龐 鍵，吳 陵，程 正，鄭如程

（1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 銅陵 244000；2.銅陵市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244000）

高職院?！斗治龌瘜W(xué)》（人民衛(wèi)生出版社）[1]教材中薄層色譜法的實(shí)驗(yàn)是對(duì)磺胺類藥物進(jìn)行分離及鑒定。 因?qū)嶒?yàn)過程中需使用到三氯甲烷和丙酮等有毒化學(xué)品， 具有較高的安全風(fēng)險(xiǎn)， 且實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣， 導(dǎo)致最終實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)效果不理想。 所以自行設(shè)計(jì)一個(gè)便捷高效， 效果明顯的薄層色譜法實(shí)驗(yàn)非常有必要。

板藍(lán)根（Radix Isatidis）為臨床上常用的傳統(tǒng)中藥，為十字花科植物菘藍(lán)（Isatisindigotica Fort）的干燥根， 具有清熱解毒、 涼血消腫利咽、 抗鉤端螺旋體、抗菌、抗炎和增強(qiáng)免疫力等作用。 板藍(lán)根中化學(xué)成分主要含有靛玉紅、靛藍(lán)、蒽醌類、β-谷甾醇、γ-谷甾醇及多種氨基酸等， 其中靛玉紅、 靛藍(lán)為其主要的有效、 有色成分。 靛玉紅為雙吲哚類抗腫瘤藥物，對(duì)宮頸癌、肝癌、淋巴瘤、肝門膽管癌及早幼粒白血病均具有顯著的抑制作用[2]。 靛藍(lán)具有抗菌抗氧化的作用，主要用于溫病熱盛，斑疹，咯血，咽痛口瘡，小兒驚癇，瘡腫，丹毒，蛇蟲咬傷等。 研究表明，靛藍(lán)和靛玉紅是同分異構(gòu)體， 兩者既是外源性又是內(nèi)源性的芳烴受體(AHR)配體，AHR 廣泛表達(dá)于腸道免疫和非免疫細(xì)胞，在炎癥、免疫、組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3]。

薄層色譜法是一種將固定相均勻涂鋪在光潔表面的玻璃、金屬板等上面形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的平面色譜方法。 其具有設(shè)備簡(jiǎn)單、 速度快、分離效果好、靈敏度高、直觀、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，且可同時(shí)分離多個(gè)樣品，是一種微量的分離分析方法。薄層色譜鑒別作為中藥尤其是中成藥鑒別的首選方法。 在 2020 年版《中國(guó)藥典(一部)》[4]的應(yīng)用研究較多， 在非法添加化學(xué)藥品的篩查方面也有著不可或缺的地位。 近年來，隨著新材料、新技術(shù)的應(yīng)用，薄層色譜技術(shù)已由傳統(tǒng)的普通薄層色譜發(fā)展到高效薄層色譜（HPTLC）、微乳薄層色譜（METLC）[5-7]、膠束薄層色譜（MTLC），并逐步向聯(lián)用檢測(cè)方向發(fā)展如薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等有效的定性分析手段，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。隨著新技術(shù)的應(yīng)用，中藥薄層色譜鑒別方法指向的鑒別成分也將更加明確， 質(zhì)量控制模式更加綠色環(huán)保[8]。

本實(shí)驗(yàn)以板藍(lán)根為研究對(duì)象， 以薄層色譜法對(duì)板藍(lán)根中的靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行分離和鑒定。 通過本實(shí)驗(yàn)確定最佳分離條件，使之具有簡(jiǎn)便高效、安全低毒等特點(diǎn)， 為高職院校學(xué)生實(shí)驗(yàn)教材的編寫提供了參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XSE205 型電子天平 (瑞士梅特勒- 托利多集團(tuán)，0.1mg/0.01mg)，Linomat5 型半自動(dòng)點(diǎn)樣儀 (瑞士卡瑪)，Goodlook-2000 薄層成像儀 (上?？普?，H 型薄層層析板 （煙臺(tái)德信生物科技有限公司,10*10cm），H 型薄層層析板 （德國(guó)默克，10*10cm），KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），IKA A11 研磨粉碎機(jī)。

1.2 試藥

板藍(lán)根 (安徽宏坤藥業(yè)有限公司， 批號(hào)為210201)，靛藍(lán)對(duì)照品(上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)為 2252186，含量為98.8%)，靛玉紅對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110717-202106，含量為99.1%)，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水由Milli-Q 系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

溶液配制→點(diǎn)樣→展開顯色→斑點(diǎn)定位→定性鑒別。 《中國(guó)藥典(四部)》（2020 年版）[9]中，以比移值Rf作為薄層色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的考察指標(biāo)，通過計(jì)算比移值Rf(原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離的比值) 并比較供試品與對(duì)照品的Rf值，從而進(jìn)行定性鑒別。比移值Rf應(yīng)在0-1 之間，可用范圍是0.2-0.8，最佳范圍是0.3-0.5。

