房心荷，朱德軍，鄒文青，朱金燕

Leber先天性黑矇(LCA)是一種嚴重致盲性遺傳性視網(wǎng)膜疾病，遺傳性視網(wǎng)膜疾病中Leber先天性黑矇占比5%，是導(dǎo)致兒童先天性早發(fā)性盲的首要疾病[1]。Leber先天性黑矇多表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，臨床表現(xiàn)分為嬰兒型和少年型，主要以眼球震顫、固視障礙、指壓癥陽性為特征，ERG表現(xiàn)為明視暗視中重度降低甚至呈熄滅型，具有診斷意義[2]，部分患者可伴有小眼球、圓錐角膜、身體智力發(fā)育遲緩等綜合征表現(xiàn)。本病為單基因遺傳眼病，近年來相繼發(fā)現(xiàn)了20余個致病基因可導(dǎo)致Leber先天性黑矇發(fā)病[3]，各種視網(wǎng)膜功能相關(guān)基因突變引起蛋白、細胞結(jié)構(gòu)功能異常而導(dǎo)致視功能嚴重喪失[4]。國際罕見病研究聯(lián)盟(IRDiRC)在其愿景中指出，到2020年，所有遺傳疾病患者都應(yīng)得到分子診斷[5]。本研究對1個近親結(jié)婚Leber先天性黑矇家系先證者及家庭成員進行基因檢測，旨在明確分子診斷，綜合分析臨床表型與基因型，提高臨床診斷和基因診斷水平，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科就診的近親結(jié)婚Leber先天性黑矇家系共4人(1個先證者及其正常父母、姐姐)作為研究對象。先證者及其家庭成員均行裸眼視力、最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡、裂隙燈下前置鏡、眼壓、彩色眼底照相、視野、光相干斷層掃描(OCT)以及全視野視網(wǎng)膜電圖(ERG)和熒光素眼底血管造影(FFA)檢查。記錄先證者及其家庭成員家族史、婚育史以及全身疾病史，繪制家系圖。本研究所涉內(nèi)容遵照赫爾辛基宣言，被納入研究的未成年患兒監(jiān)護人均被告知研究目的及內(nèi)容，簽署由寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會準(zhǔn)許制定的知情同意書(2016018)。

1.2 Leber先天性黑矇臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：①6月齡以下視力嚴重損害或盲、伴有固視障礙、眼球震顫或指壓眼球等癥狀的患兒；②視網(wǎng)膜電圖示a、b 波嚴重降低，甚至呈熄滅型；③視網(wǎng)膜彌漫色素顆粒沉積，呈骨細胞樣或椒鹽樣改變。

1.3 方法

1.3.1 全基因組外顯子測序：采集Leber先天性黑矇患者及其家庭成員外周抗凝血6mL，利用Qiamp DNA Blood MiniKit(NO.51106)試劑盒(德國QIAGEN公司)提取基因組DNA。行全基因組外顯子捕獲(Agilent SureSelect外顯子捕獲試劑盒)，采用高通量測序儀 (Illumina)測序且深度達到100×。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過Illumina basecalling Software 1.7分析軟件處理后與NCBI人類基因組DNA參照序列(NCBI build 37.1)進行比對。采用SOAP軟件(http://soap.genomics.org.cn)分析單核苷酸變異(SNV) 相關(guān)信息，采用BWA軟件 (http:// bio-bwa.sourceforge.net/)分析插入和缺失變異(Indel)相關(guān)信息，獲得全部變異位點。濾除數(shù)據(jù)庫(db135)常見變異(MAF>1%)及對蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)無影響的變異。經(jīng)過逐步過濾，篩選出家系內(nèi)所有先證者共享的變異數(shù)，再過濾家系無患病親屬存在的變異，獲得候選致病基因變異。利用Sanger測序技術(shù)驗證得到致病性突變位點，確保在正常家系成員中呈現(xiàn)共分離。

