高值化利用及高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。