孔德明，陳 超，周啟動(dòng)，劉則華，郭鵬然*

（1.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006）

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物因可能對(duì)人體健康造成危害成為關(guān)注的焦點(diǎn)［1－2］。根據(jù)產(chǎn)生途徑，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物主要包括天然雌激素、雄激素、植物雌激素、霉菌類(lèi)雌激素，以及各種工業(yè)化學(xué)物質(zhì)［1］，其中外源性攝入的天然雌激素因同樣具有較強(qiáng)的雌激素生物活性而受到重視。牛奶由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富且容易消化吸收而廣泛出現(xiàn)在世界各國(guó)人的食譜中［3－4］，然而牛奶也是人體外源性天然雌激素的重要攝入來(lái)源［5－6］，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，全球每年牛奶的消費(fèi)量將近7×108噸［7］，因此人體通過(guò)牛奶攝入天然雌激素的風(fēng)險(xiǎn)絕對(duì)不容忽視。目前牛奶中天然雌激素的研究通常是針對(duì)4種常見(jiàn)天然雌激素［8］，即雌酮（E1）、17α-雌二醇（17α-E2）、17β-雌二醇（E2）和雌三醇（E3），而其它天然雌激素的研究鮮有報(bào)道［3，5，8－11］。

目前國(guó)內(nèi)外牛奶中雌激素的檢測(cè)方法主要有免疫檢測(cè)法和質(zhì)譜法［1，12］。免疫檢測(cè)法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［6，9］和放射性免疫測(cè)定（RIA）［13］，質(zhì)譜法則主要采用液液萃?。?，14－15］、固相萃?。?0，16－21］、磁性固相萃?。?2－23］和固相微萃取［24－25］等前處理技術(shù)，結(jié)合氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜（GC－MS/MS）［16］和液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜（LC－MS/MS）［21］進(jìn)行檢測(cè)。Malekinejad等［8］利用液液萃取結(jié)合LC－MS/MS測(cè)定牛奶中的天然雌激素，在僅考察4種常見(jiàn)天然雌激素（E1、E2、E3、17α-E2）情況下，評(píng)估出人體通過(guò)牛奶攝入的天然雌激素每人每天平均可達(dá)372 ng，可見(jiàn)牛奶是人體外源性天然雌激素的主要暴露來(lái)源之一。研究還發(fā)現(xiàn)，天然雌激素E1、E2可代謝轉(zhuǎn)化為16α-羥基雌酮（16αOHE1）和16keto雌二醇（16ketoE2），其中16ketoE2的雌激素效應(yīng)與最高的E2相當(dāng)［26－29］。為更全面評(píng)估牛奶的安全性，本研究建立了一種GC－MS同時(shí)測(cè)定牛奶樣品中E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2 6種天然雌激素的方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定，滿(mǎn)足了牛奶中天然雌激素的檢測(cè)和質(zhì)量控制需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890A/5975C氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BSA224S－CW電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；TDL－40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BF－2000F氮吹儀（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；Vortex－2渦旋儀（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）；P100N移液器（法國(guó)Eppendorf公司）；24位型負(fù)壓固相萃取裝置（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；DHG－9075A恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；OASIS HLB Cartridge固相萃取柱（225 mg，美國(guó)Waters公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2（純度均大于98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；內(nèi)標(biāo)：17β-E2-D4（E2-D4，純度大于98%，天津阿爾塔科技有限公司）；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA） + 1% 三甲基氯硅烷（TMCS，Regis Technologies）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，上海安普科技股份有限公司）；乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色譜級(jí)，Sigma公司）；磷酸氫二鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；牛奶（超高溫瞬時(shí)滅菌牛奶，保質(zhì)期內(nèi)）購(gòu)于廣州當(dāng)?shù)氐某?，?20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg的6種雌激素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于?20 ℃保存。

中間標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，于?20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：6種雌激素的質(zhì)量濃度梯度為5、10、20、40、80、100 μg/L；其中均加入50 ng的17β-E2-D4內(nèi)標(biāo)，定容至1 mL。

1.3 樣品前處理

提?。毫咳?0 mL牛奶樣品于50 mL離心管中，加入50 ng內(nèi)標(biāo)，10 mL乙腈萃取振蕩15 min后，加入6 g磷酸氫二鉀粉末，依次渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min后，收集上清液。

富集凈化：將上清液轉(zhuǎn)移至500 mL燒杯中，用水稀釋至500 mL；固相萃取柱經(jīng)過(guò)5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇、10 mL水活化后，將上述稀釋的上清液在流速10 mL/min下通過(guò)固相萃取柱富集；然后依次用5 mL 10%甲醇、5 mL水、5 mL甲醇－水－氨水（10∶88∶2，體積比）清洗凈化；負(fù)壓下抽干固相萃取柱后，依次使用8 mL甲醇－乙酸乙酯（8∶2）和2 mL乙酸乙酯洗脫目標(biāo)物。

衍生化：收集洗脫液，氮吹至干后，加入100 μL DMF復(fù)溶，加入100 μL BSTFA + 1% TMCS衍生化試劑80 ℃下反應(yīng)60 min后［28］，用乙酸乙酯定容至1 mL，待上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

