崔古貞，管玉祝，劉 芳，王鑫鑫，吳道艷，洪 偉,3，向 松，張崢嶸，張玉典，陳崢宏

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一類定植在人類胃粘膜上皮細胞可引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等多種疾病的主要病原體[1-3]。全球約50%以上人口感染Hp，僅我國感染人數(shù)就達7億之多，是人類最大的潛在危害因素之一，被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌因子[3-5]。深入研究Hp致病機理及其調(diào)控機制，對Hp感染、預防、治療及疫苗研發(fā)等方面具有重要意義。

6SRNA是一類與RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)全酶特異性結(jié)合干擾靶基因轉(zhuǎn)錄的非編碼小調(diào)控RNA[6-7]。6SRNA由一個帶有中間環(huán)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)組成，與解鏈的DNA啟動子結(jié)構(gòu)相似，可與解鏈的DNA啟動子競爭結(jié)合RNAP，從而抑制靶基因表達。因此，6SRNA作為一類抗轉(zhuǎn)錄因子(Anti-Transcription Factor)調(diào)控RNAP活性[8-10](圖1)。

A：幽門螺桿菌6S RNA(Hp-6S RNA)二級結(jié)構(gòu)示意圖；B：解鏈啟動子結(jié)構(gòu)示意圖；C：6S RNA調(diào)控模型圖1 6S RNA結(jié)構(gòu)及調(diào)控模型Fig.1 6S RNA structure and regulation model

近來，利用差異RNA測序發(fā)現(xiàn)Hp也編碼一類特殊的6SRNA(我們稱之為Hp-6SRNA)，能以自身RNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩類不同的小產(chǎn)物RNA(pRNA)，可能具有調(diào)節(jié)自身活性的功能[11]。此外，由于Hp缺乏多種常規(guī)操縱子，沒有RNA分子伴侶(Hfq)輔助RNA加工和成熟，僅有3種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(σ80、σ54和σ28)，編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子極其有限[12-13]。因此，我們推測Hp-6SRNA可能具有調(diào)控多種細胞表型的重要功能。

為了研究Hp-6SRNA的生物學功能及其對Hp毒力的影響，本文構(gòu)建了Hp-6SRNA敲除載體，并利用同源重組技術(shù)敲除了Hp-6SRNA基因，成功獲得了HpΔ6SRNA工程菌株，并檢測了Hp-6SRNA敲除對幽門螺桿菌生長及細胞毒力的影響，為Hp-6SRNA生物學功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 大腸桿菌E.coliDH5ɑ菌株在LB液體培養(yǎng)基(1%氯化鈉，1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母抽提物)中置于180 r/min、37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)。菌落篩選時利用LB固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基中補充1.5%瓊脂)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，必要時補充終濃度50 μg/mL的卡那霉素。

幽門螺桿菌(ATCC_700392)利用BHI液體培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于10% CO2、120 r/min、37 ℃微需氧條件下振蕩培養(yǎng)。菌落篩選時利用含10%脫脂棉羊血的BHI固體培養(yǎng)基(1.5%瓊脂)于10% CO2、37 ℃微氧條件下培養(yǎng)，必要時補充終濃度25 μg/mL的卡那霉素。

1.1.2 主要試劑及儀器

1.1.2.1 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶購自賽默飛世爾科技(中國)，細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，抗生素、胰蛋白胨、酵母抽提物等常規(guī)生化耗材購自索萊寶科技有限公司，引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.1.2.2 主要儀器 隔水式培養(yǎng)箱(武漢精華，303A13-4型)，全溫振蕩器(朗越儀器，RH-Q型)，光學顯微鏡(重慶奧特光學儀器，SMART系列)，基因?qū)雰x(東芝-SCIENTZ)，PCR儀、離心機(賽默飛世爾科技有限公司)，電泳儀(北京六一，DYY-7C型)，凝膠成像分析系統(tǒng)系統(tǒng)(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heal Force，HF151型)，實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.1.3 引物 本研究所用引物詳見表1。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 首先，以Hp26695基因組DNA為模板，以6S-QU1/6S-QD1為引物，PCR擴增6SRNA基因上游同源臂(Up)，利用EcoRI與PstI酶切后與經(jīng)同源酶切的pSD質(zhì)粒連接，構(gòu)建上游同源臂載體pSD-6S-U；然后，以Hp26695基因組DNA為模板，以6S-QU2/6S-QD2為引物，PCR擴增6SRNA基因下游同源臂(Down)，利用BamH I與ClaI酶切后與經(jīng)同源酶切的pSD-6S-U質(zhì)粒連接，構(gòu)建6SRNA基因敲除載體pSD-6S(圖2A)。將6SRNA基因與CatP基因鏈接后經(jīng)XbaI和BglII雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pSD-LctP質(zhì)粒鏈接構(gòu)建回補質(zhì)粒pGZ-6SRNA。PCR擴增條件：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；終延伸72 ℃ 2 min。

