孫玉瑩，于璐佳，張 杰

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

觀賞海棠(Maluscrabapple)是蘋果屬植物中兼具觀賞價值和經(jīng)作價值的重要資源[1-2]。具有抗逆能力強(qiáng)、葉幕較大、花果葉多彩等特點(diǎn)，不僅作為觀賞樹種、環(huán)城林帶建設(shè)樹種用于美化城鄉(xiāng)環(huán)境，也作為造林樹種用于治理山區(qū)水土流失、風(fēng)沙侵蝕等自然災(zāi)害。觀賞海棠果實(shí)和葉片中含有極為豐富的天然花色素苷[3-5]，是植物體內(nèi)一類重要的次級代謝產(chǎn)物，屬于類黃酮物質(zhì)并具有良好的抗氧化功能?；ㄉ剀沾嬖谟诟叩戎参锏乃薪M織和器官中，使植物組織和器官呈現(xiàn)多種顏色，如紅色、藍(lán)色和紫色等[6-7]。同時，花色素苷在生物學(xué)功能及保健功能方面也具有多種用途，如改善視力、防止老年癡呆、預(yù)防心血管及腫瘤和糖尿病等疾病的發(fā)生[8-9]。

研究表明，低溫誘導(dǎo)能夠促進(jìn)植物組織積累花色素苷[10-11]。適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢源龠M(jìn)植物中花色素苷的積累，但是過低的溫度不僅不會正向影響花色素苷的積累還會對植物造成損傷，影響其生長發(fā)育[12]。這是由于過低的溫度會影響花色素苷生成途徑中合成酶和調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低其活性，減少花色素苷的積累[13]。低溫促進(jìn)植物中一些花色素苷合成基因和調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而提高花色素苷的含量。如低溫可以促進(jìn)花色素苷代謝途徑中的PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花色素苷積累[14]。蘋果屬植物中，低溫能夠誘導(dǎo)MdbHLH3基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MdbHLH33蛋白與MdMYBl轉(zhuǎn)錄因子的互作，激活花色素苷關(guān)鍵合成基因的表達(dá)，促進(jìn)低溫誘導(dǎo)下的花色素苷積累[15-16]。

當(dāng)植物受到非生物脅迫時，為適應(yīng)環(huán)境變化，抗逆相關(guān)基因啟動子往往會發(fā)生去甲基化，釋放沉默基因并啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以提高植物對非生物脅迫的適應(yīng)性[17]。IDM1最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，編碼一種組蛋白H3乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone H3 acetyltransferase)；在DNA去甲基化過程中，其通過自身MBD結(jié)構(gòu)域識別甲基化的DNA，并通過PHD結(jié)構(gòu)域識別組蛋白H3K4而產(chǎn)生乙酰化的H3K23和H3K18標(biāo)記，隨后被DNA去甲基化酶或其互作蛋白所識別而使DNA去甲基化[18]。IDM1在生物體內(nèi)的正常表達(dá)對于維持DNA甲基化狀態(tài)，防止超甲基化具有非常重要的作用[19-20]。

低溫脅迫促進(jìn)DNA去甲基化，同時促進(jìn)植物體內(nèi)的花色素苷的積累，但蘋果屬植物中DNA去甲基化與花色素苷積累間是否存在聯(lián)系尚不清晰。該研究的目的旨在探索低溫條件下IDM1基因參與DNA去甲基化過程與花色素苷合成途徑的潛在聯(lián)系，初步探明DNA去甲基化基因與蘋果屬植物低溫誘導(dǎo)花色素苷積累的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為蘋果品種‘嘎啦’(Malusdomesticacv. ‘Gala’)、觀賞海棠常紅葉品種‘王族’(Maluscv. ‘Royalty’)和觀賞海棠常綠葉品種‘火焰’(Maluscv. ‘Flame’)組培苗。組培苗試驗(yàn)材料均來自北京農(nóng)學(xué)院組培中心，其外植體于2019年4月12日取自北京農(nóng)學(xué)院蘋果屬植物種質(zhì)資源圃的一年生枝，培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基[21]，光照時間為光照16 h/黑暗8 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx[22-23]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫脅迫處理 對照組培養(yǎng)溫度為23～26 ℃，低溫處理組培養(yǎng)溫度為16 ℃，連續(xù)處理7 d。

