張淑莉 方佳妮 康寶麗 王丹煬 劉欣雨 高瑞鵬

1.西安醫(yī)學院醫(yī)學技術學院檢驗中心 陜西西安 710021；2.西安醫(yī)學院醫(yī)學技術學院醫(yī)學檢驗技術1936班 陜西西安 710021

對流免疫電泳(counter immunoelectrphoresis，CIEP)是可溶性抗原和抗體在雙向免疫擴散的基礎上與電泳相結合的定向加速免疫擴散技術。由于電泳技術的采用，使在緩沖液體系中帶電的抗原抗體呈定向運動，加快了兩者的結合，并且限制了抗原抗體在介質(zhì)中向四周擴散的傾向，提高了反應時間，顯著增加了實驗靈敏度[1]，常用于抗原或抗體的定性分析、效價測定及純度鑒定[2]。對流免疫電泳實驗在臨床檢驗和醫(yī)學院校的臨床免疫學檢驗教學中有很重要意義。對流免疫電泳的原理是在pH值為8.6的瓊脂凝膠中，大部分蛋白質(zhì)抗原等電點低，帶較強負電荷，且分子量小，電泳力大于電滲力，在電場中向正極移動；而抗體絕大多數(shù)為IgG，因其等電點偏高，在pH值為8.6時帶微弱的負電荷，且分子量較大，移動速度慢。因此在電場中電泳力小于電滲力，在電場中移向負極，電泳時，將抗原孔放負極端，抗體孔放正極端，則抗原抗體相向運動，在兩孔之間相遇，并在比例適當?shù)牟课恍纬扇庋劭梢姷某恋砭€。目前，對流免疫電泳實驗廣泛應用的緩沖液是巴比妥-巴比妥鈉緩沖液[3]。但由于巴比妥-巴比妥鈉是一類抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥品，它具有鎮(zhèn)定、催眠、麻醉等作用，近年來為國家管制類藥品，存在一定安全隱患且價格較高，購買困難，影響了對流免疫電泳實驗教學的開展。因此需要找到一種試劑安全性高、實驗效果好、試劑成本低又環(huán)保的實驗材料，來替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖溶液，在測試多種常見pH值為8.2～8.6的緩沖液后，筆者采用TAE緩沖液應用于對流免疫電泳實驗并取得較好效果，并且可以作為醫(yī)學院校對流免疫電泳實驗教學中的新型緩沖液。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗原：正常人新鮮血清；抗體：購買商品(使用前用生理鹽水分別做抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度)，載玻片，打孔器，移液器及移液器吸頭，打孔樣紙，5ml刻度吸管，洗耳球，牙簽，記號筆，濕盒。

1.2 主要器材

電子分析天平，北京六一儀器廠直流穩(wěn)壓電泳儀(DYY-6C)及配套水平電泳槽，湘儀離心機。

1.3 試劑

巴比妥-巴比妥鈉電泳緩沖液(pH值為8.6，離子強度0.05)：先稱取巴比妥1.84克置于三角燒瓶中，加入200ml蒸餾水，加熱溶解后加入巴比妥鈉10.3克，最后加蒸餾水至1000毫升(調(diào)pH值至8.6)；TAE緩沖液：稱取Tris4.84g，Na2EDTA·2H2O0.744g，冰乙酸1.142mL，加蒸餾水至1000ml；瓊脂粉凝膠：稱取瓊脂粉分別加入TAE緩沖液和pH值為8.6的巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，使瓊脂濃度為10g/L，沸水浴中溶解至透亮澄清，放60～70℃水浴箱中保溫備用。

2 方法

(1)制板與打孔：取干凈載玻片，將1%融化瓊脂凝膠4.5ml澆于載玻片上，厚度約1.5～2.0mm。待瓊脂凝固后，按打樣模板去打孔，標記抗原抗體方向。

(2)加樣：在加樣孔中加入抗原10μL和抗體10μL。

(3)電泳：將已經(jīng)加好樣的瓊脂板平放于電泳槽中，瓊脂板兩端用紗布搭橋與電泳槽中緩沖液相連接，抗原孔接電源負極，抗體孔接正極，開啟電源，調(diào)整電壓和電流強度，通電50～60min。