1.3 感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化子篩選 感受態(tài)細胞制備：首先，接種Hp26695菌種至BHI 血瓊脂平板，置于37 ℃微需氧(10% CO2、5% O2、85% N2)條件下培養(yǎng)1～2 d；然后，用接種環(huán)刮取Hp菌體至預冷的感受態(tài)制備緩沖液(15%甘油，9%蔗糖)，菌懸液濃度稀釋至1×108～1×109CFU/mL，然后利用預冷的感受態(tài)制備緩沖液離心(4 ℃，5 000 r/min，5 min)洗滌3次；最后，將菌懸液以50 μL/管進行分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選：首先，取-80 ℃凍存的感受態(tài)細胞于冰上解凍，加入0.5～2 μg質(zhì)?；靹蚝笾糜诒?～5 min，吸取混合液至預冷的0.2 mm的電擊杯中，冰上繼續(xù)放置1 min；然后，利用電轉(zhuǎn)化方法進行基因轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)條件設(shè)置為2.5 kV、50 Ω、1 F，電轉(zhuǎn)后立即向電擊杯中加入100 μL胎牛血清，混勻后吸出接種至BHI血瓊脂平板，于37 ℃、微需氧條件培養(yǎng)24 h，收集菌體于0.85%生理鹽水中，混勻接種于含卡那霉素的BHI血平板，37 ℃、微需氧繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d；最后，挑取卡那霉素抗性平板上生長的菌落，液體培養(yǎng)后提取基因組DNA，利用引物Kan-1/Kan-2、6S-QD1/6S-QU2進行PCR鑒定，同時以野生型Hp26695基因組DNA做對照，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測6SRNA基因敲除情況。

A：6S RNA敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；B：6S RNA敲除菌株篩選示意圖圖2 幽門螺桿菌6S RNA敲除質(zhì)粒構(gòu)建及敲除菌株篩選示意圖Fig.2 Construction of the 6S RNA knockout plasmid for H. pylori and screening of the knockout strain

1.4 RNA制備及qRT-PCR 根據(jù)總RNA制備試劑盒(RNAprep Pure，天根生化科技有限公司)操作說明提取野生菌株及工程菌株的總RNA，利用HiFiScript cDNA試劑盒(北京康為世紀，CW2569M)制備cDNA，最后，根據(jù)UltraSYBR mixture試劑盒操作說明進行qRT-PCR擴增。

1.5 掃描電鏡觀察 將-80 ℃保存的幽門螺桿菌接種至BHI固體培養(yǎng)基，挑取單菌落與BHI液體培養(yǎng)基中置于37 ℃、微需氧條件下培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，1×PBS緩沖液洗滌2～3次，加2.5%固定液固定過夜，電鏡觀察幽門螺桿菌細胞表面形態(tài)的變化。

1.6 生長曲線 首先，將-80 ℃保存的幽門螺桿菌接種于BHI血瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃、10% CO2微需氧條件下培養(yǎng)2～3 d，挑選固體培養(yǎng)基上透明針尖樣菌落接種至新鮮的BHI血瓊脂固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后；然后，用接種環(huán)取適量細菌至0.85%無菌生理鹽水中，制備麥氏2.0的菌懸液，按1∶100比例接種至含10%胎牛血清的BHI液體培養(yǎng)基(pH7.5)中，于37 ℃、120 r/min、微需氧條件下振蕩培養(yǎng)，繪制不同菌株的生長曲線。

1.7 幽門螺桿菌胞內(nèi)提取物制備 分別取100 mL培養(yǎng) 24 h、36 h、48 h和60 h的細菌培養(yǎng)液于4 ℃、5 000 r/min條件下離心收集菌體，加入10 mL RPMI 1640培養(yǎng)液混勻后置冰上超聲破碎(10 s/10 s，30 min)，離心后收集上清并用 0.22 μm 濾膜過濾，利用BCA法測定蛋白濃度。

1.8 細胞培養(yǎng)及細胞毒性分析 取100 L GES-1胃粘膜上皮細胞懸液(5103)加入96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別取10 L幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液及胞內(nèi)提取物(蛋白濃度為2.5 mg/mL)加入細胞培養(yǎng)孔中，充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在每孔內(nèi)加入10 L的CCK-8試劑(日本DOJINDO 公司)，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

2 結(jié) 果

2.1Hp-6SRNA轉(zhuǎn)錄分析 取培養(yǎng)至對數(shù)期的幽門螺桿菌分別接種至BHI培養(yǎng)基中于37 ℃、150 r/min、微需氧(10% CO2，5% O2，85% N2)條件下培養(yǎng)，提取總RNA，利用qRT-PCR分析Hp-6SRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果如圖3所示，Hp-6SRNA在對數(shù)期轉(zhuǎn)錄最豐富，隨細胞生長其轉(zhuǎn)錄強度逐漸降低，至生長末期幾乎不轉(zhuǎn)錄，表明Hp-6SRNA可能在生長前期對幽門螺桿菌起主要調(diào)控作用。