1.2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA 將處理后的觀賞海棠常紅葉品種‘王族’、觀賞海棠常綠葉品種‘火焰’和蘋果品種‘嘎啦’組培苗葉片對照組和16 ℃低溫處理組分別進(jìn)行植株葉片液氮研磨，每組處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。將每個研磨樣品進(jìn)行總RNA提取，提取方法參照RNA多糖多酚提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書；利用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)將每個樣品進(jìn)行cDNA合成。

1.2.3MdIDM1基因的克隆 通過NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索，獲得金冠基因組同源IDM1基因堿基序列，使用Primer.5軟件根據(jù)其堿基序列設(shè)計克隆引物MdIDM1-F為5′-ATGTTTCTCAGCAAAGAAATTG-3′，MdIDM1-R為5′-TTATTCTTCCAAAGGAAGCTG-3′。PCR擴(kuò)增體系參考Pfu DNA Polymerase說明書(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；循環(huán)數(shù)35；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳檢測、回收并測序(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測 根據(jù)測序獲得的IDM1基因堿基序列，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Primer-BLAST，特異性設(shè)計熒光定量PCR引物。q-IDM1-F為5′-TATCCAGCCATCGGAGGGAA-3′，q-IDM1-R為5′-CGCCCGTCGCTATTTCCTAA-3′。以16 ℃低溫處理組cDNA及對照組cDNA分別為模板，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)熒光染料(北京擎科新業(yè)生物有限公司)于Bio-RAD CFX384 Thermal Cycler上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)，檢測去甲基化基因MdIDM1以及花色素苷代謝過程中合成基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后65～95 ℃制備溶解曲線。以蘋果18S核糖體RNA基因(DQ341382)作為內(nèi)參基因，每組處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 花色素苷物質(zhì)含量測定 以甲酸∶甲醇∶水=1∶80∶19配制成花色素苷提取液。液氮研磨的植株葉片樣品，分別將每個樣品稱量1 g于離心管中加入2 mL花色素苷提取液，45 ℃超聲1 h，12 000 g離心10 min，以直徑0.2 μm的濾膜過濾上清于棕色小瓶中。將花色素苷提取液進(jìn)行液相色譜成分檢測(Agilent 1200，北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，并計算含量?；ㄉ剀蘸坑嬎愎剑夯ㄉ剀盏暮?μg/g) =(0.003×A+0.3)/m。A表示峰面積，m表示樣品鮮質(zhì)量(g)[ 24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdIDM1基因的克隆

以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、回收及測序等過程，得到1條長度為3 975 bp的MdIDM1基因序列，與‘金冠’(Malusdomestica‘Golden Delicious’)基因組MdIDM1基因進(jìn)行對比，核苷酸相似度99.75%(圖1)；氨基酸相似度99.47%(圖2)。在NCBI上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，顯示MdIDM1蛋白存在保守的PHD1結(jié)構(gòu)域(圖3)。

2.2 低溫處理蘋果屬葉片的花色素苷含量分析

為了解低溫條件下蘋果屬植物花色素苷含量變化情況，對低溫處理后的‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’3個品種的表型進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4A所示。常綠品種‘嘎啦’和‘火焰’植株葉片明顯變紅，紅葉品種‘王族’經(jīng)低溫處理后葉片變成紫紅。利用液相色譜技術(shù)對不同處理組的3個品種的葉片進(jìn)行花色素苷含量測定，‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’葉片經(jīng)16 ℃低溫處理后，花色素苷含量顯著升高，花色素苷在3個品種中的含量都呈現(xiàn)升高趨勢(圖4B)。

2.3 低溫處理蘋果屬葉片花色素苷合成相關(guān)基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)測定3個品種葉片中花色素苷合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量，16 ℃低溫處理后花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)都有不同程度的升高(圖5)。在‘嘎啦’中，MdCHI、MdDFR、MdFLS和MdUFGT基因的表達(dá)量上調(diào)10倍以上?！踝濉蠱dF3’H基因的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著；其次MdCHI基因表達(dá)量上升6.7倍，MdMYB10的表達(dá)量上升了4.7倍，MdUFGT表達(dá)量上升了3.3倍。在‘火焰’中MdF3’H、MdFLS、MdCHI、MdUFGT的表達(dá)量顯著升高，其中MdF3’H表達(dá)量上升了142倍，MdFLS表達(dá)量上升了30倍，MdUFGT和MdCHI的表達(dá)量上升14倍，MdDFR和MdANS的表達(dá)量分別上升8.5倍和8.7倍。