1.3.2 基因變異致病性分析：利用HGMD(human gene mutation database)、dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等數(shù)據(jù)庫工具對目標(biāo)突變位點進行查詢，在HGMD中查看是否為已報道致病突變，是否已被收錄。如果是未報道過的新變異，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會 (ACMG) 2015年發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對新發(fā)變異進行基因變異致病性評估。將變異位點放至正常人數(shù)據(jù)庫進行過濾篩選，包括正常人群頻率1000 Genomes (http://browser.1000genomes.org)及ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)數(shù)據(jù)庫。在Poly Phen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、MutationTaster (http://www.mutationtaster.org)等網(wǎng)站上預(yù)測變異位點對蛋白功能的影響。運用GERP++ (https://bio.tools/gerp)等網(wǎng)站衡量進化中跨物種基因序列的保守情況。PolyPhen2預(yù)測軟件對突變位點預(yù)測值范圍為0～1，分值越高越有害。Mutation Taster預(yù)測軟件對突變位點預(yù)測值范圍為0～1，分值越高越有害。氨基酸序列保守性GERP++預(yù)測值范圍大于2表示比較保守，GERP分數(shù)高意味著序列高度保守，因此改變是有害的。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分析：患者，男，11歲，出生后即出現(xiàn)雙眼球輕度震顫，視力低下。色覺檢查為全色盲。裸眼視力右眼0.25、左眼0.12，1%阿托品散瞳驗光右眼-1.50DS/-0.50DC×150°：0.25，左眼-1.00DS/-1.50DC×175°：0.12，即雙眼矯正視力不提高。雙眼前節(jié)未見異常。雙眼視盤色淡、邊界清，血管纖細，視網(wǎng)膜內(nèi)未見明顯色素沉積。雙眼黃斑OCT示黃斑形態(tài)正常，層系間分明、清晰可辨。眼底自發(fā)熒光未見明顯異常。進行ERG檢查，暗適應(yīng)0.01ERG：b波重度下降；暗適應(yīng)3.0ERG：a、b波均呈熄滅型；暗適應(yīng)3.0震蕩電位：右眼重度下降，左眼中度下降。明適應(yīng)3.0ERG，a波：右眼呈熄滅型，左眼重度下降；b波：右眼呈熄滅型，左眼重度下降；明適應(yīng)3.0閃光ERG:呈熄滅型。先證者父母為近親結(jié)婚，其父母裸眼視力均達1.0及以上，雙眼前節(jié)及眼底檢查未見異常，全視網(wǎng)膜電流圖正常。

2.2 全基因組外顯子測序結(jié)果:利用全基因組外顯子測序及PCR驗證，先證者為TULP1基因的純合錯義突變c.C1024G(p.R342G)。表型正常的父親、母親及姐姐均攜帶一個c.C1024G雜合突變，提示基因型和表型共分離,符合常染色體隱性遺傳方式。

2.3 生物信息學(xué)分析：基因檢測在先證者TULP1基因第11號外顯子檢測到純和錯義突變c.C1024G(p.R342G)，編碼區(qū)第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)變異為G(鳥嘌呤)，變異導(dǎo)致編碼蛋白序列內(nèi)的氨基酸改變p.R342G，第342號氨基酸由精氨酸(Arg)變異為甘氨酸(Gly)。該變異此前在文獻中未見報道，在1000基因組數(shù)據(jù)庫(1000 Genomes Database)和東亞人口數(shù)據(jù)庫(ExAC_EAS)的搜索結(jié)果顯示，這個變異的突變頻率均為0(PM2_Supporting)，是新發(fā)現(xiàn)的變異位點。通過預(yù)測軟件分析變異對蛋白功能的影響，PolyPhen2 評分為0.9571，表明為有害，MutationTaster 評分為D，表明為有害，見表1。保守性分析發(fā)現(xiàn)TULP1基因第342位精氨酸，在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守。根據(jù)中國遺傳學(xué)會遺傳咨詢分會《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)中文版專家共識指南》，錯義突變評為PVS1，數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，該突變總致病性評分均為PVS1+PM2+PP1，為致病性變異。