圖3 6S RNA在不同生長階段轉(zhuǎn)錄分析Fig.3 Transcriptional analysis of 6S RNA at different growth stages

2.2Hp-6SRNA敲除菌株及回補菌株構(gòu)建 以pSD自殺質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將6SRNA上下游同源臂構(gòu)建到卡那霉素抗性基因兩側(cè)，構(gòu)建6SRNA基因敲除質(zhì)粒pSD-6S(質(zhì)粒構(gòu)建流程詳見圖2)，利用PCR檢測敲除質(zhì)粒，如圖4A所示，測序證實質(zhì)粒構(gòu)建成功。然后，將敲除質(zhì)粒pSD-6S利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化Hp26695，涂布卡那霉素抗性平板，篩選陽性菌株，利用PCR進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳分析條帶大小與預期一致(圖4B)，表明Hp-6SRNA敲除菌株構(gòu)建成功，工程菌株命名為：HpΔ6SRNA。利用同樣方法將回補質(zhì)粒pGZ-6S RNA轉(zhuǎn)化到HpΔ6SRNA中，構(gòu)建回補菌株HpΔ6SRNA::6SRNA，氯霉素抗性篩選及PCR檢測與預期結(jié)果一致(圖4C)，表明回補菌株構(gòu)建成功。

A：6S RNA敲除載體PCR檢測，泳道1：引物6S-QU1和6S-QD1；泳道2：引物6S-QU2和6S-QD2。B：6S RNA敲除菌株(HpΔ6S RNA)PCR檢測,引物6S-QD1和6S-QU2，泳道1：野生型對照；泳道2：HpΔ6S RNA。C：6S RNA回補菌株(HpΔ6S RNA::6S RNA)PCR檢測，泳道1：引物pGZ-1和pGZ-2，HpΔ6S RNA::6S RNA；泳道2：引物pGZ-6sTY1和pGZ-6sTY2，HpΔ6S RNA::6S RNA；泳道3：引物pGZ-1和pGZ-2，野生型對照；泳道4：引物pGZ-6sTY1和pGZ-6sTY2，野生型對照；泳道5-6：空白對照。圖4 6S RNA敲除菌株及回補菌株P(guān)CR檢測Fig.4 PCR detection of the Hp-6S RNA knockout vector and strain

2.3Hp-6SRNA敲除對幽門螺桿菌生長的影響 如圖5所示，6SRNA敲除后細菌生長方式顯著改變，細菌生長遲緩期延長，表明6SRNA可能在幽門螺桿菌生長初期起重要的調(diào)控作用。然而，6SRNA基因回補之后，回補菌株的生長方式與敲除菌株類似，并沒有恢復到野生型(圖5)。

圖5 幽門螺桿菌生長曲線Fig.5 Growth curve of H. pylori

2.4Hp-6SRNA敲除影響了幽門螺桿菌上游基因表達 為了檢測6SRNA敲除對幽門螺桿菌上下游基因表達的影響，我們提取細菌總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR進行檢測。如圖6所示，6SRNA敲除后對下游基因Hp1217和Hp1218表達水平影響較小，但顯著增強了其上游基因Hp1220和Hp1221的表達。盡管6SRNA基因回補能夠恢復Hp1220和Hp1221的表達，但Hp1220基因的表達仍顯著增強(圖6)。上述結(jié)果表明6SRNA基因敲除影響其上游基因的表達，可能與上游基因存在一定的連鎖關(guān)系。

A：6S RNA基因所在位置示意圖。Hp1218編碼甘氨酰胺核苷酸合成酶基因purD，Hp1220編碼ABC家族轉(zhuǎn)運酶基因yhcG；B：6S RNA上下游基因相對轉(zhuǎn)錄水平圖6 6S RNA敲除對上下游基因水平表達的影響Fig.6 Effects of 6S RNA knockout on the expression of upstream and downstream genes

2.5Hp-6SRNA敲除對細菌形態(tài)的影響 為了檢測6SRNA敲除對細菌形態(tài)的影響，我們?nèi)?shù)生長期的幽門螺桿菌進行了掃描電鏡觀察(圖7)。電鏡觀察結(jié)果表明，野生菌株與敲除菌株其細菌形態(tài)均呈現(xiàn)彎曲桿狀，未見顯著變化。盡管電鏡下發(fā)現(xiàn)部分菌體出現(xiàn)球變現(xiàn)象，但球變是多數(shù)幽門螺桿菌培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)的正?，F(xiàn)象，且野生株與突變株均存在球變現(xiàn)象?？傊瑨呙桦婄R結(jié)果表明6SRNA敲除對細菌表面形態(tài)無顯著影響。