2.4 低溫處理蘋果屬葉片MdIDM1基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測3個品種葉片中MdIDM1基因的相對表達(dá)量。MdIDM1基因在3個品種中的表達(dá)量都呈現(xiàn)升高趨勢，均升高2倍左右，與‘王族’品種中花色素苷含量上升趨勢相同(圖6)。

3 討 論

花色素苷是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，是苯丙酸代謝途徑的產(chǎn)物之一?；ㄉ剀帐怪参锍尸F(xiàn)不同顏色，有利于植物繁衍后代，也利于植物抵御非生物脅迫。研究表明蘋果中MdMYB1、MdMYBA、MdMYB10和MdMYB110a等MYB轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合MdCHS、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因的啟動子，調(diào)控其表達(dá)的強(qiáng)弱。蘋果屬植物觀賞海棠中MdMYB10基因能夠響應(yīng)低溫、持續(xù)光照的誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)MdCHS、MdF3H、MdF3’H、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因表達(dá)[5]。低溫條件下，蘋果‘嘎啦’和觀賞海棠‘王族’及‘火焰’3個品種的葉片明顯變紅，通過液相色譜分析，花色素苷含量明顯升高，qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果表明花色素苷生物合成基因表達(dá)明顯升高。

DNA去甲基化是植物體內(nèi)重要的表觀遺傳學(xué)修飾途徑，DNA去甲基化可以釋放基因沉默，其與DNA甲基化動態(tài)變化，增強(qiáng)植物體內(nèi)基因組的可塑性，也使植物在受到低溫脅迫時做出響應(yīng)[26-27]。低溫影響植物的生長和發(fā)育。當(dāng)植物受到低溫脅迫時，促進(jìn)花色素苷的積累來防御低溫對植物造成的傷害[28]。同時植物體內(nèi)甲基化水平降低，大部分基因去甲基化，雖然不是直接調(diào)控低溫脅迫途徑相關(guān)基因，但是間接影響基因的表達(dá)[29-30]。植物為抵御溫度的變化，會通過DNA甲基化和DNA去甲基化的表觀遺傳過程修飾基因表達(dá)，從而促成環(huán)境誘導(dǎo)的表型變異。已有研究表明，低溫春化的小麥[31]和油菜[32]種子中DNA甲基化水平降低，并且會出現(xiàn)永久的DNA去甲基化現(xiàn)象。低溫處理橡膠樹苗，發(fā)現(xiàn)低溫敏感基因HbICE1、HbCBF2和HbMET啟動子低甲基化，并且許多去甲基化位點(diǎn)發(fā)生在低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子識別的順式元件上，通過對基因組分析得到12個DME基因、2個ROS基因和7個DML基因，其中HbROS1受低溫誘導(dǎo)表達(dá)量增高[33]，因此低溫誘導(dǎo)DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄激活，通過DNA去甲基化途徑使冷敏感相關(guān)基因的啟動子甲基化水平降低，提高基因表達(dá)，增加植物對低溫脅迫的耐受性。

筆者克隆獲得蘋果屬植物MdIDM1基因，并通過對蘋果屬3個品種植物進(jìn)行低溫處理，發(fā)現(xiàn)低溫處理能夠促進(jìn)蘋果屬植物花色素苷積累，且DNA去甲基化基因表達(dá)與花色素苷積累和花色素苷生物合成基因表達(dá)趨勢一致，推測低溫脅迫通過誘導(dǎo)MdIDM1基因的表達(dá)，降低花色素苷合成途徑中關(guān)鍵基因啟動子的甲基化水平，從而增加蘋果屬植物葉片和果實(shí)中合成基因的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的積累。MdIDM1基因在蘋果屬花色素苷合成上的作用機(jī)制還需進(jìn)一步借助于基因過表達(dá)或沉默等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的驗(yàn)證。