3 實驗結果

電泳結束后關閉電源，在光線充足的情況下，將玻片對著光，觀察載玻片上抗原抗體孔之間是否有白色清晰沉淀線出現(xiàn)，如果有沉淀線形成判定為陽性，無沉淀線出現(xiàn)為陰性。如果沉淀線不夠清楚，將濕盒放置37°C保溫箱中數(shù)小時，可增強沉淀線的清晰度。

(1)以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液為介質(zhì)對流免疫電泳電泳圖譜見圖1(自左上順時針旋轉分別為抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度)。

圖1 以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液為介質(zhì)電泳圖譜

(2)以TAE緩沖溶液為介質(zhì)對流免疫電泳電泳圖譜見圖2。

圖2 以TAE緩沖溶液為介質(zhì)對流免疫電泳圖譜

圖1、圖2分別是以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、TAE緩沖液為介質(zhì)，人血清作為抗原進行的對流免疫電泳，電泳圖譜如圖1、圖2所示：在抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度條件下均可見清晰白色沉淀線即為抗原抗體復合物。重復多次實驗后，比較這兩種緩沖液的電泳結果基本相當，但TAE緩沖溶液電泳結果在1∶8稀釋度下比巴比妥-巴比妥鈉緩沖液1∶8稀釋度下的沉淀線更為明顯，反應結果更好。

4 結論

“臨床免疫學檢驗技術”主要通過研究免疫學理論和免疫學技術并將其應用于臨床樣本的定性、定量檢測，輔助臨床對相關疾病進行診斷的一門重要醫(yī)學學科，該課程不僅理論性強、技術應用廣、實用性強，還與臨床微生物學檢驗、臨床血液學檢驗、臨床生物化學檢驗、臨床寄生蟲學檢驗等多學科既廣泛聯(lián)系，又相互交叉，是醫(yī)學檢驗專業(yè)本科生必修的一門重要的主干課程，臨床免疫學檢驗不僅是臨床醫(yī)生對免疫相關性疾病進行分析和診斷的依據(jù)，還對免疫相關疾病的治療效果和病情判斷上有很重要的價值，對臨床檢測工作起重要指導作用[4]。醫(yī)學檢驗專業(yè)畢業(yè)生大多數(shù)從事醫(yī)學檢驗相關的工作崗位，實驗操作技能是畢業(yè)生立足社會的基本能力。所以實驗教學是臨床免疫學檢驗教學的重要組成部分，其在培養(yǎng)學生扎實的理論基礎和專業(yè)技能，建立系統(tǒng)的臨床檢驗思維方面具有重要作用[5]。通過開展臨床免疫學檢驗的實驗教學，使學生掌握了各項免疫學技術的檢測原理、操作方法、注意事項、臨床應用等，了解臨床免疫學檢驗的各種新技術新方法，拓寬學生臨床免疫學檢驗方面的知識視野，不但培養(yǎng)學生熟練的動手操作能力、綜合分析問題、解決問題的能力以及科研創(chuàng)新能力，還有助于調(diào)動學生學習的主動性和積極性，激發(fā)學生學習的興趣[6-7]，提升學生認識并解決在以后學習和工作中遇到的各種實際問題，以培養(yǎng)適應21世紀醫(yī)療衛(wèi)生發(fā)展需要的高質(zhì)量、應用型醫(yī)學檢驗專業(yè)技術人才。