安捷倫HP－5MS色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為100 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，8 ℃/min升至260 ℃，3 ℃/min升至300 ℃，并保持2 min；進(jìn)樣量：3 μL；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；輔助加熱區(qū)：280 ℃；載氣：氦氣（純度 > 99.999%）；恒流模式；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；流速：0.85 mL/min。

離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；檢測(cè)方式：選擇離子模式（SIM）；電離能量：70 eV；其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種天然雌激素的分析參數(shù)Table 1 Analytical parameters of six natural estrogen compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于雌激素類(lèi)物質(zhì)的衍生物極性弱，因此實(shí)驗(yàn)采用固定相為5%苯基－甲基聚硅氧烷的弱極性石英毛細(xì)管柱進(jìn)行分離。采用200 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液考察了色譜條件。在優(yōu)化后色譜條件（見(jiàn)“1.4”）下，目標(biāo)峰與其它干擾峰完全分開(kāi)，滿(mǎn)足定性定量要求。為了提高分析靈敏度，實(shí)驗(yàn)采用選擇離子（SIM）模式，選擇3個(gè)特征離子，其中1個(gè)定量離子，2個(gè)定性離子（見(jiàn)表1）。

2.2 提取溶劑的選擇

根據(jù)6種雌激素在弱極性或中等極性的有機(jī)溶劑中有較高的溶解性，考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和含20%乙酸乙酯的乙腈4種提取溶劑對(duì)6種待測(cè)物的加標(biāo)回收率（見(jiàn)圖1）。結(jié)果顯示，采用甲醇提取時(shí)，加標(biāo)回收率最低；采用乙酸乙酯和含20%乙酸乙酯的乙腈提取時(shí)，乙酸乙酯帶入了更多的非極性脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，提高了基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致整體回收率偏高。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為最佳提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)牛奶中6種雌激素提取效率的影響（n = 3）Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）

2.3 提取溶劑體積的優(yōu)化

以乙腈為提取溶劑，考察了5、10、15、20 mL不同提取溶劑體積對(duì)目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果顯示，選用10 mL提取溶劑時(shí)6種目標(biāo)物均有較好的回收率（圖2）。當(dāng)提取溶劑體積降低為5 mL時(shí)，樣品與提取溶劑的接觸面減少，從而影響兩相傳質(zhì)效果，導(dǎo)致提取效率偏低；當(dāng)提取溶劑增加為15、20 mL時(shí)，由于兩相濃度分配早已達(dá)平衡等原因，提取效率未進(jìn)一步提升?？紤]試劑消耗，選擇提取溶劑的最佳體積為10 mL。

圖2 提取溶劑體積對(duì)牛奶中6種雌激素提取效率的影響（n = 3）Fig.2 Effect of extraction volume on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）

2.4 線(xiàn)性范圍、檢出限與定量下限

采用本方法測(cè)定“1.2”中配制6種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明（表2），6種雌激素在5 ~ 100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.995。采用空白牛奶樣品中添加目標(biāo)物的方法，以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法定量下限（LOQ），方法檢出限和定量下限分別為0.17 ~ 0.51 μg/L和0.56 ~ 1.68 μg/L。

表2 6種天然雌激素的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of six estrogen compounds

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，分別在牛奶樣品中加入低、中、高4個(gè)不同質(zhì)量濃度水平（5、10、20、50 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)，按照“1.3”進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)濃度水平設(shè)置9個(gè)樣品，計(jì)算每個(gè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表3可知，在4個(gè)加標(biāo)水平中，6種目標(biāo)物的回收率為83.1% ~ 119%，RSD為2.1% ~ 15%，表明該方法的準(zhǔn)確性和精密度符合方法學(xué)要求。

表3 6種天然雌激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 9）Table 3 Spiked recoveries and relative deviations of six natural estrogen compounds（n = 9）

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的3款牛奶進(jìn)行測(cè)定（表4）。檢測(cè)結(jié)果顯示，除了E3，其他5種雌激素均能在牛奶中檢出，其中E1的檢出量為0.91 ~0.99 μg/L；16αOHE1的檢出量為0.22 ~ 0.29 μg/L；17α-E2僅在1號(hào)樣中檢出，檢出量為0.20 μg/L；E2檢出量為3.27 ~ 3.33 μg/L；16ketoE2在3個(gè)樣品中均檢出，檢出量為0.38 ~ 2.16 μg/L，陽(yáng)性樣品的檢測(cè)譜圖如圖3所示。

圖3 陽(yáng)性樣品中5種雌激素的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of five estrogens in positive samples

表4 牛奶中6種天然雌激素的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of six natural estrogens in milk ρ/（μg·L?1）

3 結(jié) 論

本研究成功建立了氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定牛奶中6種天然雌激素的方法。該方法具有靈敏度高、精密度好的優(yōu)點(diǎn)，適合用于牛奶及其制品中天然雌激素含量的測(cè)定，可為牛奶質(zhì)量控制提供參考。