A：6S RNA野生型；B：6S RNA敲除菌株圖7 掃描電鏡觀察幽門螺桿菌Fig.7 Scanning electron microscopy for H.pylori

2.6Hp-6SRNA敲除降低了幽門螺桿菌對GES-1細胞的毒性 為了分析6SRNA敲除對幽門螺桿菌毒力的影響，我們利用CCK8實驗比較分析了野生菌株與6SRNA敲除菌株的培養(yǎng)上清液及細胞內(nèi)容物對GES-1胃粘膜上皮細胞毒性的影響。如圖8所示，6SRNA敲除后，細菌培養(yǎng)上清液對GES-1細胞的毒性降低(OD450的吸光度增加)，盡管在培養(yǎng)36 h時上清液毒性變化不顯著，但在整個細菌生長周期敲除菌株的毒性均有所下降(圖8A)。此外，6SRNA敲除后，細胞內(nèi)容物的毒性也顯著降低，尤其是在細菌生長中后期(48 h和60 h)，其細胞毒性降低更為顯著(圖8B)。從圖3可知，6SRNA在細菌生長中后期顯著下降，預示6SRNA不僅對細菌生長周期具有調(diào)控功能，而且可能負調(diào)控細菌毒力相關(guān)基因的表達。

另外，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生菌株還是突變菌株，利用培養(yǎng)上清液處理組的OD450吸光度顯著低于細胞內(nèi)容物處理組，表明幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液對GES-1細胞的毒性顯著高于細胞內(nèi)容物的毒性，進一步說明幽門螺桿菌可能合成大量的胞外毒力因子輔助細菌的定植和其他生理功能?？傊?，6SRNA敲除降低了幽門螺桿菌對GES-1胃粘膜上皮細胞的毒性，表明6SRNA在調(diào)控細菌毒力因子方面具有重要功能。

A：幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液對GES-1細胞毒性的影響；B：幽門螺桿菌細胞內(nèi)容物對GES-1細胞毒性的影響圖8 6S RNA敲除對GES-1細胞毒性的影響Fig.8 Effect of 6S RNA knockout on the cytotoxicity of GES-1

3 討 論

6SRNA作為一種非編碼小調(diào)控RNA在多個物種中具有重要的調(diào)控功能。本文敲除6SRNA后，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌生長遲緩期顯著延長，表明6SRNA參與幽門螺桿菌生長調(diào)控的變化，并影響幽門螺桿菌培養(yǎng)上清液和細胞內(nèi)容物對GSE-1胃粘膜上皮細胞的毒力，表明6SRNA具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，能夠調(diào)控幽門螺桿菌毒力相關(guān)的因子。然而，幽門螺桿菌編碼多種細胞毒力因子，例如尿素酶、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、CagA、VacA等數(shù)十種，6SRNA具體調(diào)控哪種或哪些細胞毒力因子，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控機制及生物學功能是什么，6SRNA是如何調(diào)控眾多的毒力因子影響其生長繁殖及在胃粘膜的定植，諸如上述問題的解決仍需大量實驗深入分析和研究。

此外，大量研究表明，6SRNA可對多種信號做出反應(yīng)。例如，在大腸桿菌中，當細菌從指數(shù)期向穩(wěn)定期過渡或營養(yǎng)匱乏時，6SRNA大量積累，抑制σ70-RNAP活性，激活σ38-RNAP依賴的靶基因表達[14-15]；6SRNA還受胞內(nèi)嘌呤核苷酸濃度、ppGpp信號、anti-σ因子等多個信號的調(diào)控，從而對噬菌感染、饑餓、酸堿度、氧脅迫等做出反應(yīng)，調(diào)控生物膜形成、細胞生長、芽胞形成及多種細胞代謝[16]。幽門螺桿菌定植在胃內(nèi)極復雜的環(huán)境中，受飲食、pH等多種因素的影響，上述因素是否可以通過調(diào)控Hp-6SRNA的轉(zhuǎn)錄而調(diào)控幽門螺桿菌的定植和毒力。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，當6SRNA基因敲除后，其上游基因(Hp1220，Hp1221)的表達受到一定的影響(圖6)，這種影響是6SRNA基因的直接影響還是6SRNA基因通過調(diào)控其他基因間接影響上游基因的表達，仍需要進一步驗證。因此，在后續(xù)工作中，我們需從生理生化、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、細胞功能以及動物模型等多方面進一步深入分析6SRNA的生物學功能及調(diào)控機制。總之，本研究為幽門螺桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究提供了新思路，為幽門螺桿菌致病機理研究提供了新視野。

利益沖突：無