表1 不同軟件分析TULP1變異對其蛋白功能的影響

3 討論

Leber先天性黑矇是嚴重危害兒童視網(wǎng)膜疾病，可導(dǎo)致部分患兒失明，其發(fā)病率為1∶81 000～1∶30 000[8]，患兒多于出生時或6月齡內(nèi)即出現(xiàn)視力低下、無固視、眼球震顫、指壓征、眼球內(nèi)陷等。指壓征為用手指多次用力按壓眼球，可能與此動作產(chǎn)生的閃光感及幻視使患兒得到較多光刺激有關(guān)，具體的分子機制尚不明確。這種動作持續(xù)按壓眼球，導(dǎo)致眶周脂肪萎縮并眼窩凹陷。眼底表現(xiàn)既可完全正常，也可表現(xiàn)為黃斑牛眼樣外觀、后極部灰白色斑點改變等，部分病例直到病變晚期仍保持正常眼底外觀[9]。ERG表現(xiàn)為熄滅型或者明視暗視反應(yīng)重度下降，具有診斷意義。Leber先天性黑矇臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀及體征特異性不強，其他綜合征或非綜合征眼病也可有相似表現(xiàn)，臨床上容易誤診為全色盲、不完全色盲、先天性靜止性夜盲、白化病和視神經(jīng)發(fā)育不全等[10]。Leber先天性黑矇多表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，也有顯性遺傳及X連鎖性遺傳報道。Leber先天性黑矇具備臨床表型多樣性及遺傳異質(zhì)性的特點，主要表現(xiàn)為不同的等位基因或者基因突變可引起相似的臨床表現(xiàn)，但有些相同的基因突變，發(fā)生在不同家系或不同位點時可有不同的臨床表現(xiàn)[11]。

目前，有20余個與Leber先天性黑矇相關(guān)的致病基因被公布，分別涉及視網(wǎng)膜內(nèi)維生素 A 的代謝循環(huán)、光感受器纖毛轉(zhuǎn)運過程、視網(wǎng)膜光電信號的傳導(dǎo)過程、視網(wǎng)膜光感受器細胞的分化和發(fā)育以及蛋白轉(zhuǎn)運和分布等[12]。遺傳類疾病的致病基因在不同人種及地域存在很大差別，Eisenberger T[13]等對歐洲人群中部分Leber先天性黑矇患者進行研究發(fā)現(xiàn)，TULP1基因突變可致10.7%患者發(fā)病。亞洲人群中TULP1基因突變導(dǎo)致Leber先天性黑矇報道較少，Li等[14]對87位中國患者基因篩查結(jié)果顯示排名前五位的分別為GUCY2D、CRB1、RPGRIPI、RPE65、SPATA7。2016年盛迅倫[15]等發(fā)現(xiàn)一個導(dǎo)致Leber先天性黑矇的新的突變基因CCT2，也是一個涉及光感受器連接纖毛轉(zhuǎn)運過程的基因。

TULP1基因(TUB Like Protein 1)定位于6p21.31，由542個氨基酸(61kDa)構(gòu)成TUB樣蛋白1，是非綜合征型視網(wǎng)膜纖毛疾病相關(guān)基因，主要在視網(wǎng)膜光感受器細胞表達，光感受器細胞通過突觸與內(nèi)視網(wǎng)膜進行交流，TULP1在光感受器突觸前末端的活性區(qū)表達最豐富，對于視紫紅質(zhì)在光感受器內(nèi)外節(jié)之間的分布轉(zhuǎn)運具有重要作用。TULP1基因變異可導(dǎo)致LCA15型和RP14型[16]。LCA 15型有Leber先天性黑矇的一般特點，疾病嚴重程度較輕，但發(fā)病年齡早、表型嚴重于視網(wǎng)膜色素變性。與遺傳性視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的TULP1突變至少有59種[17]，本研究中錯義突變c.C1024G(p.R342G)未見文獻報道，該突變在正常千人漢族人群及千人東亞人群中的突變頻率為0，是新發(fā)現(xiàn)的突變位點。家系中先證者父母親(I1、I2)及姐姐(II1)均攜帶一個TULP1雜合突變c.C1024G，表型正常，表明TULP1純和錯義突變?yōu)楸炯蚁档闹虏≡颍Y(jié)合病史及眼科相關(guān)檢查綜合判斷為LCA15型(MIM：613843)的可能性大。有研究表明TULP1基因突變是與早發(fā)型視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)的一個基因，但國內(nèi)暫無TULP1基因突變與無色素性視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)的報道，提示TULP1基因不同的變異位點可能存在不同致病機制，導(dǎo)致臨床表型不同的疾病。具體機制仍需進一步探索。

本研究從Leber先天性黑矇的臨床表現(xiàn)和遺傳變異水平闡明了1個近親結(jié)婚家系患者的致病原因，報道了導(dǎo)致Leber先天性黑矇的新發(fā)變異。進一步擴充了Leber先天性黑矇的突變位點，擴大了Leber先天性黑矇的基因突變頻譜，使該病的分子病理機制得到了進一步理解，為LCA的精確診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據(jù)。同時也說明全基因組外顯子測序技術(shù)對此類疾病具有重要的輔助診斷意義。