張玉英，黃 菱，趙建寧，師志云

鮑曼不動桿菌(AB)是一類非發(fā)酵、氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌，屬條件性致病菌，可引起呼吸道感染、泌尿系感染、敗血癥或繼發(fā)性腦膜炎等,其中呼吸機(jī)相關(guān)肺炎和血液感染的死亡率可達(dá)35%[1]。鮑曼不動桿菌耐藥的重要機(jī)制之一是形成生物膜。而鮑曼不動桿菌生物膜形成的關(guān)鍵是廣泛存在于細(xì)菌中的一種核酸類第二信使 3,5-環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)。c-di-GMP的濃度水平主要是由具有合成活性的二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和降解活性的磷酸二酯酶(PDE)控制的。生物膜形成相關(guān)的酪氨酸磷酸酶A(pbA)是銅綠假單胞菌中新發(fā)現(xiàn)的一種作用于c-di-GMP的磷酸二酯酶，更重要的是TpbA在鮑曼不動桿菌中存在高度保守基因序列[2]。TpbA可能通過調(diào)控c-di-GMP進(jìn)而影響鮑曼不動桿菌ATCC17978生物膜的形成。目前，國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，本研究旨在為尋找針對生物膜的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般材料:鮑曼不動桿菌ATCC17978(美國ATCC中國代理北京中源合聚生物科技有限公司);小鼠抗-TpbA的單克隆抗體(BD公司)；基因合成由上海生工完成；pET-28a載體為本實(shí)驗(yàn)室的原有保藏；EcoRⅠ、NotⅠ、IPTG、大腸桿菌BL21感受態(tài)購自北京全式金公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；His親和層析柱購自美國GE公司；c-di-GMP特異性抗體購自美國Abcam公司；全自動分光光度儀為美國Thermo公司產(chǎn)品；酪氨酸磷酸化酶活性試劑盒(Promega公司)；96孔微量培養(yǎng)板(Thermo公司)，其他常規(guī)耗材與試劑均為國產(chǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1 TpbA基因合成：上海生工合成TpbA基因序列，引入限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ。

1.2.2 TpbA基因載體的構(gòu)建：在大腸桿菌BL21中，將該基因克隆至pET28a載體，形成pET28a-TpbA載體，攜帶6×His標(biāo)簽。

1.2.3 基因工程原核表達(dá)及純化：通過IPTG原核誘導(dǎo)表達(dá)后，采用針對His標(biāo)簽的預(yù)裝1mL GE親和層析柱純化目的蛋白。

1.2.4 過表達(dá)TpbA的鮑曼不動桿菌的制備：采用CaCl2法將上述成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-TpbA以濃度為0.1 ng/mL或10 ng/mL分別轉(zhuǎn)入鮑曼不動桿菌ATCC17978，經(jīng)western blot和生物活性實(shí)驗(yàn)鑒定TpbA過表達(dá)情況。

1.2.5 western blot：SDS-PAGE電泳后經(jīng)轉(zhuǎn)PVDF膜，采用小鼠抗-TpbA的單克隆抗體(BD公司)1∶1 000稀釋4 ℃孵育過夜。采用TBST洗三遍后，隨后采用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體室溫孵育1h。隨后經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法檢測特異性條帶。

1.2.6 TpbA生物活性檢測：采用酪氨酸磷酸化酶活性試劑盒(Promega公司)檢測轉(zhuǎn)入菌中的TpbA酶活性。具體方法為TpbA(10 μg)與試劑盒中50 mM磷酸化肽段在50 μL反應(yīng)體系37 ℃孵育2 h，隨后采用50 μL鉬酸鹽染料溶液室溫30 min終止反應(yīng)。最后，釋放的磷酸鹽經(jīng)光密度(OD)為630 nm進(jìn)行定量檢測(Thermo全波長分光光度儀)。

1.2.7 c-di-GMP水平的檢測：配置細(xì)菌裂解液(20%乙腈，40%甲醇，40%ddH2O，1 μM cGMP)，加入5.5 mL細(xì)菌裂解液(按照1 mL/50 OD的比例)，-80 ℃反復(fù)凍融5次，每次20min(直至菌體變白)。離心取上清，用凍干機(jī)將上清液凍干。加入100 μL小分子提取液(60%甲醇，40%ddH2O),將沉淀重懸，10 000 g離心5 min，取上清用于質(zhì)譜分析(UPLC-IM-MS質(zhì)譜儀)。通過質(zhì)譜將其打碎成小片段，然后定量測定特異性片段的含量表征c-di-GMP水平，最后通過與c-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)品比較，得出樣品中的c-di-GMP濃度。