目前關于對流免疫電泳緩沖溶液優(yōu)化的研究并不多見，現(xiàn)就近年來的研究進展進行綜述。早期楊瑞景[8]根據(jù)電解質(zhì)的導電性能，嘗試使用0.15%的氯化鈉溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液對乙型肝炎抗原和胎甲蛋白進行檢測，該替代緩沖液的優(yōu)點為經(jīng)濟、快速、簡便。其中，氯化鈉溶液比巴比妥-巴比妥鈉緩沖液價格便宜375倍，并且在臨床試驗中取得了較好的結果。但在電泳過程中，NaCl緩沖液會被電解產(chǎn)生氯氣，對實驗者存在一定危害性，因此氯化鈉溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液的方法并未得到廣泛普及。張立紅[9]在技術上進行了改進后，選用電泳槽緩沖液pH值為8.6，離子強度由0.1巴比妥鹽酸緩沖液或pH值為8.6，離子強度0.06巴比妥緩沖液，該方法不需要昂貴的儀器設備和專供試劑盒，一般實驗室就能開展抗原或抗體檢測，此方法簡便快速、經(jīng)濟，節(jié)省了試劑，縮短了實驗時間。近年來周瑞雪[10]等人從常用緩沖液中篩選出6種pH值在8.6的緩沖液進行電泳后研究表明，Tris-HCl、巴比妥-巴比妥鈉、TAE、Gly-NaOH和NaCl-NaOH緩沖液均可作為對流免疫電泳的緩沖液。但從電泳后抗原抗體形成白色沉淀線的結果來看，Tris-HCl緩沖液在對流免疫中效果最好，它作為緩沖液不僅能產(chǎn)生白色沉淀線，而且有很好的抗體濃度依賴趨勢。巴比妥-巴比妥鈉、TAE、Gly-NaOH、NaCl-NaOH電泳效果依次次之，TGS緩沖液電泳效果最差，沒有白色沉淀線出現(xiàn)，最終認為在對流免疫電泳中，Tris-HCl緩沖液替代傳統(tǒng)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液效果最好。因此認為免疫學實驗課中可以將Tris-HCl作為對流免疫電泳的緩沖液。Tris-HCl緩沖溶液、NaCl-NaOH緩沖溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，雖然實驗原料易獲取，且經(jīng)濟實用，實驗效果良好，但對流免疫電泳目前主要應用于教學實驗中，這兩種緩沖液在實驗過程中可能會電解生成有毒氣體氯氣，以及有強酸、強堿的使用，實驗安全性不高，實驗過程中可能會危害到實驗人員的健康。而TAE緩沖液(TAE Buffer)是由三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)按一定比例配制組成的緩沖液，經(jīng)過多次重復實驗證明，TAE緩沖液的電泳效果較好，在保證對流免疫電泳實驗教學質(zhì)量的前提下，安全性較高，沒有強酸，強堿的使用，也沒有有毒氣體生成，并且實驗成本較低，在對流免疫電泳實驗中有清晰免疫沉淀線，完全能夠替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液在對流免疫電泳實驗中的使用。本次成功使用TAE緩沖液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，同時在操作中我們還注意了以下幾個方面：

(1)加樣時孔內(nèi)不要有氣泡，孔內(nèi)加入抗原或抗體時以加滿為宜，盡量不要外溢；血清標本要盡量新鮮不能用溶血或陳舊標本。

(2)電泳時電壓不要太大，免得蛋白質(zhì)變性，出現(xiàn)假陽性或者假陰性，干擾實驗結果。

(3)抗原抗體的含量和比例要合適，否則不會出現(xiàn)明顯可見沉淀線。

(4)電泳所需要的時間與孔間距有關，孔間距越大，電泳時間越長。

(5)電場強度、電泳緩沖溶液的pH值、溶液離子強度等對檢測結果均有影響，電泳速度與電場強度成正比，電場強度越高，帶點顆粒移動速度越快；溶液的pH值高于顆粒的等電點時顆粒帶負電荷，溶液pH值離某物質(zhì)的等電點越遠，該物質(zhì)所帶電荷量越多，分子量越小，泳動越快；緩沖溶液的離子強度越高，電泳速度越慢。

在對流免疫電泳實驗中電泳介質(zhì)本實驗室一直首選用瓊脂粉，在這次實驗中也嘗試著將電泳介質(zhì)瓊脂粉換成瓊脂糖，實驗結果顯示，瓊脂粉的電泳效果均好于瓊脂糖，與周瑞雪等研究發(fā)現(xiàn)瓊脂糖實驗效果好于瓊脂粉的研究結果不符，這還有待于進一步的探索論證。

綜上所述，本文選用TAE緩沖液同傳統(tǒng)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液的電泳結果都有明顯沉淀線，但TAE緩沖溶液電泳效果要好于巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，TAE緩沖液的試劑原料經(jīng)濟安全且容易獲取，并且使用瓊脂粉作為電泳介質(zhì)的結果優(yōu)于瓊脂糖，在對流免疫電泳實驗教學中作為新型緩沖液完全能替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，目前已經(jīng)應用于臨床免疫學檢驗實驗教學中，取得了良好的實驗教學效果，值得推廣使用。