2.2 溶液制備

供試品溶液：稱取板藍(lán)根10g，粉碎，加乙酸乙酯40mL，超聲處理(功率 250W，50kHz)30min，靜置，取上清液，水浴蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL，微熱使溶解，放冷。

對(duì)照品溶液： 分別稱取靛玉紅對(duì)照品和靛藍(lán)對(duì)照品適量，加乙酸乙酯溶解，稀釋成每1mL 分別含靛玉紅和靛藍(lán)各0.2mg 的溶液，即得。

2.3 展開劑條件優(yōu)化

《中國(guó)藥典(四部)》（2020 年版）[9]中明確說明：展開劑的選擇是薄層分離結(jié)果優(yōu)劣的重要條件之一。 展開劑選擇和優(yōu)化主要考慮溶劑的極性和溶劑的選擇性兩個(gè)方面， 以達(dá)到比移值Rf在0.2-0.8 范圍內(nèi)的要求，并達(dá)到最佳分離效果。展開劑均需預(yù)飽和20min，同時(shí)盡可能選擇較小容積的層析缸，缸口需磨砂蓋面密封，置陰涼處，避免產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)依據(jù)展開劑的極性大小，分別采用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1)、石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)為展開劑，在相似的溫度與濕度條件下，分別進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為10μL，點(diǎn)樣順序?yàn)楣┰嚻啡芤?、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對(duì)照品溶液和靛藍(lán)對(duì)照品溶液，結(jié)果見圖1-4。

圖1 (展開劑：石油醚（60-90℃）)

圖2 (展開劑：乙酸乙酯)

圖3 (展開劑：丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1))

圖4 (展開劑：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05))

由色譜圖可知；采用石油醚（60-90℃）為展開劑時(shí)，供試品溶液和對(duì)照品溶液均無斑點(diǎn)；采用乙酸乙酯為展開劑時(shí)， 供試品溶液中靛玉紅和靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf偏高，靛玉紅對(duì)照品有拖尾現(xiàn)象；采用丙酮-無水乙醇-鹽酸(10:6:1)為展開劑時(shí)，靛藍(lán)對(duì)照品溶液特征斑點(diǎn)不清晰，且在靛玉紅特征斑點(diǎn)處有干擾，靛玉紅對(duì)照品有拖尾現(xiàn)象， 靛玉紅和靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf偏高；采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(15:6:0.05)為展開劑時(shí)，供試品溶液中靛藍(lán)和靛玉紅特征斑點(diǎn)均有拖尾現(xiàn)象， 靛藍(lán)對(duì)照品溶液的特征斑點(diǎn)較清晰；故在展開劑的選擇上仍需進(jìn)一步優(yōu)化。采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)為展開劑時(shí)， 供試品及靛藍(lán)對(duì)照品溶液中靛藍(lán)和靛玉紅特征斑點(diǎn)清晰，靛玉紅對(duì)照品拖尾現(xiàn)象不明顯，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf在0.5-0.58 之間， 靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf在0.72-0.75 之間，結(jié)果見圖5，故展開劑采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2)時(shí)分離效果最佳。

圖5 (展開劑：石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(20:50:0.2))

2.4 點(diǎn)樣量條件優(yōu)化

點(diǎn)樣是薄層色譜分析的重要環(huán)節(jié)，尤其是在定性鑒別中，點(diǎn)樣量的大小對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有直接影響。點(diǎn)樣量太小，不能檢出清晰的斑點(diǎn)影響判斷；點(diǎn)樣量太多，展開劑不能全部負(fù)載，容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。 本實(shí)驗(yàn)以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點(diǎn)樣量分別為 20μL、10μL、5μL，在相似的溫度與濕度條件下，分別進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)，考察點(diǎn)樣量對(duì)色譜結(jié)果的影響， 點(diǎn)樣順序?yàn)楣┰嚻啡芤?、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對(duì)照品溶液和靛藍(lán)對(duì)照品溶液，結(jié)果見圖6-8。

圖6 （點(diǎn)樣量 20μL）

圖7 （點(diǎn)樣量 10μL）

圖8 （點(diǎn)樣量 5μL）

由色譜圖可知：點(diǎn)樣量為20μL 時(shí)，供試品溶液及靛玉紅對(duì)照品溶液特征斑點(diǎn)均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；點(diǎn)樣量為10μL 時(shí)，靛玉紅對(duì)照品溶液出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，比移值 Rf值在 0.5-0.7 之間； 點(diǎn)樣量為 5μL 時(shí)，特征斑點(diǎn)不夠清晰，且同樣存在拖尾現(xiàn)象。故選擇點(diǎn)樣量為 10μL 較為合理。