1.2.8 生物膜形成實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)描述的方法，開展生物膜形成實(shí)驗(yàn)，旨在評價(jià)過表達(dá)TpbA對于ATCC17978菌株生物膜形成的影響。具體步驟：首先在LB瓊脂培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜ATCC17978菌(包括過表達(dá)TpbA)，采用PBS重懸菌液至濁度為OD 600=1。隨后20 μL/孔加入到無菌的96孔微量培養(yǎng)板(Thermo公司的Nunc品牌)中，在各孔中加入180 μL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，相應(yīng)的孔中加入1 mM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30/37 ℃培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)24 h。隨后棄上清并用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)緩慢沖洗后，采用1%結(jié)晶紫染30 min，清水沖洗3次，被結(jié)晶紫著色的菌通過5%醋酸溶液脫色，最終被著色的只剩下生物膜，通過595 nm處檢測吸光值。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建TpbA基因載體并表達(dá)目的蛋白:western blot結(jié)果表明，經(jīng)特異性抗體結(jié)合后，在23 kD與17 kD之間出現(xiàn)特異條帶，該條帶的分子量大小與預(yù)期一致，提示成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-TpbA并表達(dá)目的蛋白，見圖1(封二)。

2.2 過表達(dá)TpbA能夠?qū)е翧TCC17978菌株c-di-GMP水平顯著降低:將上述TpbA基因載體pET28a-TpbA轉(zhuǎn)化為鮑曼不動桿菌ATCC17978菌株，western blot研究證實(shí)該菌中的TpbA蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見圖2(封二)。ATCC17978菌過表達(dá)TpbA的磷酸酶活性顯著增加(P<0.05)，見圖3(封二)。western blot結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TpbA的ATCC17978菌中生物膜形成相關(guān)的第二信使c-di-GMP水平顯著降低(P<0.05)，見圖4(封二)。

2.3 過表達(dá)TpbA對于ATCC17978菌株生物膜形成的影響:開展生物膜形成實(shí)驗(yàn)，旨在評價(jià)過表達(dá)TpbA對于ATCC17978菌株生物膜形成的影響。過表達(dá)TpbA的ATCC17978菌的生物膜形成結(jié)果見圖5(封二)，可見TpbA過表達(dá)能夠顯著減少生物膜的形成(P<0.05)，且呈劑量依賴性。

3 討論

鮑曼不動桿菌對環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)且具有較強(qiáng)的耐藥性以及致病基因獲得能力，近年來該菌耐藥性不斷上升，臨床出現(xiàn)多重耐藥鮑曼不動桿菌、泛耐藥鮑曼不動桿菌、全耐藥株并呈世界性流行[3]。鮑曼不動桿菌成為全球性臨床治療上的一個(gè)重大難題，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是需要新抗菌劑的首要病原微生物[4]。研究證實(shí)，臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株幾乎都具有較強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力，生物膜一旦形成，細(xì)菌就具有極強(qiáng)的耐藥性和致病性[5-6]。

細(xì)菌生物膜(BBF)在病原微生物引起的持續(xù)感染中起著重要作用。1978年，被譽(yù)為“生物膜研究之父”的J.W.(Bill) Costerton提出了生物膜的基本概念。此后生物膜和疾病之間聯(lián)系的研究開始展開，有報(bào)道指出，人類大約65%的感染與生物膜有關(guān)[7]，因此，有關(guān)生物膜的研究已經(jīng)成為當(dāng)前病原微生物領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。BBF是一種微生物聚集群體，是細(xì)菌吸附于機(jī)體黏膜或植入性生物醫(yī)學(xué)材料表面，由菌體和自身分泌的胞外多糖、脂蛋白、纖維蛋白等組成的具有三維立體結(jié)構(gòu)的膜樣物[8]。細(xì)菌生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜有序的動態(tài)過程，生長周期一般分為5個(gè)階段，即最初定植階段、不可逆黏附階段、生物膜早期形成階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段。它的主要特點(diǎn)是內(nèi)部細(xì)菌的異質(zhì)性，即生物膜內(nèi)不同部位的細(xì)菌呈現(xiàn)不同的基因表達(dá)模式，發(fā)揮不同的功能。在生物膜垂直方向不同層面的細(xì)菌RNA含量、呼吸活性和蛋白質(zhì)合成均不同[9]；由于細(xì)菌所處的pH值和氧化還原電位等微環(huán)境不同，在遺傳學(xué)上相同的細(xì)菌個(gè)體表現(xiàn)出不同的特征，如產(chǎn)生的不同毒素使一些細(xì)菌對宿主無危害，而另一些細(xì)菌可能對宿主有致命威脅[10]。與浮游菌相比，生物膜內(nèi)細(xì)菌顯示出更強(qiáng)的耐藥性，可以是浮游菌的10～1000倍。盡管生物膜的耐藥性是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，但是對于生物膜的頑固耐藥性仍然知之甚少。