2.5 溫濕度條件優(yōu)化

在薄層色譜鑒定過程中， 溫度和濕度是影響薄層色譜鑒定效果的重要因素。 在其他條件相同的情況下， 實(shí)驗(yàn)環(huán)境的相對(duì)濕度對(duì)薄層板的活性有直接影響，對(duì)色譜質(zhì)量影響明顯。 薄層板常常需在105-110℃活化，使水合硅醇基變?yōu)橛坞x硅醇基[10]。 大多數(shù)成分對(duì)相對(duì)濕度有較寬適應(yīng)性， 但有部分樣品在不同濕度環(huán)境中，分離效果有較明顯變化[11]；當(dāng)溫度較高時(shí)，薄層色譜的特征斑點(diǎn)的Rf值較高，檢查準(zhǔn)確性降低。因在展開的過程中，較高的溫度也會(huì)造成展開劑中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)加速， 導(dǎo)致展開缸中的多元溶劑蒸氣比例發(fā)生轉(zhuǎn)變，造成展開效果出現(xiàn)差異。以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點(diǎn)樣量分別在不同的溫濕度條件下進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)，考察溫濕度對(duì)色譜結(jié)果的影響，點(diǎn)樣順序?yàn)楣┰嚻啡芤?、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對(duì)照品溶液和靛藍(lán)對(duì)照品溶液，結(jié)果見圖9-13。

圖9 (溫度 4℃，濕度 40%)

圖10 (溫度 15℃，濕度 60%)

圖11 (溫度 22℃，濕度45%)

圖12 (溫度 20℃，濕度40%)

圖13 (溫度 20℃，濕度45%)

由色譜圖可知： 在溫度4℃， 濕度40%條件下時(shí)，各特征斑點(diǎn)Rf值均較好，但靛藍(lán)對(duì)照品溶液特征斑點(diǎn)不夠明顯， 且存在干擾和拖尾現(xiàn)象； 在溫度15℃，濕度60%條件下時(shí)，各特征斑點(diǎn)清晰，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值小于0.7， 靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf值稍高；溫度22℃，濕度45%時(shí)，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值大于0.65，靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf值大于0.8，溫濕度條件仍需進(jìn)一步優(yōu)化。當(dāng)溫度20℃，濕度40%時(shí)，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值小于 0.6，靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf值小于0.8；當(dāng)溫度20℃，濕度45%時(shí)，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值小于0.6，靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf值接近0.72。 可見溫度偏高對(duì)比移值Rf或有影響， 溫度偏低對(duì)分離效果或有影響；而從圖9、圖11、圖12 中的比移值 Rf表征，有效成分對(duì)相對(duì)濕度有較寬適應(yīng)性。 故選擇溫度在溫度15-20℃，濕度40%-60%較為合理。

2.6 薄層層析板的選擇

由于不同組分在不同薄層層析板上的吸附和解吸能力不同，因此它們?cè)谝苿?dòng)過程中會(huì)出現(xiàn)不同程度的分配過程，從而實(shí)現(xiàn)分離。 而不同品牌的薄層層析板因所用硅膠的粒度和粘合度不同，薄層色譜行為和分離效果也會(huì)存在一定的差異。本實(shí)驗(yàn)分別采用煙臺(tái)H 型和德國(guó)默克H 型薄層層析板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 以石油醚 (60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點(diǎn)樣量為 10μL，溫度 15℃，濕度60%，點(diǎn)樣順序?yàn)楣┰嚻啡芤?、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對(duì)照品溶液和靛藍(lán)對(duì)照品溶液，結(jié)果見圖14-15。

圖14 (煙臺(tái)H 型薄層板)

圖15 (德國(guó)默克H 型薄層板)

由色譜圖可知，采用煙臺(tái)H 型薄層板時(shí)，靛藍(lán)特征斑點(diǎn)較為模糊， 靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值偏高；采用德國(guó)默克H 型薄層板時(shí)，各特征斑點(diǎn)清晰，靛玉紅特征斑點(diǎn)Rf值小于0.6，靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf值約為0.7。 故以使用德國(guó)默克H 型薄層板為宜。

2.7 最終優(yōu)化色譜條件

綜上所述，當(dāng)溫度為15-20℃，濕度40-60%時(shí)，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-三乙胺(25:50:0.2)為展開劑，點(diǎn)樣量10μL，采用德國(guó)默克H 型薄層板，點(diǎn)樣順序?yàn)楣┰嚻啡芤?、供試品溶液、供試品溶液、靛玉紅對(duì)照品溶液和靛藍(lán)對(duì)照品溶液， 進(jìn)行薄層色譜實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果見圖16。 供試品溶液與對(duì)照品溶液各特征斑點(diǎn)清晰、無拖尾現(xiàn)象，Rf值均在在0.5-0.7 范圍內(nèi)，具有較好的分析效果。

圖16

2.8 結(jié)果

綜上所述，所采用的實(shí)驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，簡(jiǎn)便高效，安全低毒。 板藍(lán)根中的靛玉紅和靛藍(lán)的薄層色譜具有鑒別特征， 用于板藍(lán)根中的靛玉紅和靛藍(lán)的定性鑒別是切實(shí)可行的。 本項(xiàng)研究也為高職院校學(xué)生實(shí)驗(yàn)教材的編寫提供參考數(shù)據(jù)和扎實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

待分離鑒定成分在提取溶劑中的溶解度大小會(huì)對(duì)薄層色譜結(jié)果造成一定影響。溶解度過大，點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)會(huì)變成空心圓，影響隨后的線性展開；溶解度過小，濃度過低，展開后薄層色譜圖不夠清晰。 所以原則上應(yīng)選擇對(duì)待分離鑒定成分可以溶解但溶解度適中的溶劑。石油醚作為極性較小的有機(jī)溶劑，若選擇石油醚(30-60℃)，則易揮發(fā)，損失較大；靛玉紅溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇；靛藍(lán)微溶于水、乙醇、甘油、乙酸乙酯和丙二醇，不溶于油脂[4]；少量三乙胺通過實(shí)驗(yàn)表征起著防拖尾的作用。 故在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)板藍(lán)根中的靛玉紅和靛藍(lán)進(jìn)行提取時(shí)，選擇石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺組合的多元展開劑作為提取溶劑。

3.2 點(diǎn)樣方式與方法的選擇

薄層色譜分析中的點(diǎn)樣方式分為手動(dòng)點(diǎn)樣和自動(dòng)點(diǎn)樣。手動(dòng)點(diǎn)樣主要器具為微量毛細(xì)管、微量注射器等，點(diǎn)樣方法為接觸式點(diǎn)樣。自動(dòng)點(diǎn)樣采用半自動(dòng)或全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，按預(yù)設(shè)程序自動(dòng)點(diǎn)樣，點(diǎn)樣方法以噴霧點(diǎn)樣較為多見。手動(dòng)點(diǎn)樣靈活方便，常用于各種薄層色譜鑒別中，點(diǎn)樣器具以微量毛細(xì)管為主；儀器的自動(dòng)點(diǎn)樣準(zhǔn)確性高， 常用于薄層掃描法的含量測(cè)定。 因本實(shí)驗(yàn)是對(duì)板藍(lán)根中的靛玉紅和靛藍(lán)進(jìn)行定性鑒別， 且考慮到在日常的高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)中采用全自動(dòng)或半自動(dòng)點(diǎn)樣儀會(huì)降低實(shí)驗(yàn)效率， 難以對(duì)學(xué)生的動(dòng)手能力進(jìn)行考查等因素， 故本實(shí)驗(yàn)大多采用了接觸式的手動(dòng)點(diǎn)樣方法， 同時(shí)考慮到提取溶劑的揮發(fā)性，一般采用洗耳球輕吹，反復(fù)手動(dòng)點(diǎn)樣。

3.3 薄層板的選擇

本實(shí)驗(yàn)中分別采用了煙臺(tái)H 型薄層板和德國(guó)默克H 型薄層板對(duì)靛玉紅和靛藍(lán)進(jìn)行分離鑒定。 實(shí)際完成的薄層色譜圖中，煙臺(tái)H 型薄層板上靛藍(lán)特征斑點(diǎn)Rf較大， 且靛玉紅特征斑點(diǎn)存在一定的拖尾， 但靛藍(lán)與靛玉紅已實(shí)現(xiàn)完全分離。 考慮到德國(guó)默克H 型薄層板成本較高，故在日常的高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)中也可使用煙臺(tái)H 型薄層板。

3.4 與磺胺類藥物的薄層色譜分離及鑒定實(shí)驗(yàn)的比較

在高職院?！斗治龌瘜W(xué)》（人民衛(wèi)生出版社）教材《磺胺類藥物的薄層色譜分離及鑒定》 的實(shí)驗(yàn)中，使用了丙酮作為磺胺類特征成分的提取溶劑， 在展開劑中使用了三氯甲烷作為展開溶劑。 根據(jù) 《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》 和 《易制毒化學(xué)品管理?xiàng)l例》，丙酮和三氯甲烷分別屬于易制毒第三類和第二類化學(xué)品，受公安部門管制，且三氯甲烷已被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入2B 類致癌物清單[12]。 兩者的存放場(chǎng)所必須安全可靠， 且有專人保管。 故在日常的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中， 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照操作程序和要求進(jìn)行操作， 對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑的使用保管以及學(xué)生的管理提出較高的要求。 本實(shí)驗(yàn)過程中使用的溶劑為石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯和三乙胺，均不屬于易制毒化學(xué)品，且毒性較低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程更加安全環(huán)保。