與其他耐藥機(jī)制的研究相比，鮑曼不動桿菌生物膜的有關(guān)研究起步相對滯后。有研究表明，該菌可在48 h內(nèi)就形成成熟的生物膜[11]，使得該菌可長期存在于醫(yī)院環(huán)境，如醫(yī)護(hù)人員的指尖、塑料、PVC、陶瓷、橡膠和不銹鋼等材料的表面[12]，從而導(dǎo)致機(jī)體反復(fù)感染，最終導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[13]。生物膜的存在也使細(xì)菌能長時(shí)間抵抗干燥劑和消毒劑，造成各種與醫(yī)療相關(guān)感染的暴發(fā)[14]。目前關(guān)于鮑曼不動桿菌中c-di-GMP影響哪些生物膜基質(zhì)成分編碼基因的表達(dá)，以及c-di-GMP調(diào)控這些基因表達(dá)的機(jī)理尚不清楚。對c-di-GMP相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究的缺乏，極大地限制了選擇防治鮑曼不動桿菌的合理策略和途徑，不利于我們利用有限的資源。要加快研究新的作用靶點(diǎn)、開發(fā)新型抗菌藥物、解決細(xì)菌耐藥、控制院內(nèi)感染播散的新途徑。

而鮑曼不動桿菌生物膜形成的關(guān)鍵是廣泛存在于細(xì)菌中的一種核酸類第二信使c-di-GMP，其濃度水平主要是由具有合成活性的DGC和降解活性的PDE控制的。而TpbA是銅綠假單胞菌中c-di-GMP新發(fā)現(xiàn)的一種PDE，更重要的是TpbA在鮑曼不動桿菌中存在高度保守基因序列[10]。但是，在鮑曼不動桿菌中，TpbA是否能夠通過調(diào)控c-di-GMP發(fā)揮抑制生物膜的形成尚不清楚。為此，本研究首先構(gòu)建了TpbA的原核表達(dá)載體，確認(rèn)了TpbA的高效表達(dá)。隨后，通過轉(zhuǎn)入TpbA載體實(shí)現(xiàn)了鮑曼不動桿菌中的高表達(dá)，并且證實(shí)具有生物學(xué)活性。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)了c-di-GMP顯著減少，這表明了TpbA對于生物膜形成關(guān)鍵第二信使的抑制作用。通過生物膜形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TpbA的ATCC17978菌在TpbA顯著增加、c-di-GMP顯著減少的情況下，生物膜的形成受到顯著抑制，提示TpbA可能是通過調(diào)控c-di-GMP抑制生物膜的形成，打破鮑曼不動桿菌耐藥，表明TpbA具有抗鮑曼不動桿菌感染的潛在應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，TpbA有望成為臨床抑制綠膿桿菌生物膜形成及持續(xù)感染的有效手段[15]，本研究結(jié)果擴(kuò)充了TpbA的應(yīng)用范圍。

本研究中，TpbA調(diào)節(jié)鮑曼不動桿菌c-di-GMP影響哪些生物膜基質(zhì)成分編碼基因的表達(dá)，以及c-di-GMP調(diào)控這些基因表達(dá)的機(jī)理尚不清楚，需要后續(xù)進(jìn)一步展開研究?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，c-di- GMP可以從多條途徑調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜形成：①通過降低細(xì)胞運(yùn)動性增加細(xì)菌對生物和非生物介質(zhì)的附著能力；②促進(jìn)某些細(xì)菌EPS的產(chǎn)生。細(xì)菌生物膜形成的第二步是細(xì)菌在初步黏附的基礎(chǔ)上，不斷堆積生長，直至形成成熟的生物膜。在這一步EPS發(fā)揮了重要作用，例如，耶爾森氏鼠疫桿菌反應(yīng)調(diào)節(jié)子HmsT和HmsP分別具有DGC和PDE活性，可通過改變胞內(nèi)c-di-GMP水平調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶HmsR活性，影響EPS的產(chǎn)生和生物膜的形成[16]。有趣的是，作為胞內(nèi)第二信使的c-di-GMP，在胞外可以抑制金黃色葡萄球菌聚集從而抑制了細(xì)菌生物膜的形成，與其胞內(nèi)作用截然相反[17]。

細(xì)菌生物膜形成是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因。而生物膜的形成與發(fā)揮作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及生物膜內(nèi)部極其復(fù)雜的環(huán)境，包括細(xì)菌的生存狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)和機(jī)能狀態(tài)[18]。本研究針對生物膜形成的關(guān)鍵第二信使c-di-GMP展開其關(guān)鍵酶TpbA的調(diào)控研究，試圖為打破生物膜形成、抗生素耐藥提供新的線索與靶點(diǎn)。